Drug-like Properties (III): Disposition, Metabolism, and Safety

有人问我：工作之余你喜欢做什么？

要是细细数来，工作之余我会做很多事情，如果说喜欢就是多花一些时间在某个问题上，而不是professional，眼下我喜欢接触新知识（多半与Science相关）和回味历史（人物和故事），也喜欢和懂得讨论和分享的人们交流。

与其说中午zizz一会，还不如利用这会安静的时间，接着搜索一些自己感兴趣的话题。曾经看过一个无聊的电影，但片尾的一句话让我难以忘记：“拳打千遍，其意自现。”很多时候只有真的投入其中，你才会发现自己是否喜欢一件事，否则喜欢也只能称其为一时的感觉。

下面还是接着看看Drug Discovery的相关概念吧…

Transporters

既然有Trans，就感觉这里的转运面有着两面性：一个是进入（influx），一个是外排（efflux），她们与药物的吸收密切相关，在许多体内组织中都有足迹。之前提过药物被吸收主要是自由扩散的作用，对于一些特别的、稍大的营养物质还是需要转运蛋白的辅助，比如向内转运寡肽的PEPT1和PEPT2、转运有机离子的、胆酸的（NTCP）、核苷酸的、葡萄糖的（GLU1）的转运蛋白等，外排的如之前提到的P-gp和BCRP。一般说来，转运蛋白的工作需要消耗机体的能量（ATP），不过这些都是值得的（虽说少部分反应目前看来是累赘，不过我的直觉告诉我机体内的生化反应绝大多数都是值得的，人们需要认识这其中的规律与意义）。

考虑到发生转运的位置不同，比如小肠、肝细胞、肾、BBB等，药物的主动转运一般会影响体外ADME/Tox和体内PK的性征，通常有与天然底物具有相似结构的化合物更容易被转运、与转运蛋白亲和力高的机会也更大。若两种化合物需要利用同一个转运蛋白，还需要考虑DDI（Drug-drug interaction）。此外，细胞表面的转运蛋白的数量也是有限的，这也就会出现转运饱和的现象，一个好的化合物会充分利用influx transporter，避开efflux（市面上许多药物是转运蛋白的底物）。目前已经发现了许多转运蛋白，新的成员也在逐渐增加，这里面最为重要的应属“P-gp”。

顾名思义，外排作用的转运蛋白主要是将化合物运到细胞外面，他们属于ATP结合蛋白（ATP-binding cassette family, ABC）。P-gp，aka. MDR1和ABCB1，170 KD，1280 aa.，12跨膜结构域。化合物结合到她的结合区域时，细胞内结合并水解2个ATP分子，蛋白发生构象变化，化合物即被转运到细胞外侧。早期人们用化疗治疗癌症时，发现许多癌细胞接触药物后开始死亡，只是少部分细胞得意存活并扩增。后来人们发现P-gp在这些癌细胞中过表达，当时人们认为他是癌细胞对多种不同结构的药物产生抗性的主要原因。经过肿瘤学家的数十年的研究，揭开了该蛋白在药物研发中的作用，并发现她在体内多处表达，如BBB、大小肠、肝、肾、肾上腺和子宫等地方，主要起到保护机体的作用，这也是人们在设计此类靶点的药物时不得不考虑P-gp的作用。

Schematic diagram of P-gp

可能底物：N+O≥8, MW>400, Acid with pK_a>4

非底物：N+O≤4, MW<400, Base with pK_a<8

关于向内转运的蛋白人们关注力明显不如P-gp，哦想起来了，之前一次的报告讲述的就是二肽或三肽的转运蛋白（Di/TriPeptide Transporters），PEPT1和PEPT2，加入结构较小的肽会提升化合物转运的机会，增加生物利用度。曾经Ganciclovir口服后生物利用度仅有6%，连入一个二肽便提升到61%，实验证明这样的改变是由于PEPT的作用。

BBB（Blood-Brain Barrier）

只要涉及到大脑，神秘的地方太多，很多无法理解，可是事实确实存在。“中枢”二字，同意重合有强调之意，“中”和“枢”都有居中、重要、秘密之意，放在一起形容CNS确实很恰当（神经系统和行政部门、军队建制等地的功能非常相似），多少能理解在此处用药的难处。CNS disorders疾病不在少数，可能仅次于心血管疾病和癌症，在医药市场和科研领域都是炙手可热的方向，此处的BBB就是影响化合物吸收的主要因素，约有2%的药物可以顺利的通过此屏障，进入到脑部靶点，这也是脑部疾病恢复缓慢的原因之一吧。

Schematic diagram of a cross-section of a brain capillary microvesselthat constitutes the BBB

看着上面的结构，内皮细胞构成的毛细血管主要给脑部输送氧气和养分，细胞间的链接是更为紧密的Tight Junction，血管外紧紧的围绕着大脑细胞。脑部的血管交叉相连，有人估计脑部所有的毛细血管长度总和有400 miles，紧紧的包裹在12 m²的颅腔（神奇！）。若是提到脑部细胞的功能，单单涉及“记忆”的能力就足以迷倒一片科学家，许多现象无法用科学解释清楚，曾有人提到用量子生物学的方法研究大脑，就知道这片领域有多么的深奥了！可是人们还是不能放弃，因为老年人群有太多、太多的患者是中枢神经混乱，比如AD、比如Parkinson。

谈到BBB，能通过这一关的主要是小分子的自由扩散或是凭借转运蛋白进入脑细胞的物质，代谢成分则主要通过P-gp、MRP等外排蛋白运出脑外（外排的活性比物质进入的活性要高许多）。化合物想要混入中枢，需要非常好的隐藏，具有“朋友”的特征，通过各种关卡。

Rapid metabolism resulted in low brain exposure

常用的一些参数可以诠释化合物渗入脑细胞的能力，如B/P（drug ratio in blood and in plasma）、LogBB（Log(B/P)）、K_p和K_p,free等表示药物在脑部的分布，P_app（BBB permeability），PS（permeability surface area coefficient）和t_1/2eq.in（the half-time to reach equilibrium between free drug in brain andplasma）表示BBB的渗透能力。其中好的化合物B/P>0.3（也就是有30%的化合物进入脑部），有时也按照下面算法计算：

Metabolicstability

代谢的过程也是酶和底物反应的过程，直接影响化合物在体内的生物利用度、清除率和半衰期，主要发生在肝（也有的在小肠），代谢稳定性可通过修饰化合物的结构来优化。记得我刚到Pharmaron的时候，我曾经的部门“PK-ADME”举办了一次活动，好像叫生物技能实验大赛，反正是学习，我啥也不懂也跟着报了名，其中一项比赛就是“Met ID”。当时一头雾水，现在看起来有些眉目了。如今Lilly也在做着微粒体代谢相关的实验，多少了解到这个过程对任何一个进入血液循环的化合物而言都是躲不开的。

药物代谢（drug metabolism）也常被称为生物转化（Biotransformation），分两部分：直接修饰化合物本身的Phase I代谢，如氧化、还原、水解等，和结合极性基团的Phase II代谢，终极目的是让化合物更易溶于水再经肾脏排出体外。

Phase I中关键的酶是单氧酶（Monooxygenase），主要分cytochrome P450（CYP 450）家族和flavine monooxygenase（FMO）家族。CYPs的成员多达400余种同工酶（Isozymes），存在于哺乳动物、昆虫、植物、酵母和细菌等生物体内，主要依靠活性中心的亚铁血红素作为媒介传递氧气，NADPH在此过程中提供还原H。一个化合物可能被多种酶催化，这里就存在选择性的问题，多种药物同时供给时也就需要考虑DDI的事宜了（曾经看到消息称DDI也曾是药物被撤回的主要原因之一）。Phase II代谢主要向化合物转移一些极性基团，如葡萄糖醛酸会添加到芳香烃或烷烃的羟基、UGTs转移羧基、硫酸根、谷胱甘肽等可以被添加到活跃的原子上。（主要几类反应附后）

Mechanism of catalytic cycle for CYP450 reactions.

(from Guengerich, F. P., & Johnson, W. W. (1997). Biochemistry 36, 14741–14750）

化合物代谢的稳定性影响着他的pharmacokinetics（PK）特性，他与药物的清除率（Clearance, Cl, ml/min/kg）成反相关。Cl与化合物的分布体积（volume of distribution, V_d）直接影响PK中的半衰期（half-life, t_1/2=0.693×V_d/Cl,min），间接表示给药时间段与频率；Cl与化合物的吸收（Absorption）会直接影响口服生物利用度（oral bioavailability, F），间接显示每次给药量。一般而言，人们希望在项目开展的早期提高化合物在体内、外的稳定性，对新和成的化合物会在体外分析可能将其代谢的酶（多数是确认那种CYP，俗称CYP phenotyping），在项目的后期，会关注不同化合物之间的DDI。体外常用的方法就是肝微粒体实验技术，利用肝细胞的亚组份（内部含有大量的I相代谢酶）或肝细胞间接显示化合物在肝中的代谢情况，为Lead optimization提供数据，利于Chemist重新优化化合物的结构，提升化合物的代谢稳定性。

Schemes for the diagnosis of in vivo PK performance using metabolicclearance

（From van de Waterbeemd, H., & Gifford, E. (2003). Nature ReviewsDrug Discovery 2, 192–204）

代谢这一块涉及太多的（生物）化学，每当看到化合物结构和电子转移的图我就自动发晕，就是因为基础不牢固。不过对于肝脏代谢过程，我感觉很神奇。在人们不知道CYP的时候，这些酶就已经存在，并且辅助体内物质代谢的功能。诸如3A4、2D6、2C9、1A2等CYP是人们后来在研究药物的时候逐渐发现的，如今这些酶被单拿出来再体外分析化合物在体内可能的代谢产物、可能的清除率、可能的代谢稳定性，是不是感觉人们真的很“狡猾”？现在倒是有种感觉，体内很多“分子们”、“酶们”在协作，维持着人们保持“人”的形状，若是这里有任何一个部分发生问题，“人”将不再是“人”；若是其中的协调平衡被打破，“人”这一统一的个体将不复存在。

话说回来，但凡是不同“个体”间的合作，总是存在漏洞或空子，而化合物就是利用这里面的空子，按照人的意识攻入体内。与其说人们的科研精神永无止境，倒不如说人们的野心不会止步。人们希望更清楚的认识自我，希望掌控自我和他人，或许这是有意识的生命体的共性。有时会想：科学，值得相信吗？若是你了解的科学并不完整或目前并非正确，她还值得相信吗？有可能人们之所以对相信科学，是他们实在没有办法相信其他领域。你让科学家相信God会帮助你发文章、赚职称，可能吗？

TJ Pharmaron

2016年4月28日星期四