难忘红酵母PAL酶法非粮途径生物制造L-苯丙氨酸的50年

    ——简述国内个人职业道路PAL研发历程30年

杨顺楷     四川   成都

关键词：红酵母PAL酶法/肉桂酸；生物制造；L-苯丙氨酸；非粮途径

1968年：苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL，EC 4.3.1.5）是一种广泛存在于植物和某些微生物（真菌，酵母，及少数简单原核微生物，Streptomyces ）有机体内的酶，PAL催化L-苯丙氨酸（L-Phe）非氧化脱氨生成肉桂酸（trans-cinnamic acid，t-CA）和氨，是植物体内次生代谢的关键酶和限速酶，与其高等植物防卫机制有关；迄今未在真细菌和动物发现PAL的存在。Koukol等首次（1961））报道从绿色植物中发现并分离了PAL ；继之对PAL迅速展开研究，成为了对植物苯丙烷代谢途径研究最多的酶。

本文重点关注的是由Havir等首次（1968）研究了PAL的解氨机理，指出PAL具有逆向催化合成L-Phe的能力，由此导向引出化学-酶法合成L-Phe及其非天然芳香氨基酸结构类似物的研究开发方向，具有L-Phe及其APIs（active pharmaceuticals ingredient）生物制造的广阔应用前景。简明反应式如下：

t-CA（或芳基丙烯酸） + NH3 → L-Phe或L-芳香丙氨酸

1981年：Yamada等报道利用粘红酵母含有PAL活性的整细胞转化t-CA生产L-Phe；

1985年：Hamilton等报道应用生物反应器制造L-氨基酸；同时，美国2家公司（Genex和Synthetech），德国Degussa，日本田边制药等相继将此途径实现工业规模生产，产量以kt/a级计；

1987年：杨顺楷等在全国第二次工业生化学术会议上首次报道“用红酵母静止细胞转化t-CA产生L-Phe”的研究结果；同年Evens等报道了分离评估适合于L-Phe商业化开发的PAL酶法产出的酵母菌株。

1988-1990年：笔者实验室获准国家自然科学基金项目“氨基酸化学-酶法不对称合成研究”（NO.3870009）资助，对该项目批准意见批示为：“采用化学-酶法不对称合成研究，国内开展尚少且目标为国内急需的L-苯丙氨酸，显然有重要的应用前景”；1989年8月13-18日由国家科委组团，笔者参加了在韩国首尔举行的第5届亚洲-大洋洲国际生化联盟大会，论文被选为分组口头报告，题目“生物转化反式-肉桂酸为L-Phe：使用酵母整细胞的微生物筛选和对PAL活性的初步评估”；首篇学术论文“酵母细胞生物转化反式-肉桂酸生产L-苯丙氨酸的研究”由杨顺楷等发表在《天然产物研究与开发》1990年1期首篇论文。

1991年3月13日：通过国内院内专家同行的省部级小试技术鉴定。

1992-1995年：通过研究所与企业合作，开展了公斤级中间试验研究，终于在95年6月通过了“肉桂酸/酶（PAL）法直接合成L-苯丙氨酸”的公斤级中间试验省部级技术鉴定；所采用的菌种就是在此期间，我们从滇西芒果园采集的土壤样品中，借助富集培养/理化诱变/拮抗平板选择等育种技术，选育出高PAL活性的红酵母属菌种（Rhodotorula sp.）CIBAS A1401(后鉴定为粘红酵母R.glutanis CIBAS A1401)。

1998-2005年：在中间试验技术鉴定后的3年期间，握有中试成果的企业方在江苏省未能够列入省级高新技术开发项目，不得不进行技术转让，先后多次多地进行技术转让，结果该菌种和工艺多家重复转让，形成技术市场混沌无序的状态；直到1998年，转让到浙江绍兴一家亚美生化公司（民营企业）开发了2年的工业规模试产，均不能达到技术-经济指标，最后搜寻到技术源头ZKYCDSWS，正式签约，以所企合作开发，终于在98年秋，利用该研究所选育出的粘红酵母CIBAS A1401-E-105-7号菌株首次实现了红酵母（PAI）/肉桂酸技术途径百吨级工业规模试产L-Phe成功，结束了我国长期不能生产L-Phe的历史；企业相继获得科技部的支持，和国家经委的“国家重点新产品证书”，以及国务院贴息贷款1000万的财政支持。这些举措有力地推动了我国低能甜味剂阿斯巴甜（APM）产业的快速发展。

值得一提的是：个人职业道路上与团队一起，分离选育的该红酵母菌种和工艺逐级放大成功投产，关键在于该菌株的PAL酶活力，再无任何防腐剂和保护剂存在下，4°C保存一周，剩余酶活95%；两周63%，-20°C两周82%；该PAL酶在60°C保温1小时后酶活性几乎完全丧失，但是该PAL酶在50°C以下，尤其是最适反应温度以及更低温度下，都有较高的稳定性，这可能就是粘红酵母CIBAS A1401株系能够用于工业生产L-Phe 的优势所在。这期间国内3家企业共生产L-Phe2000多吨，部分替代了进口产品，使得工业级L-Phe从1995年到岸价20万元/t,逐步下降到7-8万元/t（该工艺的盈亏平衡点）。

面对利用PAL/肉桂酸技术途径，在国内自主创新工艺，首次实现百吨级工业规模试生产L-Phe→APM现实，如何提高L-Phe的产量，扩大商业开发规模，已经成为该新工艺技术创新的瓶颈。针对底物原料肉桂酸传统产品（苯甲醛/醋酐生产工艺）价位高，浙江巨化公司适时开发出利用氯碱工业副产废物（破坏嗅氧层）四氯化碳→t-CA（1000t/a,3.1万元/t供货亚美公司）→L-Phe→APM的技术路线，初步形成良性循环。

亚美公司开发利用进口糖质发酵法产品L-Phe和自产L-Phe产品生产APM相比较，结果表明每批由L-Phe→APM生产线，使用自产原料L-Phe产出的APM产品，与使用进口L-Phe原料产出的APM产品，平均每批高出若干公斤。这就表明PAL/肉桂酸途径产出L-Phe质量高，高纯度，杂酸含量低，纯度高于发酵法产品。完全可以直接替代国内进口医药用级L-Phe产品（现在国内医药用L-Phe每年耗用量已经达到千吨级水平），质量完全可以保证。

这就提示由亚美公司（私企）和浙江巨化公司（大型国企）初步建立起来的四氯化碳→t-CA→L-Phe→APM非粮途径技术路线，显然具有典型绿色低碳环保的重要价值。可惜得不到国家层面立项支持，短期运转后不得不中途夭折。但是，伴随着国内糖质原料基因工程菌株发酵法的大规模投产，L-Phe工业级价位降低到在5万元/t（目前已经达到万吨级水平）；显然这对想要继续坚持生产PAL/肉桂酸非粮途径技术路线生产L-Phe的3家民营企业来说，已经不可能亏本生产食品工业级L-Phe产品，提供用于APM的生产原料，只好忍痛关闭这一国内自主创新工艺生产线。

如果政府有关部门准许其以科技型企业，与科研院所继续合作立项深度开发，L-Phe产品以医药级产品（每吨价位10万元以上）替代进口，那么企业还有生存下去，得到发展的可能；然而伴随着笔者的退休，这一切设想及计划都难以得到实施。不过笔者对红酵母菌种（Rhodotorula sp.）CIBAS A1401(后鉴定为粘红酵母R.glutanis CIBAS A1401)PAL酶的分子克隆及遗传重组分子改造工作，一直是该生物化工领域个人职业兴趣关注的焦点，因为该菌种在工业试生产期间3家企业管理层人士认为，在菌种生产性能稳定时，曾有过连续10余批L-Phe产率3.5%的高产记录（中试为3.0%），产酸率低到2.5%为盈亏平衡点；该工艺生产操作容易，产品质量高，杂酸含量低，废水量少的特点。这一设想只有寄希望于后来人，但愿能够得以传承，发扬光大，使得这一条自主创新生物化工项目能扎根于我国土地上。

2005年以后到如今：

1）L-Phe的非粮途径PAL酶法 与糖质原料直接发酵法两种生产工艺优缺点的比较：

•       PAL酶法具有资源节约型特点，它利用化工原料（苯甲醛和醋酐）或氯碱工业副产废物四氯化碳提供底物t-Ca→L-Phe，制备细胞物作为生物催化剂的发酵罐体积小，生物反应器罐型更小，；而直接发酵法产业（氨基酸，有机酸，抗生素等）发展，我国长期以来一直是耗粮耗能耗水大户，规模吨位上去了几个“世界第一”，但是经济效益和生态环境保护所支付出的代价难以估量。发酵产业依赖农业粮源，如玉米（南方稻米）加工为糖作为发酵原料生产，目前还要进口玉米，这对保证我国粮食安全极为不利；

•       PAL酶法生物催化t-Ca和氨一步立体选择性氨化反应合成，典型的生物制造；直接发酵法利用重组菌株利用碳氮源通气培养，它是代谢调控途径复杂的生物合成，加之，基因工程重组菌工业发酵始终存在菌株稳定性（质粒丢失）问题；

•       生物反应器紧凑 VS 发酵罐体积庞大；

•       产物单一/ 杂酸含量低 VS 杂酸含量高/ 后处理复杂；

•       废水量少 VS 废水量大。

由此可见，我国直接发酵法生产L-Phe过去10年发展很快，已达到20000吨/a 以上，APM产量也同步上升达到15000/a，但是整体经济效益不高（L-Phe从95年口岸价20万元/t 下跌到现在5万元/t；APM从50万元跌到现在15万元/t，大部出口）；发酵罐体积越来越大（200,300,500立方米），水耗，能耗大幅度增加，环境保护亚力加剧；虽然我国整体发酵产业过去20年成绩巨大，但是均属传统工艺；成为了首屈一指的耗粮大户（目前每年尚需进口百万吨级玉米），在这国家层面深化供給侧经济改革，要求从数量型转移向提高质量型新形势下，很有必要重新审视我国自主创新的四氯化碳→t-CA→（PAL生物催化）L-Phe→APM的非粮途径绿色生物制造技术路线，切望重新焕发生机。

2）要重视红酵母PAL生物制造平台建设的研究与开发价值

近年分子细胞生物学进展，有助于PAL生物催化剂红酵母酶源菌种的分子改造。美国南加州大学一个研究团队（2008年1月）报道，面包酵母的2个基因RAS2和SCH9被敲除，酵母细胞寿命足足延长10倍（延缓“细胞凋亡”）。酵母细胞行出芽生殖，传递40代后，细胞内集聚垃圾DNA，该种系走向遗传学上的程序性死亡；已经具有PAL生物催化工业应用价值（已经在1998-2005年期间产出2000多吨L-Phe产品）红酵母CIBAS A1401-G-1代菌种，借助这一理念，开展红酵母PAL酶基因分子育种研究，可以进一步改进，并筛选出PAL活性更高，生产性能稳定性更好的红酵母CIBAS A1401-G-2代菌种。重新焕发出PAL酶法合成L-Phe及其结构类似物（非天然芳香氨基酸）的创新生物制造绿色工艺，以APIs （active pharmaceuticals ingredient）多样化产品，进入国内外APIs市场是完全可行；近年这一化学-酶法合成研究一直处于活跃前沿，前景看好。

最后，在这国际首次发现PAL酶法逆向催化合成L-Phe 50周年，个人国内职业道路介入红酵母PAL生物转化研发L-Phe道路30周年之际，整个过程用一句时髦的字句形容，的确是充满了“跌宕起伏”，但是取得的成绩还是不容置疑的。虽然作为项目负责人，见证了个人职业道路PAL研发历程30年的全过程，鉴于国内惯性运作的科技管理体制的缺陷，受到了一些不公正待遇，但是至今也无怨无悔，已过“古来稀”年龄段的笔者，心态已经十分平和，还是那句红色经典话语“革命自有后来人！”愿红酵母CIBAS A1401-G-2代分子育种工作，必将在后继者的学术传承中得以发扬光大，为我国的生物工业产业发展作出巨大贡献。