2018.1.11

本期作者：大汉武  胖丫

小麦白粉病也是经常威胁小麦生产的病害之一。普通小麦由于在长期的驯化选择下，其抗病谱资源变得很窄。小麦的近缘属种多为野生，往往包含了丰富的抗性资源。乌拉尔图小麦（Triticum urartu）作为普通小麦A基因组的供体祖先，从这个角度研究小麦是非常好的契机。中科院遗传所在2010年左右开始征集了几乎涵盖世界各地的乌拉尔图小麦300余份（王道文老师，个人交流）。这300余份材料为开展小麦的抗病抗逆等研究奠定了坚实的基础。

       结合乌拉尔图小麦基因组序列，唐定中老师对抗白粉基因Pm60进行了克隆。并在New Phytologist 上发表题为“The NB-LRR gene Pm60 confers powdery mildew resistance inwheat”的文章。

文章所用的F2作图群体是用抗病亲本PI428309和感病亲本G1812（2013年发表的A基因组测序用的也是这个材料）杂交创建的，感病对照为六倍体材料科农199。所用的白粉菌为BgtE09。见下图。

唐老师采用经典的图位克隆手段，首先利用259个均匀分布在1A-7A染色体上的SSR 标记筛选抗感池并发现位于中国春缺失系材料7AL18-0.90-1.00上的SSR标记Xwmc273.3与抗病位点关联，然后基于 7AL18-0.90-1.00 and 7AL16-0.86-0.90两个bin的位置进行开发额外的SSR和dCAPS标记，此外，利用小麦EST序列与A基因组比对获得大量的scaffolds，还比较了该区间短柄草的同源序列开发更紧密的标记。最终利用1882个感病单株成功将该位点定位在一个356kb大小的物理区间内，基因注释后发现该区间含有两个候选基因TRIUR3_00771和TRIUR3_00770，二者相距约27.19 kb，此处文中并没有交代该区间内是否还有其他基因。

作者根据TRIUR3_00771和TRIUR3_00770序列开发设计基因扩增引物，但是未能在PI428309材料上扩增出来。因此，作者对亲本PI428309进行了转录组测序，通过组装拼接后发现两个contigs与TRIUR3_00771和TRIUR3_00770具有极高的相似性（附件里有蛋白比对，感兴趣的可以去看看），并通过RACE获得全长后将这两个作为候选基因PmR1和Pm60，进一步分析发现PmR1和Pm60具有70%相似性，见下图。接着设计基因特异标记返回到遗传群体中验证，发现二者与表型共分离，再次确认PmR1和Pm60位于目标区间内。

为了进一步确认PmR1和Pm60哪一个是真正的抗病基因，作者利用定量PCR查看了抗病材料里两个基因接种后的表达量，发现前者诱导表达，后者基本不变。见下图。

接下来作者利用病毒介导的基因沉默和转基因技术证明只有Pm60是有功能的，见下图。

接着作者针对Pm60的全长及等位变异进行了过表达分析，发现其全长和另外两种等位变异均能引起烟草的细胞死亡反应。见下图

还利用酵母双杂和BIFC技术研究了Pm60和PmR1两个基因卷曲螺旋区（CC domains） 的互作。见下图。

      从应用的角度看，确实乌拉尔图小麦应用起来不是那么容易，但是转基因技术目前日趋成熟，也许将来某一天转基因技术可以放开应用到农业育种中，我们会很快将其应用。另外，从致病机理的角度出发，Pm60的克隆为揭示小麦与白粉菌的互作研究奠定了基础，只有我们拿到基因才能研究机制，正如文章讨论里说到的，在MLA10，RGA4和SR33等典型的抗病基因编码蛋白中，单独的CC-domain足以引发过敏性坏死反应，而Pm60蛋白却需要全长，这是为什么呢？生命的机制可能是极其复杂和多样的，需要我们不断去探索。

   解读就到此，毕竟不是专业做白粉病和图位克隆的，如有错误还请各位指正。实际上，今天读完之后有些地方小编还是没搞明白，比如，拿到Pm60之后，后面一系列的实验都只围绕抗病材料的基因做，完全没有去管感病材料的基因，也没有说明抗病材料和感病材料之间到底那些关键序列变异影响了抗病性的改变，以及Pm60与PmR1之间的互作是否影响抗病性，有明白的小伙伴还请指点下。也许这都需要进一步的研究才能搞定，小麦里做点基因功能真不容易啊。最近发表在PNAS上图位克隆Sr13文章和这里有些类似的地方（PNAS发表图位克隆Sr13的研究--一篇典型的图位克隆文章），都是先拿到的感病材料里的序列，不同的是，Sr13那篇文章里直接筛选了抗病材料的BAC文库，最后构建了覆盖目标区间的物理图谱，而本篇文章是利用转录组的方法拿到高度相似的基因序列，然后通过反向遗传学手段验证了拿到的高度相似的序列就是Pm60。抗病材料没有目标区间的物理图谱，还是有点遗憾的。

附：文章的封面图片由电子科大的杨足君老师提供，杨老师用他高超的技艺绘画出美妙的图片，生命是如此绚烂！在此，感谢杨老师长期以来对我们的支持与厚爱！

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