回顾发展工业酶的新途径过去20年

         杨顺楷   四川   成都

最近，个人整理参加过新世纪初的酶学与酶工程发展方向讨论会论文集时，阅读了首篇由中国科学院微生物所一位领导的主旨报告“发展工业酶的新途径”，基本上涵盖了当时国际上有关该领域所涉及的研究方向及新技术手段，以及由这些新进展可能够导致人们对酶在工业上应用巨大吸引力，以至于发展到近年国内外高潮迭起的“合成生物学”浪潮。

综观整个国内在这方面的研发工作，承担了国家攻关项目和重点课题的院校团队，基本上都建立起酶基因组测序，定向进化（DNA 重排/ 高通量筛选），噬菌体展示技术，以及对传统不可分离微生物的宏基因组技术，引进未经培养微生物的DNA 克隆，经由遗传重组到业经培养到驯化的宿主生物体（异源表达），试图发现新酶具有工业生物技术用途。这些都是比较积极的一个方面。

然而这些阶段研究结果，真正达到与企业结合，发展成为一个工业产业方向的研发成果仍然不能令人满意。个别生物化工中试项目，国家和地方支持数百万经费，项目到时不能验收，表明应用基础研究工作很不扎实。多数发表论文和培养毕业研究生数目倒是很可观。从这篇论文集中，过去了20年，其中的老一辈主研人员已经纷纷过世，年富力强一辈多都脱离原有团队“飞向南方”，情况令人很不乐观，这就是现实。

本文仅就个人职业道路过去20年，在国家自科基金（面上）资助发端的有关研究开发微生物单宁酶，及其应用的阶段成果报告如下，可能具有一定的参考价值。

单宁酶主要来源于微生物，属水解酶类（EC 3.1.1.20），主要集中分布在曲霉属（Aspergillus）菌种，通常分离筛选符合食品工业安全性（GRAS）的黑曲霉（Aspergillus niger）菌株作为出发菌株，经过定向II级诱导发酵培养，制备的这种真菌单宁酶培养物（液态培养和固态培养），对于植物材料中的可水解单宁（hydrolazable tannins，分子量500-3000D,这是一类植物多酚类结构十分复杂的天然产物或称次生代谢产物，生源生理功能是植物进化的自身防卫作用）作为底物，可在温和的反应介质条件下，直接酶水解该底物的缩酚羧键、酯键，积累起显著数量的小分子优势代谢产物没食子酸（GA）和或小分子单宁酸产物，以及其他精细化工用途广泛的单宁酸等化合物。

已经圆满完成如下应用基础研究工作：

第一部分 发表学术论文、研究报告及参加工业微生物学及生物技术国际会议题录

1. 单宁酶产生菌的筛选和发酵条件研究[J]. 应用与环境生物学报，1998,4(4):386-389

2. 黑曲霉单宁酶高活性菌株的诱变选育[J]. 微生物学通报，2000,27（2）：105-108

3. 郭鲁宏.单宁酶的制备及酶法制取没食子酸及其丙酯研究[博士学位论文],中国科学院沈阳应用生态研究所（1999年）

4. 黑曲霉单宁酶的纯化及部分性质研究[J]. 四川大学学报（自然科学版），1999,36（3）：578-582

5. 利用固定化黑曲霉单宁酶制备没食子酸的研究[J]. 生物工程学报，2000,16（5）：614-617

6. 利用黑曲霉单宁酶酶法制取没食子酸的研究[J]. 天然产物研究与开发，2002,14（2）：58-60

7. yang sk（杨顺楷），yang，YL（杨亚力）. A novel enzymatic prosess:Bioconversion of ChineseGallodanin into Gallic Acid with Aspergillus niger Containing Tannase Activity[A]. 5^th International Symposium on Industrial Microbiology and Biotechnology. Book of ABSTRACTS[C]. Shanghai,China,2005,p.7

8. 青霉单宁酶高活性菌株的诱变选育[J]. 微生物学杂志，2006,26（1）：108-110

9．黑曲霉单宁酶产生菌的筛选及处理滇橄榄汁的研究[J]，天然产物研究与开发[J] .2006,18（suppl）：16-18  

10. 黑曲霉固体培养在滇橄榄果渣中生产水解酶及其应用[J].精细与专用化学品，2008,16（2）：28-29

11.余甘子资源植物的研究与开发进展[J].应用与环境生物学报，2008,14（6）：846-854

12.滇橄榄汁酶解产物没食子酸的TLC和GC测定[J]. 四川食品与发酵，2008,44（3）：51-53

13.微生物单宁酶研究现况及其在滇橄榄果酶法加工中的应用[J].食品与发酵科技，2010，46（6）：72-76

14.酶解辅助提取：单宁酶在中药可发酵产品加工中的应用[R]. 全国中药提取分离新技术、新设备交流研讨会会议论文集，P 96-99；2013年8月7-9日，浙江杭州

15.应用黑曲霉液体摇瓶培养生物转化余甘子初步研究（未发表资料）.2014年7月1日

第二部分 院地合作及与企业合作中间试验成果题录

1. 滇橄榄汁（酒）微生物酶法加工新技术；攀枝花市、中国科学院科技成果孵化资金项目；中国科学院成都生物研究所、攀枝花市宇森酒业有限公司. 2003年10月（验收地：成都）

2. 酶法转化五倍子单宁酸生产没食子酸中间试验（技术鉴定资料）项目；中国科学院成都生物研究所、成都和倍生化有限公司；2004年11月26日（组织鉴定单位及地点：四川省科学技术厅，成都），现将鉴定意见摘录如下：

“1.选题正确，技术方案合理，符合国家产业发展方向；提供的技术资料齐全，数据可靠，符合鉴定要求。

2.采用定向选育的黑曲霉高单宁酶活性菌种，经两级液体深层培养发酵（该培养物作为生物催化剂），在100L种子罐/500L发酵罐中，分批投料，完成了生物转化五倍子单宁酸生成目标产物——没食子酸（GA）的酶法水解加工过程；实验结果证明：该新工艺具有技术先进、产酸率高的特点，具备了小规模工业化生产的技术条件。

  3.成功地利用国产大孔吸附树脂D101进行目标产品GA的分离回收与精制，产品质量符合GB5309-85标准。

  4.作为生物催化剂使用的黑曲霉菌丝体可重复利用，这对生物反应器的工程设计提供了经济可行的操作模式。废弃的菌丝体具有可深度综合利用开发的特点和价值。

  5.该工艺和设备流程可行，适宜生产高纯度产品，GA的精品收率≧85%。

6.与现有的化学法工艺比较，该工艺废物排放量少，经适当处理即能达到环保要求。

  综上所述，本酶法生产没食子酸新工艺具有创新性，居国内同类研究领先水平。

  然而，自从国内2011年在厦门召开的全国精细化工会议上，希望我国2家承担了国内外最大的供货没食子酸和单宁酸原料产品企业（1万吨级/a),能将目前利用国产五倍子单宁和进口塔拉粉原料的化学法碱法水解工艺（高温高压高能耗高盐度废弃物污染环境），由生物制造先进工艺所替代。其后，上海猎头公司邀请了德国汉堡大学安博士和国内个人被邀先后顺序访问考察了该公司，提交了各自的阶段研究成果。由于没有国内健全的风险投资公司参与，此项目难于投入启动运转，且该公司被国内另外一家公司并购，从此了无下文。 

  另外一家公司后来也希望介入此生物制造项目，个人也同他们作了一些前期预研实验研究工作。但是鉴于个人已经退休多年，没有合适的实验室和可被认可的担纲的技术人员和团队，难于项目启动运作。这就是个人过去20年，在微生物黑曲霉单宁酶生物转化五倍子单宁或塔拉粉单宁底物，生物制造没食子酸产品及高纯单宁酸精细化工产品成果转化所遭遇的现实困境。