微生物断甾醇测链及其生物加工过程研究进展

         杨顺楷   四川成都

引言  目前我国甾体激素药物产业基本上完成了依赖薯蓣皂素-双烯半合成路线转型为植物甾醇发酵生产的4AD，ADD，9-OH-AD等代谢前体产物的半合成路线，成绩显著。为了了解植物甾醇何以能够替代旧有的合成路线，有必要将过去数十年来有关国内外有关微生物断甾醇测链及其生物加工过程研究进展知识予以介绍，有助于加快我国甾体激素药物产业发展，完成从大国向强国过渡。

工艺方法选择：

迄今为止，存在两条途径获得9a-OH-AD产品。其一，两步发酵法，即首先经由分枝杆菌微生物对甾醇（谷甾醇、胆甾醇）发酵断侧链，产出AD；第二步，再使用其它的微生物（例如诺卡氏菌、棒杆菌及红球菌属）对AD进一步进行9a-羟基化的细菌生物转化。其二，一步法经由微生物的突变株来自利用甾醇的分枝杆菌转化甾醇直接发酵产出目标产物9a-OH-AD。例如，一株分离自土壤样品的分枝杆菌属亲株，其球形原生质体经诱变处理后，选择出一株突变株M.roseum，该突变株在系统分类学上区别于已知的甾醇降解分枝杆菌，能高活力地由甾醇产生9a-OH-AD。通常菌株在缺失3-酮甾体-1(2)-脱氢酶的背景下，才可能作为主要代谢产物积累9a-OH-AD。分枝杆菌B-8119和其后的M.vccae均证实了分枝杆菌在甾醇转化中存在两种截然不同的酶与3,17-二酮1(2)-脱氢作用有关，它们二者的差别在于对AD和9a-OH-AD的专一性。

最近已报道红球菌SQ存在2种3-酮甾体1(2)-脱氢酶同功酶，对它编码3-酮甾体9a-羟化酶基因进行了鉴定和表征，它为两个组分的IA类别的单加氧酶，由KshA和KshB酶蛋白组成。当用KshA基因缺失突变体（RG₂）进行甾醇转化，没有发现积累AD、ADD或其它代谢物，这就解释了甾环结构降解酶（9a-羟化酶）活性。KshB基因缺失突变株（RG₄）不能切断甾醇侧链，表明甾醇侧链降解中，9a-羟化酶的作用。

菌种选育：1.遗传学水平2.生理代谢水平

菌种选育的所谓“逆向选择法”，首次使用亲株（Myco. sp）NRRL-3805作为出发菌株，在对总甾醇降解株的UV-诱变后，选择出具有对甾体1(2)-脱氢酶和9a-羟化酶活性双重阻断菌株。已经选育出的Myco. vaccae ZIMET 11052，11053就是这种能由谷甾醇转化生成9a-OH-AD，且不表达对9a-OH-AD甾体底物的1(2)-脱氢酶活性的菌种。

9a-OH-AD产生菌株的诱变及选择

在琼脂培养基上6/2菌株生长培养期间，生长成了不同类型的菌落。在谷甾醇培养基上6/2菌株继代生长培养10次后，分离到了S-型菌落。获得的最好菌落产生9a-OH-AD（标示为6/2S），是在经受UV-诱变菌株6/2S菌落的复制平板筛选产生了少数突变菌株，其中的6/2 1UV呈现出最大的9a-OH-AD产生活性；它的出现是在经由谷甾醇培养基上多代处理后出现的增产结果。首批仅有2.7%的9a-OH-AD产生；菌株同谷甾醇保温培养3日后，与此同时第Ⅳ批则有59.6%的9a-OH-AD积累浓度。在琼脂培养基上，6/2-1UV菌株的生长培养，主要形成S-型菌落；挑取分离光滑黄色菌落。由这些菌落获得的菌株显示在含AD/9a-OH-AD矿物盐培养基上，呈现微弱生长，甚至不生长，这些菌株标示为分枝杆菌sp.2-4M和VS，已收藏于实验室。检测这些菌株显示产生9a-OH-AD活性，相对于2-4M菌株就比较水平而言可忽略不计。所以，选择出的丰泽公交站sp.2-4M突变株转化谷甾醇结果如下：⑴、9a-OH-AD位主产物；⑵、克分子转化产率47-50%在48h内达到；⑶、同时AD产率数量达21%；⑷、延时转化到120h期间，主产物浓度未有可检测到的变化，无甾环去结构或化学修饰情况发生。有机如此，分枝杆菌原始亲株1815D，突变株2-4在5g/L谷甾醇底物浓度下，在120h转化期间完全转化，无剩余底物残留，主要积累9a-OH-AD；而1815D则产生AD（克分子产率67-73%）

已知两株转化甾醇的分枝杆菌，原始株1815D和突变株2-4M，都能把5g/L的谷甾醇在120h期间全转化，无剩余底物残留，前者主要产生AD（67~73%），尚有不少量的孕甾-21-OH-20-Me化合物存在（HMP）（14~15%），不积累9a-OH-AD；后者主要由谷甾醇生成9a-OH-AD（48~50%），及AD（21~22%）。突变株选育借助一系列化学诱变剂（EMS、MitC）和UV辐照，结合使用谷甾醇的选择压力的诱变作用，选择出的突变株2-4M能够利用谷甾醇转化降解出生9a-OH-AD作为主要产物。这可解释为这种类型自发突变的结果是因为在若干代半连续培养期间，在存在谷甾醇选择压力下，借助于选择作用，产生积累9a-OH-AD种群出现，同317-二酮体AD、ADD比较，9a-OH-AD具有较高的亲水性。借助这种利用谷甾醇作碳源的长期多代半连续培养，就提供了一种培养物种群中出现9a-羟化酶回复突变的可能性。

从细胞生理学角度分析，AD和ADD的解毒作用可提示，9a-羟化酶增加的原因之一就是在若干代培养过程中的自发选择结果。AD(D)呈现出对细胞生存力生长培养和呼吸作用的抑制作用，并抑制了分枝杆菌的甾醇转化活性；基于此，借助吸附树脂（XAD，Amberlite EP-60等）从转化反应混合物中吸附移走ADD，有利于甾醇降解过程的进行。这是ADD对分枝杆菌降解作用的抑制影响。AD抑制呼吸活力、葡萄糖的摄入，以及抑制酿酒酵母的生长；外源AD还抑制粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）生长，影响细胞分裂，刺激形成非正常的膨大细胞。

在存在AD(D)时，就可能提供能进行9a-羟化的突变体，分枝杆菌CBS482.86株是由NRRL B-3805产AD，生长在含有谷甾醇和ADD混合物培养基中，经多代的生长培养，选育出能产生9a-OH-17-酮的菌株，这9a-OH-17-酮又是来自C₁₇带有侧链的甾体化合物。（传统观点的“二步发酵法”认为，先降解侧链生成AD，再由AD进行C_9-位的生物羟基化）。

在存在AD(D)时，就可能提供能进行9a-羟化酶和1(2)-脱氢酶活性的生化遗传缺失。菌株表达了微弱的或不能在9a-OH-AD上生长的特征。进一步的选育，借助改变对萘啶酸和庆大霉素（NaI₅₀^RGm₁₀^R），以及对利福平和庆大霉素（Rif₁₀₀^RGm₁₀^R）的抗性，分离出了能活跃地转化谷甾醇成为AD的同系列菌种；但是，检测不到由谷甾醇生成的9a-OH-AD；然而终因甾体总量的不平衡，表明总甾体骨架的去结构是因为由于9a-羟化酶和1(2)-脱氢酶弱化活性所致。分离选育的衍生谱系是由1815D- NaI₅₀^RGm₁₀^R 和Rif₁₀₀^RGm₁₀^R，伴随改变抗菌剂抗性——以在AD或9a-OH-AD作为唯一碳源时均不能生长，这样能由谷甾醇生成少量9a-OH-AD。在此基础上，为了获得能够转化谷甾醇成为9a-OH-AD的菌株，继续应用在谷甾醇的选择压力下，结合传统的化学诱变剂诱变作用，对分枝杆菌sp.用EMS和丝裂霉丝（Mit C）C处理，促使诱发突变，改变菌株能在AD和/或9a-OH-AD上生长，因此导致可能再生一或二个遗传缺失的酶活性。进一步继续多代在有谷甾醇存在条件下生长培养，结果就富集培养出了有9a-OH-AD产生的细菌突变体菌落，保留了切断甾醇侧链的能力，并能向9a-位引入羟基。在获得了具有9a-OH-AD生产能力突变菌株基础上，仍然置于谷甾醇选择压力下 进行UV-诱变重复选择，相对而言具有较高产能（约克分子产率50%）。

原始出发菌株1815D和（2-4M）突变株均不能在AD或9a-OH-AD作为唯一碳源时生长，也不能转化9a-OH-AD就是它们对9a-OH-AD特异性有关的甾体1(2)-脱氢酶缺失的证据，而这直接涉及9a-羟功能基裂解甾体化合物骨架有关。

如所预期，突变株2-4M降解ADD是因为源于其9a-羟化酶活性。在仅只用ADD去结构试验中，发现的确是1-位烯键被氢化还原为AD，然后AD被9a-羟化为9a-OH-AD。这种1-烯-还原酶高活性已经由1815D亲株所报道（2002）。

利用分枝杆菌sp.2-4M对其在谷甾醇转化的精细测定表明，9a-羟基化发生在甾醇降解物的早期阶段。借助M.roseum对谷甾醇转化期间，发酵液中生成部分侧链降解9a-羟基化产物积累的资料可见报道（1991），对红球菌（R.erythropolis）就提出了Stenone羟化期间酮型甾体9a-羟化酶的一个组分——KshB蛋白参与了该过程的见解（2002）。生成的9a-OH-Stenone和9(10)-开环酚并在C₁₇侧链的已先被9a-羟化了的甾体侧链降解结果。这与分枝杆菌sp. 2-4M作为外源性AD底物是不适合的事实相符：即使在较低底物浓度下（0.25g/L），与此同时当谷甾醇（5g/L）底物负荷量，却观测到了50%的9a-OH-AD的克分子产率，即使谷甾醇在长期保温转化期间也未见有AD生成9a-OH-AD。

分枝杆菌sp. 2-4M菌株同谷甾醇的保温转化，9a-羟化物对非羟化代谢物的比率移向前者；在稳定生长期间，9a-羟化物甾体化合物稳定在最高水平，这就证实了9a-羟基化的不可逆性。虽然尚未见生成9a-羟基谷甾醇或9a-羟基-谷甾醇-3-酮生成的证据，但是保留侧链甾体的羟基化不可能完全排除。

我们的结论：经由多代的谷甾醇压力组合突变选择，这是获得9a-OH-AD产生菌株一种有效的方法。

甾醇原料选择

大豆提取残留物（Scum）是一种豆油生产的废料，研究了它作为初级原料生产C₁₇-酮甾体的可行性。利用分枝杆菌sp.1817D在较长的转化期间300-350h转化很慢，检测不出甾体产物。于是对这种废料中含有的可转化甾醇（谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇）含量达14%的进行预处理。微生物的富集培养技术从废料样品中进行分离野生型微生物，它较分枝杆菌能更有效地利用其中的非甾醇组分，从而富集了甾醇底物；化学预处理借助极性有机溶剂消除废物样品中的非甾醇杂质组分，从而提供了的生物转化速率和9a-OH-AD的克分子产率可与高质量的来源于商业妥尔油谷甾醇相当，在10g/L可转化甾醇制剂在由分枝杆菌1817D的60h转化期间达到65%9a-OH-AD产率，这说明大豆油工业生产的废弃物，要作为生物技术生产C₁₇-酮甾体化合物的便宜底物使用，可以事先对其进行预处理。

甾体药物工业生产每年对天然甾醇有2000t/a的需求量（1990），因此存在着日益增长的对含甾醇原料价廉物美易得的需求。

当前，微生物断天然甾醇侧链是获得C₁₇-酮甾体的基本手段；C₁₇-酮甾体是合成各种各样甾体化合物关键前体，包括性激素、糖皮质激素、利尿剂等。C₁₇-酮甾体的生产估计每年为1000t，超过60%基本化合物均都经由生物技术工艺进行生产。在天然甾醇中，b-谷甾醇和胆固醇是最适合经由微生物转化用于生产C₁₇-酮甾体产品。

胆固醇主要产自含脂羊毛和别的动物来源的产品。尽管它具有良好的特性适用于微生物侧链氧化的底物，但是比之广泛量大的b-谷甾醇利用度较低，且用胆固醇生产的C₁₇-酮甾体成本较高。

b-谷甾醇是一种广泛分布的植物甾醇。因为作为单一化合物的生产是比较昂贵的，而一种甾醇混合物——俗称“植物甾醇”通常用于微生物转化。在其工业生产原料中，纸浆和造纸工业，植物油生产均是作为废弃物。

“甾醇组分”代表了决定C₁₇-酮甾体产品价格的主要因素之一，因而降低成本是必要的。从纸浆和造纸工业废弃物、妥尔油产物的中性及精选中性馏分，在没有分离和纯化植物甾醇条件下，已经尝试了直接用于获得C₁₇-酮甾体（AD、ADD）。经由分枝杆菌MB3683转化精选中性馏分的代谢物和主产物的产率比较相当于合成级纯品b-谷甾醇。

进来，葡萄牙的纸浆厂和食用油生产厂已经调查了不同的富含甾醇的废料可用于生物转化的情况。来自纸厂妥尔油馏出物和来自食用油脱臭物（食用油精炼工艺废弃物）富含甾醇部分（>96%）可以达到70%的产率。利用分枝杆菌sp.NRRL3805转化为AD和ADD，最好的结果来自转化富含妥尔油甾醇未皂化分离物，终产物（AD+ADD）的克分子产率，在底物负荷2.5mmol/L时为55%；而食用油脱臭物甾醇转化较低的产率是因为这些分离物中有较高的豆甾醇含量。

本工作已对豆油生产废弃物（Scum）中的大豆提取物，作为生产C₁₇-酮甾体的底物。作为一种模式工艺，利用分枝杆菌VKMAc-1817D生物转化甾醇生产9a-OH-AD——合成各种糖皮质激素的关键前体进行了研究。

相关酶活性及其生物催化作用

有关分枝杆菌VKMAc-1817D谷甾醇生成9a-OH-AD作为主要产物积累时，发现伴随着有甾体-1-位脱氢酶（St₁DH）活性，引起甾体产物9a-OH-AD的去结构降解。该活性可能由AD诱导。在破碎细胞抑制剂仅只有存在人工电子受体——PMS（酚嗪甲基硫酸酯）表达有脱氢酶活性；由整细胞的甾体-1-位脱氢酶活性缺乏PMS的影响，提示电子传递经过呼吸链到氧，并不是速率限制时相。由整细胞和破碎细胞9a-OH-AD的V_max的显著差别表明整细胞中酶的底物可能的受纳限制。由AD仅生成ADD也说明分枝杆菌sp. VKMAc存在甾体1-位脱氢酶（St1-DH）活性。同9a-OH-AD比较，AD在水中溶解度低30倍，相应地在ADD浓度超过它的溶解度时，有较低的1(2)-脱氢速率。这一事实可归因于晶体增溶作用对生物转化的限制。同时当甾体浓度没有超过其在水中的溶解度时，观察到细胞制剂1-脱氢酶活性对9a-OH-AD和AD有可比较的水平，类似的结果也由偶发分枝杆菌ATCC6842所报道。野生细菌株的甾体1-脱氢酶（St1DH）主要都是可诱导的酶。通常3-酮甾体作为甾体-1-位脱氢酶（St1DH）的诱导剂，然而报道以3b-羟基甾体作为诱导剂没有诱导效应。在诱导剂中，报道了9a-OH-3-酮甾体同非羟化甾体的诱导，偶发分枝杆菌ATCC6842及其突变株HA-1已报道了两种不同的甾体-1-位脱氢酶（St1DH）活性：其中一种酶由非羟化物诱导，另一种由9a-羟化类似物诱导。在分枝杆菌突变株报道了这种酶可诱导性的改变。偶发分枝杆菌NRRL8153当其在有谷甾醇生长时，诱导出了对9a-OH-AD的甾体-1-位脱氢酶（St1DH）活性。我们推断当谷甾醇由Ac-1817D转化为9a-OH-AD期间，可能借助于谷甾醇氧化中间体诱导甾体-1-位脱氢酶（St1DH）活性。这些化合物被鉴定为带有部分被降解侧链的9a-OH-3-酮甾体，类似于VKMAc-1817D突变株报告的结果。但是，对分枝杆菌VKMAc-1817D而言，既没有见谷甾醇，也未见谷甾醇氧化的9a-OH-3-酮甾体中间体诱导了甾体-1-位脱氢酶（St1DH）活性，反而仅观察到了AD的诱导效应。

相关酶学及细胞定位/催化功能

对分枝杆菌VKMAc-1817D细胞分部表明，甾体-1-位脱氢酶主要定位在胞液里。同时，在胞外和膜结合部位检测到了少许活性。对不同的细菌已经报道了在胞液和膜结合甾体-1-位脱氢酶的存在；也报道了膜结合甾体-1-位脱氢酶部分增溶的情况；还证明分枝杆菌VKMAc-1817D胞外甾体-1-位脱氢酶同其他甾体转化活性在一起；采用硫胺分部沉淀，DEAE-葡聚糖和苯基葡聚糖的离子交换层析，结合Bio-Gel A-0.5M的凝胶过滤，对该甾体-1-位脱氢酶进行了部分纯化达28倍，酶分子量58000±2000Da，同已经报道的诺卡氏菌（N.coralline）甾体-1-位脱氢酶60.5KDa，红球菌（R.erythropolis）56KDa比较，均在该范围内。与此相反，Ac-1817D的双亚基酶不同于诺卡氏菌分离的单体甾体-1-位脱氢酶。所以，获得的这些结果对于利用谷甾醇，发展生产9a-OH-AD的生物技术方法，改进细胞的生物催化性质是有适用价值的。

红球菌静息细胞对AD的9a-羟基化（保加利亚）

9a-羟化酶甾体化合物在合成高效抗炎药物，如9a-氟氢化可的松是很有用的中间体。它们可经由微生物区域选择性地在C₉-位引入羟基，并有若干种属的微生物具有执行这种功能过程的能力。通常的方法是立足于甾体底物在微生物生长培养物上一起保温培养。然而这就不可能改变细胞密度，以及转化发酵培养基的高度复杂性，这些成为了限制该工艺过程有效性的限制因子。加之，有证据表明在微生物的生长和甾体羟基化反应之间存在着对还原（力）辅因子的竞争问题。

在营养缺陷转化介质中，使用事先生长培养好的细胞是一条可能改进工艺的有效途径。该途径提供了一些附加的优点，如降低转化期间染菌风险，有利于反应产物的分离纯化。然而，借助于事先生长培养好的细胞进行甾体化合物的微生物9a-羟基化数据资料不常见。本文作者研究产物形成的动力学过程，以及借助红球菌的静息细胞在营养缺陷缓冲液介质体系中研究了AD转化为9a-OH-AD，如碳、氮源，生长菌龄和生物质贮存期对微生物9a-羟基化4AD的影响。不同的pH，多种载体溶媒甾体投料方式等的转化条件进行了考察。观察到使用静息细胞在含有葡萄糖和非脱水酪蛋白水解物培养基中，转化率约为0.75，注意到氮源对工艺过程有强烈影响生长的效应。反应介质若干种醇类增高底物转化率到0.85，贮藏细胞转化能力的降低同贮存时间的对数函数有关。

通论如下：在所有研究积累9a-OH-AD中，都一致发现9a-OH-AD在微生物对AD去结构化的代谢途径中是一种重要中间体；其中两种酶起了关键作用：9a-甾体羟化酶和D¹-甾体脱氢酶。两者同时起作用造成了生成不稳定化合物9a-羟基-1,4-雄甾-二烯-3,17-二酮（9a-OH-ADD），它很快被降解成9,10-开环-酚型，甾体结构B环被开环。这样，生成的9a-OH-ADD可经由AD的9a-OH生成9a-OH-AD，继之经由C₁-位脱氢；以及AD的C₁-位脱氢生成1,4-雄甾-3,17-二酮（ADD），其后它的9a-羟基化两种方式完成。作者实验观察的典型时程过程：当积累的9a-OH-AD达到最大值时，然后紧接着底物（AD）耗尽，最初始徒降，证实菌株的D¹-甾体脱氢活性。因为在转化介质中不存在ADD，不能设想它是由于缺少AD的直接脱氢，而是ADD羟化高速率所致结果。

有机溶剂介质中的双相转化

加入到与水不混溶的有机溶剂介质中的甾体化合物微生物转化，已被证明是借助克服水基反应介质甾体底物溶解度低，从而改进工艺过程有效性的一种合适途径。有机-水相转化介质已被成功地应用于谷甾醇侧链降解和6a-甲基-氢化可的松-21-醋酸酯的脱氢，但尚未见在微生物甾体羟基化过程应用。早期有文献报道棕曲霉（Asp.ochraceus）菌株对孕甾酮的11a-羟基化活性的丧失，在于存在与水不混溶有机溶剂体系中微生物的甾体羟基化溶剂的破坏作用；但尚未见报告进行微生物9a-羟基化在与水不混溶有机溶剂介质中的可应用研究。作者使用红球菌静息细胞，应用有机溶剂介质体系进行AD的9a-羟基化进行了评估。重要的是该红球菌细胞的9a-羟基化和D¹-甾体脱氢活性两者均是可诱导的，而且他们的诱导过程发生在C/N缺陷转化培养基中，并是连贯进行，D¹-甾体脱氢酶合成在先，继之是9a-甾体羟化酶的合成。这样，羟化反应的效率可能因为阻断不需要的D¹-甾体脱氢酶活性已以近似化学计量值增高。在一双相邻苯二甲酯-缓冲液转化介质（3∶1，v/v），含有AD1g/L底物浓度下，得到产物产率高于90%；该结果提示在该条件下D¹-甾体脱氢活性基本上被抑制，成功的羟化反应产物产率超过60%以上，也在一邻苯二甲酸酯培养基，伴之以同时的高通气条件下发生了，且最低水含量维持在大约3%（v/v）。而在单相邻苯二甲酸酯培养介质获得的结果，凸显出了红球菌静息细胞在建立9a-羟基化和D¹-脱氢活性方面通气的重要性，因为在一带水夹套反应器的对照实验中，加入的AD不通气，仅用饱和了空气的水进行操作，结果加入的AD没有任何变化。这种单相介质有关通气效应对于微生物细胞甾体转化的依赖关系此前在分枝杆菌细胞已有报道，应该强调指出：在该邻苯二甲酸酯介质中AD转化过程时程曲线的研究，它非常类似于先前在水相介质中得到的结果。最明显的差别在于有机相介质中的对数生长期长于水相介质中的对数生长期。很可能是AD在有机溶剂中的增溶作用，由于降低底物-细胞直接接触而降低了对AD的初始摄入速率。有机相反应介质中估测其转化反应速率同水相介质相比较大约高6倍，我们对观察到的这一现象倾向于可能有助于从细胞内排出羟化物，比因有机相介质中AD的增溶作用。当然，这一设想，需得有进一步的实验证据。

特别有兴趣的是，在纯有机相介质中发现有效的甾体羟基化是经由非诱导的静息细胞进行的。正如先前讨论过细胞甾体转化能力的诱导是一个适应过程，并伴随着通过增加胞外蛋白周转，包括选择性降解的酶系，这些酶系对细胞并非必需；且面对这种改变了的环境导致新酶的合成。由此，当其在水相和有机溶剂介质中进行的羟基化反应，获得的可比较结果的事实，意味着即使在单相邻苯二甲酸介质中，红球菌静息细胞不仅保留了如像分枝杆菌细胞在同样条件下的同样的生活力，而且也还能重新合成整个酶系，该酶系正是需用于雄烷甾体化合物作为单一碳源能源生理需求。于是，本文提出的实验结果证实了可借助实现制备的仓贮细胞改进微生物的羟化工艺并充分满足增加甾体化合物在介质中的溶解度需求。

分枝杆菌突变株生产AD（俄，2002）

AD是已知的前体激素，是甾体药物的关键前体分子。当今，它是由能选择性地降解甾醇C₁₇-侧链的分枝杆菌属的细菌生物转化甾醇进行生产的。

甾醇侧链的氧化是一个具有复杂调控的多酶作用工艺过程。在分枝杆菌，AD能进一步被甾体9a-羟化酶和1(2)-脱氢酶修饰，生成化学上不稳定的9a-OH-ADD。后者同时经受非酶促A环芳构化，伴随着B环的开裂；生成的9(10)-开环甾体，经由进一步已知的分解代谢途径，成为CO₂和H₂O。9a-OH化优先还是1(2)-脱氢优先？取决于菌株的专一性。对偶发分枝杆菌而言，有两种不同的3-酮甾体-1,2-脱氢酶——SDH₁和SDH₂，分别催化AD的1,2-脱氢（AD→ADD）和9a-OH-AD的1,2-脱氢（9a-OH-ADD）。显然，当其涉及同甾核氧化有关的关键反应的酶活性被抑制，或者抑制了9a-羟化酶和1,2-脱氢酶的合成，那么AD就作为主要产物积累。已报道了分枝杆菌NRRL B-3805，VKMAc-1815D，NRRL B-3683，以及其它的能由甾醇产生AD的菌株。对于转化甾醇的分枝杆菌而言，抗菌剂常被用作表型标记。该手段以对抗生素的抗性是合理的，以及対于亲脂性化合物的转化似都依赖于同样的因子。该因子就是在于分枝杆菌独特的细胞壁组成，界定其有高的疏水性和相对低的可渗透性。例如使用万古霉素或甘氨酸抑制了细胞壁肽聚糖的合成，结果造成了谷甾醇转化为AD(D)过程强化。

细胞壁的组成不仅仅是影响分枝杆菌抗生素抗性和甾醇转化活性的因素。例如，分枝杆菌（M.chelonae）抗b-内酰胺酶活性。分枝杆菌菌株对氨基酸糖苷类抗生素取决于低的细胞壁可渗透性和低的b-内酰胺酶活性。分枝杆菌菌株对氨基糖苷类抗生素的抗性，可经由对这类抗生素的酶失活氨基糖苷增效作用，以及促进扩散细胞壁屏障得以解释。经由分枝杆菌生成并积累3,17-二酮甾体，也依赖于细胞壁的可渗透性和与切断甾醇侧链和甾核氧化的酶活性相关。

对于腐生的分枝杆菌在抗生素的甾醇氧化作用之间的相关性尚未详细研究。借助分枝杆菌的NRRL B-3683经用甲基磺酸甲烷处理后，获得的突变株借助对12种抗菌剂改变其敏感性予以表征。它们保留了切断甾醇侧链的能力。有1株菌甾体1(2)-脱氢酶为负，并积累AD作为主要的甾醇氧化物。该菌株并能转化AD为睾丸酮，转化ADD位AD。

由分枝杆菌的甾醇侧链降解过程，常伴随有3,17-二酮甾体的17b-还原。该调控作用在从甾醇工业生产AD(D)工艺过程中，为了避免生成睾丸酮和1(2)-脱氢睾丸酮作为副产物而具有重要性。另一方面，17b-还原3,17-二酮甾体在利用分枝杆菌由甾醇降解工艺过程，作为睾丸酮生产的关键反应具有特别重要性。

分枝杆菌VKMAc-1815D能切断甾醇侧链，产生AD作为主要产物，克分子产率63-68%；纯系菌株的选择是建立在克隆具有改变抗菌剂抗性方法学基础上；借助EMS或丝裂霉素C处理，获得的突变株保留有由谷甾醇生产AD的能力，克分子产率达到70-75%；还有选出有1株突变菌株能有效地还原3,17-二酮甾体的C₁₇位；其菌株细胞粗提物的17b-羟基甾体脱氢酶活性两倍高于亲株。这一途径提出了由甾醇生产AD或睾丸酮生产，可经由改进和标记生物催化剂方式获得这种可能性。