杨守京 空军军医大学（第四军医大学）西京医院病理科

一、细胞的呼吸

细胞呼吸（Cellular Respiration）是指葡萄糖在细胞内的氧化分解，利用氧产生二氧化碳、水及三磷酸腺苷（ATP）的的过程，有氧氧化是在线粒体内进行的，又称线粒体呼吸。线粒体通过氧化葡萄糖并由位于线粒体内膜的氧化磷酸化呼吸链复合体(oxidative phosphorylation system, OXPHOS)合成ATP，提供细胞赖依生存的能量。经过线粒体氧化磷酸化（OHPHOS）1克分子葡萄糖产生38克分子ATP。机体90%以上的能量由线粒体呼吸提供。

与正常细胞相比，肿瘤细胞能量代谢最明显的特征就是糖的有氧氧化能力显著下降和糖酵解能力的增强，即所谓的“肿瘤细胞的呼吸功能障碍”。肿瘤细胞能量代谢以糖酵解为主，1克分子葡萄糖产生2克分子ATP，是正常细胞糖消耗量的20倍, 使肿瘤产能量效率低，耗能增加– 引起能源失衡，恶病质。

二、肿瘤普遍存在能量代谢异常与线粒体功能障碍

早在1920年，Warburg就提出了“肿瘤细胞能量代谢最明显的特征是糖的有氧氧化能力显著下降、糖酵解能力显著增强，即所谓的肿瘤细胞的呼吸功能障碍”这一假说（Warburg 效应），并推测这种障碍可能导致细胞去分化，从而形成肿瘤，越来越多的证据表明，肿瘤代谢异常与其线粒体的结构与功能的改变有密切关系。

在大多数肿瘤, 如在乳腺癌、肾癌、大肠癌中OXPHOS 复合体V中的ATP合成酶β表达减少；相反，肿瘤细胞糖酵解能力显著增强，是正常细胞的20倍~30倍，即便是在有氧情况下仍然以糖酵解作为获取能量的主要方式, 其中三个关键酶——己糖激酶(Hexokinase, HK)、磷酸果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PK)活性显著增强。研究表明，糖酵解的增强与肿瘤的生长速度成正比，与分化程度成反比。在高生长率的肿瘤细胞中，其糖酵解率的增高依赖于增强的葡萄糖转运和己糖激酶活性，其中70%的己糖激酶活性结合于线粒体外膜，而在正常肝细胞线粒体中则检测不到己糖激酶活性。由于肿瘤有氧氧化障碍，可以反馈性地诱导葡萄糖转运蛋白(Glucose transporter, GLUT)表达，从而增加对葡萄糖的摄取，导致肿瘤对糖的依赖性大大增加。

起初有人认为 “肿瘤细胞存在线粒体呼吸功能障碍” 是肿瘤细胞转化带来的副效应，或者是源于控制细胞摄取葡萄糖的信号转导途径的分子的致癌性突变或者控制糖酵解基因表达的转录因子的突变，后来越来越多的研究显示，肿瘤的能量代谢异常与线粒体功能障碍有非常密切的关系。线粒体功能障碍往往伴随着线粒体结构、数量以及OXPHOS酶链蛋白的改变。目前发现的可能机制有：(1). mtDNA突变。线粒体是氧自由基(ROS)产生部位，易引起mtDNA的损伤，在肝癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌等大多数肿瘤中普遍存mtDNA的突变，其突变率是p53的200倍, 其中mtDNA的转录调控区域(D-loop)突变率最高, 因该区域负责mtDNA的转录和复制，D-loop突变降低了mtDNA拷贝数, 使nDNA与mtDNA编码的OXPHOS酶链蛋白组分比例失调，如肿瘤细胞中nDNA编码的线粒体呼吸链关键酶COX明显高于由mtDNA编码的COX的亚基，组装成功能低下或无功能的呼吸链复合体，使肿瘤氧化磷酸化水平降低。另外，在多种肿瘤组织中，编码线粒体OXPHOS酶链的nDNA突变、核基因对线粒体结构和功能的调节异常，如在遗传性嗜铬细胞瘤、结直肠癌等肿瘤中编码线粒体OXPHOS酶链成分细胞色素b的小亚基(cybS)的核基因SDHD有突变；由此径造成了异常的糖酵解表型。(2).癌基因的异常调节很可能就是Warburg效应和肿瘤恶性转化的驱动因素。近来发现有多个癌基因通路如Ras, Src, 和myc通过稳定缺氧诱导因子1(HIF-1)促进肿瘤恶性转化和无氧糖酵解。p53是重要的抑癌基因，不仅参与细胞的增殖与凋亡的调控，也参与线粒体呼吸调节。SCO1以及SCO2这两个携铜蛋白(copper-carrying proteins)，与铜离子的调控有关。线粒体COX也需要铜离子来维持其活性，而SCO1及SCO2正好就是组装COX的重要蛋白, p53 调节SCO2的表达；p53基因突变和失活出现于大多肿瘤中，由此可能是导致肿瘤线粒体呼吸功能下降的原因之一。

三、NRF-1, NRF-2 转录调节细胞线粒体氧化磷酸化呼吸功能和线粒体的再生

线粒体OXPHOS酶链蛋白由线粒体DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)和细胞核DNA (Nuclear DNA, nDNA)双基因共同编码。核呼吸因子1 (Nuclear respiratory factors 1，NRF-1)和2 (NRF-2)是转录调控nDNA和mtDNA编码OXPHOS系统的转录因子，以保证细胞线粒体功能完整性及其正常线粒体增生。线粒体是真核细胞内唯一的由mtDNA和nDNA双基因调控的细胞器。线粒体OXPHOS由13个mtDNA编码 和近74个nDNA编码的蛋白亚基组成，分布在OXPHOS的五个复合体中。mtDNA是一条长为16569bp的环状双链DNA分子，分为编码区和调控区(D-loop)，mtDNA的转录和复制受mtTFA调控。NRFs通过转录调节nDNA编码的OXPHOS组分以及mtTFA实现对线粒体的功能调节。

NRF-1由503个氨基酸组成，分子量为68kD，在细胞内以同源二聚体的形式存在，有DNA结合域和转录激活域两个功能性区域。NRF-1最早是在研究细胞色素C (Cytochrome c，CytC) 启动子突变和DNA结合分析时发现的，后来在细胞色素氧化酶(Cytochrome c oxidase, COX) COX Vb, VIc, VIaL，mtTFA (线粒体转录因子A, Mitochondrial transcription factor A)，mtTFB (线粒体转录因子B), 5-氨基乙酰丙酸合成酶 (5-ALAS)、人琥珀酸脱氢酶铁蛋白、ATP合成酶γ亚单位，真核细胞翻译启始因子eIF-2α、以及线粒体RNA加工内切酶等许多与线粒体呼吸功能有密切关的基因上也发现NRF-1的结合位点(MRP)。COX是唯一能将电子传给CytC氧分子、产生ATP的限速酶。

NRF-2是另外一个对呼吸链起重要转录调节作用的转录因子，能专一识别富含GA的核心序列(A/C)GGAAG结构，此序列是Ets (E26 transformation-specific, Ets)家族转录因子的特异性结合位点, 故又名GABP。NRF-2有五个亚基(α、β1、β2、γ1和γ2)；α亚基具有DNA结合和转录活性，但无核定位信号；β亚基有核定位信号，但不具有DNA结合能力；α依赖于与β亚基结合，形成α₂β₂ 异源四聚体进入细胞核与靶基因结合发挥转录活性，γ属调节性亚基。NRF-2能够直接激活COX IV, Vb, VIaL, VIIaL, 和VIIc的转录，并通过转录激活mtTFA和mtTFB间接调节mtDNA编码的三个COX I, II和III的转录。另外，NRF-2还参与ATP合成酶亚单位，琥珀酸脱氢酶多个亚单位，以及限速性血红素合成酶的转录。通常，在NRF-1转录调节的靶基因的启动子结合区也同时含有NRF-2的结合位点，两者呈串型排列，以获得对靶基因的最大转录活性。

mtTFA以及mtTFB与mtDNA转录调控区(D-Loop)结合，调控mtDNA的转录和复制。mtTFA，mtTFB基因的启动子区含有至少NRF-1，NRF-2和Sp1结合位点，其转录活性高度依赖于NRF-1和NRF-2, 其中NRF-1起决定作用。因此，NRF-1与NRF-2通过直接作用于nDNA编码的线粒体OXPHOS酶蛋白基因，以及通过mtTFA，mtTFB间接转录调节mtDNA编码的线粒体OXPHOS酶蛋白基因，参与线粒体氧化磷酸化和能量代谢的多个基因的协同转录调节。

由于线粒体NRFs-OXPHOS系统构成和调节机制的复杂性，理论上，任何一个组分在其基因转录、翻译以及转录调节过程中的任何一个环节出现失调都可能导致细胞呼吸功能的异常。至于肿瘤细胞的能量代谢异常是否与线粒体呼吸链复合体的转录调节异常有关目前尚不清楚。但已经发现，在甲状腺嗜酸性细胞腺瘤、非小细胞肺癌中NRF-1表达明显升高，在大鼠肝癌中NRF-1、NRF-2及mtTFA也高表达。

四、线粒体 - 肿瘤治疗的热点

众所周知，线粒体不仅是提供细胞赖依生存所需的“能量加工厂”，也是引发细胞凋亡的“引爆器”, 细胞的凋亡依赖于细胞OXPHOS。线粒体氧化磷酸化是进行有效的凋亡所必要的，线粒体中呼吸链中ROS的过度生成、线粒体膜通透性转运孔(permeability transition pore，PTP)异常开放、凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)与线粒体细胞色素C释放等的一系列过程，在细胞凋亡乃至死亡过程中起了关键性的作用。肿瘤细胞的持续生长可能就与线粒体功能受损导致凋亡抑制有关，线粒体功能的障碍也增加了肿瘤细胞对凋亡的抵抗性。正如Warburg早期所观察到的那样，一些研究表明肿瘤细胞的线粒体能量代谢异常表型与肿瘤发生和演进有关。由于肿瘤细胞线粒体功能障碍，使凋亡功能下降或产生了对凋亡的抵抗性，因而，逆转肿瘤细胞OXPHOS功能促进肿瘤细胞凋亡或彻底抑制线粒体功能也自然成为了肿瘤治疗的靶点，目的在于“断了肿瘤的活路(Cramping tumours)”。

针对线粒体参与细胞代谢、生长和凋亡这一过程，人们开始寻找一些可以通过线粒体靶点原理改变肿瘤细胞的生长活性甚至诱导肿瘤细胞凋亡达到治疗肿瘤的药物。一些研究者已经设计出靶向性较强的线粒体靶点药物，作用于线粒体膜或线粒体内酶复合物，主要通过调节线粒体呼吸链功能、代谢酶活性、膜通透性来实现抑制线粒体呼吸、促进线粒体依赖性凋亡，用于抗肿瘤, 是克服肿瘤治疗过程中凋亡耐受的一种新方法。

肿瘤细胞对糖的明显依赖性和对线粒体有氧代谢的非依赖性也促成了抗肿瘤药物的研制。事实上，有些抗肿瘤药物所产生的效果是通过逆转肿瘤细胞的能量代谢来实现的。研究显示，肿瘤细胞通过ROS启动凋亡程序需要OXPHOS，增加肿瘤细胞OXPHOS产生的ATP的能力, 可提高肿瘤细胞对凋亡的易感性，抑制肿瘤的生长；另一方面, 抑制糖酵解，如在小鼠乳腺癌细胞系中，降低乳酸脱氢酶A的表达可以促进线粒体能量代谢，降低其成瘤性。

五、肿瘤呼吸功能障碍在诊断和治疗中的应用

靶向线粒体转录调节治疗肿瘤。虽然上述以肿瘤线粒体的靶点治疗的方法已经取得了一定效果，但目前针对线粒体作为靶点的治疗手段均未从源头上或者从根本上“断了肿瘤的活路”。选择NRFs作为肿瘤线粒体基因治疗的目标，是从线粒体基因转录水平入手，好比“釜底抽薪”，是一种理想的选择和全新的尝试。NRF-1和NRF-2不仅参与呼吸链蛋白表达调控，还参与细胞周期、细胞的生长、以及细胞凋亡等有关的多种基因表达的调控或的调节。有针对性的选择NRF-1和NRF-2作为肿瘤基因治疗的靶点，可以克服以上以肿瘤线粒体作为靶点治疗的弊端，兼顾了“转录因子” 和“线粒体”作为肿瘤治疗靶点的特色的一种创新性的有机结合，以达到从源头上即基因转录水平遏制肿瘤的目的，有望成为肿瘤治疗的新策略。

医学精品讲座，第四军医大学出版社 出版时间 2008年9月