狂犬病实验室诊断的最新进展(5)

Recent updates on laboratory diagnosis of rabies

印度的M. A. Ashwini等在今年一月出版的专业杂志《Indian J Med Res （印度医学研究杂志）》上发表了一篇综述论文，题目是《Recent updates on laboratory diagnosis of rabie（狂犬病实验室诊断的最新进展）》（见本文末尾的参考文献）。要实现在2030年前在全球消除狗介导的人类狂犬病的宏伟目标，狂犬病的实验室诊断是首当其冲必须优先解决的一个重要问题。印度学者们的这篇综述论文对我们也很有参考价值。

现将此论文的主要内容分若干次译介如下：

 狂犬病的实验室诊断试验（Laboratory diagnostic tests for rabies）(1)

常规实验室检查在初始阶段可能显示都是正常的，除了轻微的脑脊液细胞增多和脑脊液中轻微的蛋白升高，这些都无助于诊断。为了确认是否患有狂犬病，需要进行特定的实验室测试，可对死前或死后获得的临床标本进行测试[1、7、8、11-13、26、41、53-66](表)。

狂犬病的实验室诊断只有在发病后才有可能；在潜伏期没有任何测试可以作出诊断。

1.　诊断形式（Diagnostic modalities）:

有多种技术可用于狂犬病的实验室诊断。大致分类如下:

 ①病毒抗原检测（Viral antigen detection）：

直接荧光抗体测试(FAT)是最早和最可靠的狂犬病死后诊断技术之一。即使在今天，它仍然是依据人类和动物死后样本确诊狂犬病的金标准［1，53］。它是基于在脑涂片的压印片（touch impression ）中检测狂犬病核蛋白抗原，使用特异性狂犬病抗体标记异硫氰酸荧光素，允许在荧光显微镜下显示抗原。另一种替代方法，直接快速免疫组织化学测试(dRIT)，利用生物素化单克隆抗体的混合物，可以在光学显微镜下观察。与FAT不同，dRIT不需要使用荧光显微镜，这使得在仅具有基本设施的实验室也能进行诊断测试。FAT可用于角膜涂片和颈部皮肤活检等样品中的抗原检测。然而，FAT在这些样本中的敏感性和特异性相对较低。此外，由于具有角膜瘢痕形成的潜在风险，不鼓励使用角膜涂片［1，12］。

狂犬病的诊断可以通过组织病理学检测在福尔马林固定的脑组织胞浆内独特的嗜酸性的包含体（inclusions ）来证实，此包含体也被称为“内基氏小体（Negri bodie）”。然而，阴性结果不能完全排除狂犬病的诊断。因此，尽管它作为狂犬病诊断的辅助测试是有用的，但不建议作为主要诊断测试［12］。

快速免疫层析诊断试验(RIDT)或横向流动试验(LFA)，特别是在野外环境中，对筛选动物的脑和唾液样本是有用的。这些简单易行的测试不需要昂贵的设备、试剂、冷链设施或技术专长［56,67-71］。在果阿邦进行的一项研究中，在常规监测期间，利用LFA(韩国Bionote的抗原快速狂犬病检测试剂盒)对狗进行死后狂犬病快速筛查。与金标准FAT相比，该测试的灵敏度为0.96[95%置信区间(CI): 0.91-0.99]，特异性为0.99 (95% CI: 0.94-1)[68]，与其他报道的结果相似[66,69]。然而，将各种市售RIDTs与金标准进行比较，揭示了灵敏度和特异性的显著差异［56,70,71］。从保存样本获得的结果，即使经过适当的冷冻，也可能不如新鲜大脑样本准确或理想。有必要进行进一步的验证研究，以评估这些检测方法诊断人类狂犬病的可靠性和性能。

②病毒特异性抗体检测（Detection of virus-specific antibodies）：

快速荧光灶抑制试验(RFFIT)或荧光抗体病毒中和试验用于检测脑脊液/血清样品中抗RABV的中和抗体［1,12,66］。

这些测试的性能受到各种因素的影响，例如所使用的细胞系的生长、实验室适应RABV的繁殖和滴定、样品质量(脑脊液和血清)、所使用的狂犬病偶联物、功能性荧光显微镜的可用性以及分析人员的技术专长和技能［12,57,72］。为提高安全性和减少对生物安全的危害，可以使用基于伪病毒的中和试验代替活RABV。这些检测涉及报告基因，并提供诸如更低的样本量要求和减少费用等优势，使其更适用于资源有限的实验室［57,59,72-74］。

间接荧光抗体(IFA)检测是一种简便、快速的检测RABV抗IgM和IgG抗体的方法。然而，由于与其他病毒性脑炎的交叉反应性，其特异性有限［75］。另一方面，ELISA可以检测糖蛋白和/或核蛋白的结合抗体，为具有基础设施的外围实验室提供了一种安全、易于操作且具有成本效益的替代方法［60,76,77］。

③病毒核酸检测（Viral nucleic acid detection）：

传统或实时逆转录酶(RT-PCR)、基于核酸序列的扩增、环介导的等温扩增和基于微阵列的检测是狂犬病病毒核酸检测技术中的几种方法［1,12,66,73,78-82］。在死前和死后样本中，在实验室确认狂犬病诊断的最常用方法是常规或实时RT-PCR。目前有几种针对核蛋白(N)基因或其他狂犬病相关基因的标准化PCR方案［40-43,61,66,73,83］。

聚合酶链反应（PCR）在唾液和颈部皮肤样本中表现出较高的敏感性，而在脑脊液、尿液样本和提取的毛囊中表现出较低的敏感性［7,8,12,62,81,83-85］。PCR技术可以应用于已分解、已自溶和存档的脑样本，而FAT可能无法对这些样本产生可靠的结果［1,8,12,66］。这些检测方法适用于储存在RNA溶液/缓冲液中的样品，以及在过滤器/FTA纸和横向流动装置试纸上收集和干燥的样品［66,67,86］。

最近在印度进行的一项试点研究［87］评估了一种便携式电池操作芯片对动物大脑样本进行实时PCR测定(Truenat；Molbio Diagnostics)。该研究报告称，与FAT［87］相比，其敏感性为92.3%，特异性为100%，诊断准确性为95.8%。然而，这种测定方法尚未被证实可用于人类样本。最近开发了另一种便携式实时RT - PCR (PCR1100 assay)用于狂犬病诊断，并在动物样本上进行了测试，据报道，使用脑组织的灵敏度和特异性为100% [88]。这些快速、用户友好且具有成本效益的分析方法消除了样品运输的需要，具有 提供分散的当地实验室服务的巨大潜力。这种检测可以方便地在护理点进行，减少了对中心实验室设施的依赖。这不仅节省了时间，而且最大限度地降低了运输过程中样品降解的风险。

（未完待续）

参考文献：

M. A. Ashwini, et al., Recent updates on laboratory diagnosis of rabies, Indian J Med Res 159, January 2024, pp **-** , DOI: 10.4103/ijmr.ijmr_13 

相关博文：

狂犬病实验室诊断的最新进展(1) 2024-02-25

狂犬病实验室诊断的最新进展(2) 2024-02-27

狂犬病实验室诊断的最新进展(3) 2024-02-29

狂犬病实验室诊断的最新进展(4) 2024-03-02