资源生物学与生物制造：植物甾醇—分枝杆菌及4AD

                                         （一）

                            杨顺楷    四川  成都

1. 甾体生物制造的新形势

雄烯二酮（4AD）是已知的前体激素，是甾体药物的关键前体分子。当今，它是由选育出的分枝杆菌属细菌突变株，能选择性地降解植物源性天然产物大豆植物甾醇（主要组分是b-谷甾醇）分子C₁₇-烷基侧链，保留甾体化合物母核进行生产，全球产量达到千吨级水平。可见，4AD朔源于植物甾醇（b-谷甾醇），其它如甾体药物化学发展史上第一代半合成原料牛脱氧胆酸→可的松（26步），第二代工业可用的半合成初级原料薯蓣皂素之于醋酸双烯醇酮→可的松（我国的7步法，单体豆甾醇之于孕甾酮→可的松（12步）。第三代就是已经露出工业化苗头的甾体激素合成生物技术，如法国的Sanofy代谢工程重组菌发酵糖和醇一步法生产氢化可的松工程项目，都标志着甾体激素药物是如何伴随着科学技术的发展，而与时俱进一步一步走到今天。其中，资源生物学与生物制造功不可没，其特征体现在化学-生物学-工程学的精巧结合，从而发展出全球的甾体激素产业。

植物甾醇产品现在已经成为了全球引人注目的专用化学品。据估计2012年全球植物甾醇提供量达到68000吨。大豆植物甾醇主要用于食品工业，90%市场在美国欧洲和日本作为健康食品配料组份，降低人体胆固醇水平，消费量5000吨/a；还有就是作为甾体激素制药中间体上游初级原料，即经由微生物发酵工程生产4AD，ADD。近年中国企业率先带头进口大豆植物甾醇（还有造纸工业的妥尔油，甾醇部分含70%b-谷甾醇），2013年我国进口价22-26美元/kg（棕榈油植物甾醇40美元/kg）。质量要求通常总甾醇含量>95.0%。

2. 甾醇侧链的氧化的生物化学机理

甾醇侧链的氧化是一个具有复杂调控机制的多酶作用工艺过程。在分枝杆菌，AD能进一步被甾体9a-羟化酶和1(2)-脱氢酶修饰，生成化学上不稳定的9a-OH-ADD。后者同时经受非酶促A环芳构化，伴随着B环的开裂；生成的9(10)-开环甾体，经由进一步已知的分解代谢途径，成为CO₂和H₂O。这一生物转化过程中是引入9a-OH优先还是A环C-1(2)-脱氢优先？取决于菌株的专一性。对偶发分枝杆菌而言，有两种不同的3-酮甾体-1,2-脱氢酶组份，即SDH₁和SDH₂，分别催化4AD的1,2-脱氢（AD→ADD）和9a-OH-AD的1,2-脱氢（9a-OH-ADD）。显然，当其涉及同甾核氧化有关的关键反应的酶活性被抑制，或者抑制了9a-羟化酶和1,2-脱氢酶的合成，那么4AD就作为主要代谢产物积累。已报道了分枝杆菌NRRLB-3805，VKMAc-1815D，NRRLB-3683，NRRL B-3805，以及其它的能由甾醇产生4AD的菌株。对于转化甾醇的分枝杆菌而言，抗菌剂常被用作表型标记。该手段借助对抗生素的抗性选择是合理的，以及対于亲脂性化合物的生物转化似乎都依赖于同样的因子。该因子就是在于分枝杆菌独特的细胞壁组成，界定其有高的疏水性和相对低的可渗透性。例如使用万古霉素或甘氨酸抑制了细胞壁肽聚糖的合成，结果造成了谷甾醇转化为AD(D)过程强化。

细胞壁的组成不仅仅是影响分枝杆菌抗生素抗性和甾醇转化活性的因素。例如，分枝杆菌（M.chelonae）抗b-内酰胺酶活性。分枝杆菌菌株对氨基酸糖苷类抗生素取决于细胞壁低的可渗透性和低的b-内酰胺酶活性。分枝杆菌菌株对氨基糖苷类抗生素的抗性，可经由对这类抗生素的酶失活氨基糖苷增效作用，以及促进细胞壁屏障扩散作用得以解释。经由分枝杆菌生成并积累3,17-二酮甾体，也依赖于细胞壁的可渗透性作用，有利于切断甾醇侧链，以及和甾核氧化的酶活性相关。

对于腐生的分枝杆菌在抗生素的甾醇氧化作用之间的相关性尚未详细研究。借助分枝杆菌的NRRLB-3683经用甲基磺酸甲烷处理后，获得的突变株借助对12种抗菌剂改变其敏感性予以表征。它们保留了切断甾醇侧链的能力。有1株菌甾体1(2)-脱氢酶为负，并积累AD作为主要的甾醇氧化物。该菌株并能转化AD为睾丸酮，转化ADD为AD。

3.分枝杆菌的微生物生物学特点

放线菌类的分支杆菌，属于腐生细菌。在自然定向选择过程中，菌株转化能力及水平存在着较大的差异。经活化平板分离纯培养物进入初筛菌株淘汰率达高，发酵过程存在较弱的鲁棒性。即由分枝杆菌的甾醇侧链降解过程，常伴随有3,17-二酮甾体的17b-还原。该调控作用在从甾醇工业生产AD(D)工艺过程中，为了避免生成睾丸酮和1(2)-脱氢睾丸酮作为副产物而具有重要性。另一方面，17b-还原3,17-二酮甾体在利用分枝杆菌由甾醇降解工艺过程，作为生产睾丸酮的关键反应也具有特别重要性。

分枝杆菌VKMAc-1815D能切断甾醇侧链，产生AD作为主要产物，克分子产率63-68%；纯系菌株的选择是建立在克隆具有改变抗菌剂抗性方法学基础上；借助EMS或丝裂霉素C处理，获得的突变株保留有由谷甾醇生产AD的能力，克分子产率达到70-75%；还有选出有1株突变菌株能有效地还原3,17-二酮甾体的C₁₇位；其菌株细胞粗提物的17b-羟基甾体脱氢酶活性两倍高于亲株。这一途径提出了可由甾醇生产AD或睾丸酮生产，可经由改进和标记生物催化剂方式获得这种可能性。显然，这些都属于甾醇代谢的应用基础研究，应用价值不言而喻。