BSA结合高通量基因芯片分型技术-快速定位基因

建辉

       最近有好多同行加我好友向我咨询一些有关利用混池进行基因定位方面的具体细节。关于混池方面的论述，个人强烈推荐徐云碧老师发在Plant Biotechnology Journal上的综述，题为“Bulked sample analysis in genetics, genomics and crop improvement”，里面阐述非常详细。而在小麦领域里利用混池转录组测序（BSR-Seq）进行QTL定位的研究近年来也逐渐增多，中科院遗传所刘志勇老师课题组在此方面研究颇有建树，他的学生谢菁忠、周升辉等的博士论文，对于初学者很有帮助，我的博士论文也是关于这一方面的内容，感兴趣的可以在知网下载，欢迎交流。

       由于前期缺乏标记，导致在普通小麦中定位小麦基因是一个非常繁重的工作，更不要提精细定位了。随着测序等相关技术飞速发展，目前对于小麦的基因定位，可选择的方式也多了起来，比如利用芯片、转录组等。今天结合本人的一部分实验，聊一聊利用混池结合芯片的方式进行基因定位的具体细节。

       对于抗锈病的研究，如下图。首先最好选择两个表型差异明显的亲本进行群体创制，一般在F2代我们会在田间进行接种病害并初步的对群体进行一个简单的遗传学分析，对于符合或接近3:1的我们会在F2:3继续进行多点评估，而对于其他比例由于精力有限，我们暂时不做研究。其实这些群体后来基本上都采用单粒传形式创建了重组自交系群体。对于F2:3群体，会根据多个地点的表现选择表型一致的家系进行极端混池，即极抗和极感，根据我们的实验结果，混池一般5-10个家系，可以不必做重复。根据自身的时间和精力，可以将携带目标性状位点的供体亲本与多个受体亲本进行杂交，创建多个不同遗传背景下的遗传群体，再进行混池芯片分型，效果可能更好。我们也注意到有的区段在不同遗传背景下重组率差异很大。

       对于SNP芯片数据的分析，首先选出亲本间纯合的差异（杂合不做考虑），根据所做芯片提供的遗传图谱参考信息，统计标记在染色体上的分布（个人倾向优先利用遗传图谱信息）；在此基础上进行双池间差异筛选；按抗亲抗池或感亲感池需一致的原则再进行一轮筛选；统计差异标记在染色体上的分布，并计算池间差异标记占亲本间差异标记数目的比例，进行图形可视化；最后将可能的目标染色体上的SNP按照每cM或Mb进行滑窗统计，根据标记密度初步评估可能的目标区间，见下图。

       好了，初步分析就完毕了。接下来的工作就是根据可能的目标区间进行验证。下图是我们其中一个重组自交系群体经过660K芯片混池的结果。图中蓝色染色体无论从SNP数目和比例上都高于其他，在此之前我们对该群体进行了35K芯片全基因组扫描并定位了相关QTL，而全基因组扫描结果与混池的定位结果一致性较好。但毕竟这只是个例，后面我们会根据更多的群体芯片数据继续推送我们取得的结果及遇到的问题。其实现实情况远比说的要复杂，里面还存在很多问题，尤其对于普通六倍体小麦来讲。我们目前做的都是表型极抗的品种或材料，对于中度抗病即中间型的材料（有可能是多位点微效QTL）效果可能不好。欢迎大家质疑和交流，一家之言，仅供参考。

       胖丫群里说到一句，BSA适用于那些未被定位的基因或QTL，如果你已经有了初定位的结果或者精细定位的结果，混池就没多大必要了。

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