现用狂犬病疫苗能否针对新型狂犬病毒提供有效保护？

原文题目：

Cross-neutralization of antibodies induced by vaccination with Purified Chick Embryo Cell Vaccine  (PCECV) against different Lyssavirus species

（鸡胚细胞纯化疫苗(PCECV)诱导的抗体对不同丽沙病毒的交叉中和作用）

原文发表的杂志：

Human Vaccines & Immunotherapeutics, 2014, 10:10, 2799-2804.

背景：狂犬病是一种被忽视的人畜共患疾病，由丽沙病毒属病毒引起。在亚洲和非洲的流行国家，估计每年有6万人死于狂犬病，其中大多数是由狗传播的经典狂犬病毒引起的。在过去的十年里，又陆续有丽沙病毒属的新病毒被发现。在这期间，总共有15种提议或正式分类的丽沙病毒存在，包括澳大利亚蝙蝠丽沙病毒 (ABLV)，欧洲蝙蝠丽沙病毒 (EBLV-1型和EBLV-2型)，杜文黑基病毒(DUVV)，以及拉各斯蝙蝠病毒(LBV)和莫科拉病毒(MOKV)，还有最近发现的新病毒如Bokeloh蝙蝠丽沙病毒 (BBLV)， Ikoma蝙蝠丽沙病毒 (IKOV)或Lleida蝙蝠丽沙病毒 (LLBV)。

这些丽沙病毒大部分存在于蝙蝠储存宿主中，有些曾导致人类感染和死亡。已有研究表明，纯化的鸡胚细胞狂犬疫苗(PCECV)不仅能诱导针对经典RABV的免疫应答，还能诱导针对ABLV、EBLV-1和EBLV-2的交叉中和抗体。

材料和方法：使用与我们之前研究相同的血清样本，本研究扩展研究了血清抗体的交叉中和活性，通过快速荧光灶抑制试验(RFFIT)检测对选定的感兴趣的其他非经典丽沙病毒，即DUVV和BBLV，以及MOKV和LBV的交叉中和活性。

结果：PCECV疫苗接种后产生的抗体对BBLV和DUVV具有中和能力，与对ABLV、EBLV-1和EBLV -2具有相同的中和能力。正如所料，对于系统发育距离较远的病毒如LBV，没有发现交叉中和活性。有趣的是，在对RABV中和抗体效价为阳性的94个血清样本中，有15个样本(占16%)对一种特定的MOKV株(埃塞俄比亚分离株)具有特定的交叉中和活性(比对RABV的交叉中和活性低65倍)，而对另一种不同的MOKV株(尼日利亚分离株)则没有这种活性。

结论：交叉中和活性与病毒种间的系统发育距离部分有关。针对遗传谱系1的物种BBLV和DUVV的交叉中和活性被证实，与之前对ABLV和EBLV-1和EBLV-2的交叉中和活性的结果一致。某些遗传距离更远的丽沙病毒，如特定的MOKV毒株，具有潜在的部分交叉中和活性，对此还需要进一步研究。

前言　　

据世界卫生组织最新估计，全世界每年约有6万人死于狂犬病。这些人的死亡大多发生在亚洲和非洲的发展中国家，通常由自由漫游的狗传播。在欧洲，狂犬病主要由狐狸传播。在中欧和西欧，在过去十年中，许多国家已成功地消灭了狗和狐狸中的狂犬病，因此许多欧洲国家已摆脱了陆生动物中的狂犬病。然而，蝙蝠狂犬病仍然呈地方性流行，人们普遍认为蝙蝠是丽沙病毒的主要进化宿主。

与其他已正式分类或提议的丽沙病毒一起，丽沙病毒属由15种不同的病毒组成。在欧洲，导致蝙蝠狂犬病的丽沙病毒种类是欧洲蝙蝠丽沙病毒1型和2型 (EBLV-1和EBLV -2)。2010年，一种新的丽沙病毒被发现，它在德国首次被发现后被命名为Bokeloh 蝙蝠 丽沙病毒 (BBLV)。最近，BBLV再次在德国巴伐利亚和法国东北部的蝙蝠中被分离到。其他的新病毒Ikoma蝙蝠丽沙病毒 (IKOV)是2009年在一只非洲灵猫（civet）中得到鉴定， Lleida蝙蝠丽沙病毒 (LLEBV、未分类)是2013年在西班牙弯翅蝠（bent-winged bat）中鉴定。在美洲蝙蝠传播的狂犬病主要是经典狂犬病毒(RABV)，在澳大利亚，陆生动物中的狂犬病被认为已经消灭，而蝙蝠则是澳大利亚蝙蝠丽沙病毒 (ABLV)的储存宿主。

在非洲，蝙蝠中发现了杜文黑基病毒(DUVV)、希莫尼蝙蝠病毒(SHIBV)和拉各斯蝙蝠病毒(LBV)。莫科拉病毒(MOKV)是唯一一种没有在蝙蝠中发现的丽沙病毒，在非洲主要在鼩鼱和灵猫中发现。基于它们的基因和抗原差异，提出了丽沙病毒形成4个不同遗传谱系(phylogroups，关于遗传谱系关系和遗传谱系分类见图1)。这15种丽沙病毒中，能引起人类死亡的有RABV、 EBLV-1和EBLV -2、ABLV、DUVV、IRKV(都属于遗传谱系 1)和MOKV (遗传谱系 2)。

已经开展了关于针对不同丽沙病毒属成员的血清交叉中和作用研究。含有灭活的RABV的人用狂犬病疫苗已被证明可引起足够的狂犬病毒中和抗体(VNA)浓度，不仅针对经典的RABV，而且针对遗传谱系1的其他病毒即EBLV-1和EBLV-2以及ABLV。疫苗的交叉保护被认为存在于遗传谱系1的所有病毒中，但尚未显示出对所有其他病毒也都有交叉保护。

在本项研究中，使用了在之前的研究中相同的血清样本，已经证明了针对ABLV EBLV-1和EBLV-2的交叉中和作用。此次调查的目的，是看相同的交叉中和作用是否也适用于遗传谱系１的丽沙病毒BBLV和DUVV。作为对基本概念的一种证明，对LBV和MOKV作为与RABV亲缘关系较远的遗传谱系2的成员也进行了测试。虽然并没有指望针对这些病毒会发生交叉中和作用，但据我们所知，此前也从未进行过这样的研究，因此我们在目前的研究中包括了这两种病毒。

结果

PCECV诱导了针对BBLV和DUVV的交叉中和活性。所有对经典狂犬病毒(RABV)中和活性为0.5 IU/mL的血清样本(接种疫苗后认为免疫反应足够的浓度)也能中和DUVV(病毒中和活性为0.5 IU/mL；n＝ 94/94)。

94份血清中有88份(94%)都具有针对BBLV的交叉中和浓度0.5 IU/mL，而有6份血清样本(6%)未达到认为适当的VNA浓度(0.5 IU/mL)。然而，VNA浓度明显高于未接种疫苗的对照组(数据未显示)，并与RABV攻击病毒株(CVS)的中和活性进行了比较。

在RFFIT检测中以LBV作为攻击毒株时，所有血清针对LBV和MOKV的交叉中和反应均为阴性，即未检测到交叉中和活性。使用实验室编号为 12850的MOKV作为攻击毒株时，大部分血清也呈阴性。然而，其中的15份血清样本(16%)对该分离物检测呈阳性(滴度在17.9到1078之间，几何平均值为169)。这一发现在用相同的病毒分离物重新检测时也得到证实。针对MOKV的中和效价比针对RABV的效价要低60- 70倍，而且MOKV阳性样本仅出现在狂犬病毒VNA效价>1:1000的样本中。在设定截止值为1:5000时，26个高滴度样品中有13个(50%)对MOKV呈阳性滴度。这一发现通过在不同的日期重复检测阳性样本得到了证实，获得的结果相同。当使用不同的MOKV分离物12868时，没有发现交叉中和活性。

图1.　利用贝叶斯推理（Bayesian inference）重建所有具有代表性的丽沙病毒遗传关系图。

15种丽沙病毒分属4个遗传谱系 (phylogroups)，图中用虚线和数字1－4表示。

有12种病毒是基于核蛋白基因的前405个核苷酸作了调整。节点数表示后验概率（posterior probabilities）。 比例尺表示每个位点的期望替换数（expected number of substitutions）。

15种病毒的简称和全名对照： 

讨论

人类死于丽沙病毒感染的绝大多数是由经典狂犬病毒RABV引起的，主要是在与狗接触之后。然而，其他丽沙病毒种类也可导致人类感染，人类在接触ABLV、EBLV-1和-2、IRKV、DUVV和MOKV后都曾发生悲剧性的死亡。之前，我们证明了PCECV疫苗诱生的抗体对ABLV和EBLV-1和-2具有交叉中和能力。最近在德国的纳特瑞蝙蝠（Natterer’s bat ）(Myotis nattererii)中发现了一种新型丽沙病毒，命名为Bokeloh 蝙蝠丽沙病毒(BBLV)。

早先已经证明用经典狂犬病毒 (RABV) 生产的疫苗诱导的人抗体对EBLV-1和EBLV-2和ABLV具有交叉中和活性，在本项研究中，首次对此类抗体针对DUVV和BBLV的交叉中和活性进行了试验。使用了与之前研究相同的血清，该研究源于PEP研究。就本研究而言，受试者是否接受暴露前或暴露后预防方案以及在什么时间点采集血清样本并不重要。直接与ABLV和EBLV-1和EBLV-2结果进行比较，对相同的血清样本进行相同的检测。

一般来说，狂犬病疫苗接种引起的抗体对遗传谱系1所有病毒的的交叉中和活性已经被证明或可以推断。然而，对于IRKV感染，研究表明，只有常规的预防性处置PrEP (3剂疫苗，第0、7和28天)才能对IRKV感染产生较强的保护作用，而只有非常高剂量的RABV免疫球蛋白才能对动物产生部分保护作用。需要类似的实验研究来证实对BBLV的交叉保护。

为使VNA浓度达到最低，本对照血清调整为对CVS-11为0.5 IU/mL, 对BBLV为2.5 IU/mL, 对DUVV为20 IU/mL。然而，这不应该被误解为VNA浓度的截止（cutoff）值。虽然血清可能只能在较低倍稀释(较高效价)的情况下中和其他病毒，但在血清浓度低至0.5 IU/mL时，可以看到对DUVV或BBLV有中和活性。因此，得出这样的结论是不合适的：于DUVV，适当的RVNA浓度需要20 IU/mL的血清浓度(常规RFFIT测量)。最重要的是，这不应该被误认为是获得保护所需的截止浓度。

虽然在经典的RFFIT中，使用CVS-11作为攻击毒株，VNA浓度0.5 IU/mL被认为是足够的，但这并不一定意味着在这个截止值以上就可以保证有保护或低于这个截止值就肯定没有保护。这也适用于使用不同丽沙病毒的改良的RFFIT：并不存在确定的“保护水平”。

针对遗传谱系2的病毒，甚至是新引入或提出的遗传谱系3或遗传谱系4，迄今为止还没有发现抗体的交叉中和，也没有提出这样的假设，因为这些病毒在抗原上与RABV不同。例如，曾提出在糖蛋白膜外结构域内72％－74%的氨基酸序列的一致性才能确保丽沙病毒间发生交叉中和。我们的研究证实了LBV缺乏交叉中和，即没有一种血清能够交叉中和LBV。在这方面，有趣的是我们发现对MOKV(编号12850，从埃塞俄比亚分离)具有部分的交叉中和活性。然而，当使用不同的MOKV毒株(12858，从尼日利亚分离)时，却没有发现有交叉中和活性。

由于是在欧洲的立陶宛进行的首次研究，此次用的血清也是从那次的研究中获得，可以排除试验参与者会接触MOKV(暴露于MOKV / MOKV感染)，因为MOKV只在非洲发现。交叉中和活性的一种可能的解释是，该MOKV分离物中的糖蛋白具有一些保守的区域，一些受试者偶然产生了对这些区域具有一定亲和力的抗体，从而产生了中和能力。事实上，通过对推导出的氨基酸序列进行的比较发现，在抗原II位点(氨基酸 34 －42)和III位点(330－ 338)各发现2个氨基酸替代(数据未显示)。

亲和度可能由于不完全匹配而降低，这说明(1)只有一部分血清对MOKV表现出交叉中和活性，(2)交叉中和仅出现在具有近2个对数尺度的高效价血清中(比中和所需的高60- 70倍的效价)。据我们所知，RABV和MOKV之间的这种部分交叉中和以前从未被证明，这些发现需要进一步研究。令人欣慰的是，至少对某些毒株可能存在某种程度的交叉保护。我们认为，那些疑似接触MOKV的受试者，例如，在非洲与鼩鼱有接触者，或与MOKV研究人员有接触者，都应当接种当前的狂犬病疫苗。

结论

综上所述，本研究证实PCECV能够诱导属于遗传谱系1的多种丽沙病毒的交叉中和活性。有趣的是，在遗传关系较远的丽沙病毒中，也发现了一些针对特定MOKV分离物的交叉中和活性。

材料和方法

在此项后续血清学研究中，使用了弗里德里希-洛弗勒（Friedrich-Loeffler）研究所曾用于研究针对EBLV-1、EBLV-2和ABLV的交叉中和活性的的同一批血清。诺华（Novartis）公司最初提供了100份人体血清样本，这些样本取自立陶宛一项健康受试者的临床试验，模拟暴露后预防(PEP)。所有受试者均接受了全程的PCECV(瑞必补尔)PEP接种。

有意选择的样品均匀且连续地覆盖0.5－500 iu /mL的效价范围。其中94份血清样本有足够的血清留作本次后续研究。采用改良的快速荧光灶抑制试验(RFFIT)检测个体血清样本中是否存在VNA，类似于之前用改良的RFFIT进行针对EBLV-1的检测，对BBLV (Lab-N: 21961;GenBank: JF311903)、 DUVV (12863;EU293119)、LBV (12859;EU293110)和2株MOKV (12850;KF155005和12868)都作为测试病毒进行了检测。除了使用不同的攻击病毒外，改良后的RFFIT是按照Cox等人的描述进行的。试验中使用的33种丽沙病毒样品是从FLI的病毒档案中获得的分离物。其中BBLV是作者所在小组首次分离到的。

所有病毒的细胞培养上清液都是从-80°С储存的原始大脑物质中提取的。为进行血清学检测，病毒在小鼠神经母细胞瘤细胞(NA 42/13)上传代不超过3次，以产生足够的滴度。特异性是通过未接种疫苗的个体的血清样本来确定的，结果对所有的攻击病毒都呈阴性(数据未显示)。对初始稀释倍数为1:10的血清再进行2倍连续稀释，然后在小鼠神经母细胞瘤细胞(NA 42/13)上进行一式两份的重复检测。

VNA滴度用血清稀释倍数的倒数来表示，显示体外试验病毒的荧光灶减少了50%，并使用反插值法计算准确的滴度。为了转换成国际单位，一种异源的世卫组织免疫球蛋白国际标准品(英国波特斯巴国家标准与控制研究所人类狂犬病免疫球蛋白第二批制剂)调整为对CVS-11为 0.5 IU/mL，对BBLV为2.5 IU/mL，对DUVV为20 IU/mL。

原文的链接： 

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.4161/21645515.2014.972741