2011.12.6-12.8

 （说明：本文是对大约一年前的博文《研究基因功能的“四大绝招”（初步总结版）》的修改和补充，仍存在继续修改的可能。本文可能适合的读者是生物医学的科研新手和非生物医学领域的人。）

生命科学的研究有很大一部分集中于研究基因及其产物的功能。到底有哪些方法可以用来研究基因功能呢？本文初步总结为“七大绝招”和“三板斧”。掌握了这“七大绝招”和“三板斧”，设计实验更容易，看文献听学术报告也更轻松。

 

 

第一招： 天地人合

 

无论是学习还是研究，必须遵循的一个原则是“从生活中来，到生活中去”。学习的时候，如果与日常生活中熟悉的、简单的事情结合起来理解，就可以化繁为简，化难为易。学习的目的是为了应用，学到的东西，必须应用到日常生活中去。

 

怎样研究基因的功能？要回答这个问题，我们先看怎样研究人的功能。假如你是男生，喜欢上了一个“女生”，可是这个“女生”长得扑朔迷离，帅气中带着妩媚，羞涩中透出豪爽。所以，你面临的第一个问题就是：TA到底是男还是女？第二个问题是：TA是不是学生？如果是的话，是本校的吗？你不认识TA的任何朋友，所以也没法打听。为了回答这几个问题，你决定翘课跟踪TA。你发现，白天的大多数时间，TA去了本校教学楼的教室。你守在教室的洗手间旁边，观察TA下课的时候上洗手间，去的是男洗手间还是女洗手间。高兴的是，你发现TA去了女洗手间（终于松了一口气）。不过你比较小心，为防万一，你又跟踪她，看她晚上回宿舍去的是男生宿舍还是女生宿舍。不出所料，她去了本校的女生宿舍。这下你终于放心了：她是本校的一个女生。

 

因为她去女洗手间和女生宿舍，提示她是女的。因为她白天去本校教室，晚上去本校女生宿舍，提示她是本校女生。上述事例告诉我们：一个人什么时候，在哪里活动可以提示其身份。同样，基因表达的时间和部位，常常可以提示其功能。例如，如果基因A在胚胎发育过程中表达，成年后不表达，则提示该基因与发育有关。基因B在在大脑的海马中表达，而海马与记忆有关，那么这个基因可能与记忆有关。

 

接下来的问题就是：她是哪个系的？她有什么兴趣爱好？你发现，她有两个个形影不离的好朋友。你恰好有同学认识她的这两个朋友。同学告诉你：她两个好朋友都是中文系的，都喜欢打羽毛球。这时，你基本上就可以认为这个女生是中文系的，爱好之一是羽毛球了。

 

以上所述可以归纳为三点：天时，地利，人和。“天时”指基因及其产物什么时候表达，“地利”指的是基因及其产物表达于哪个部位。“人和”可以进一步引申为两点：1. 近朱者赤，近墨者黑。就是说一个人会与他经常接近的人相似。基因也是如此，相互作用的一些基因常常具有类似的功能，它们为了完成同一个功能而通力合作。例如，如果实验发现蛋白C与蛋白D相互结合，而基因D是某一信号通路的受体，则基因C可能也是该信号通路的成员。2. 近猪者吃，近墨者喝。就是说一个人不仅会经常接触与自己类似的人，还经常接触自己的工作对象。例如，一个经常与学生接触的人，既可能是学生（近朱者赤），也可能是老师（近猪者吃）。同理，与一个基因接触的其它基因或者物质，也可能是其作用的对象。例如，如果蛋白质F与DNA结合在一起，则提示其对DNA发挥作用，可能参与DNA复制、转录等。

 

“合”指的是合理。亿万年的进化使不合理的基因基本上都被淘汰了，所以存在的基因其功能必定是合理的，至少具有合理性的一面。合理的表现就是能够促进个体的生存和繁衍。合理遵循两个原则：一，经济原则。生物不会浪费物质和能量在一个无用或者冗余的基因上。凡是一个基因可以实现的功能，没有必要用两个基因。二，有效原则。基因的功能应该促进而不是损害生物的生存和繁衍。根据合理性原则，无需任何实验证据，我们不难想到非编码DNA序列是有用的，不是无用的垃圾。

 

 

第二招：患得患失

 

有人说，金钱不是万能的，但是没有金钱是万万不能的。那么，金钱到底有什么作用呢？有两种方法可以知道答案。第一种方法是你去一个陌生的地方，突然钱包被偷，所有的现金、信用卡和可以换钱用的物品都没有了。此时，你就知道钱的作用是什么了。第二种情况是你买彩票突然中了一千万，很快，你也可以知道钱的作用是什么。得到和失去，都可以让我们知道事物和人物的功能，而其中失去更为有效。

 

得，指的是基因的过表达（Overexpression）；失，指的是基因敲除（Knockout）或者低表达（Under-expression）。例如研究的假说是基因A与记忆力呈正相关，那么可以这样设计实验：先过表达基因A，预期结果是记忆力增强，再降低基因A的表达水平，或者完全敲除（如果不是lethal的话），预期结果是记忆力减弱。一个高质量的实验设计，一般应该“患得患失”，两方面的实验都要做。

 

我们不仅要“患得患失”，还要“斤斤计较”。因为过表达或低表达的水平不同，表型改变可能也不同，甚至看不到表型改变。例如，用RNAi Knockdown一个基因的表达水平的70%也许看不到任何变化，但是Knockdown 90%就能观察到表型改变了。所以，当过表达或者低表达研究基因却没有得到预期结果的时候，就需要考虑基因表达水平的变化是否不足。

 

有时即使完全敲除一个基因也看不到任何表型的改变，此时也不能下“研究基因与研究表型无关”的结论。这就好比一个桥有十个桥墩，如果只去除掉桥墩4，在非过负荷的情况下，桥可能不会倒塌，可以正常通车。可是，如果先去除掉桥墩5，再去除桥墩4，桥就会倒塌了。我们能够认为桥墩4是无用的吗？当然不能。桥墩在这里好比处于同一个通路具有相似功能的基因，桥是否可以通车好比基因的表型是否正常。所以，在敲除一个基因A看不到表型改变的情况下，可以在基因B（与A的功能具有相似性，或者是上下游的基因）敲除的动物模型上敲除基因A，观察敲除后是否有变化。

 

有时候，全身性的过表达、低表达或者基因敲除会出现我们不想要的结果。例如，全身性的基因敲除会致命。为了解决这个问题，现已开发出许多种组织特异性和时间特异性的过表达、低表达和基因敲除技术，使得基因调控更加准确。

 

 

第三招：上下求索

 

基因需要经过转录为RNA、翻译为蛋白质至少两步才能发挥功能。所以，研究一个基因的功能，就可以在DNA、RNA和蛋白质的水平分别进行研究。DNA的水平相同，不代表RNA的水平相同；同样，RNA的水平相同，不代表在蛋白质的水平相同。哪怕就是在RNA水平，还有不同的剪切的可能。

 

一个基因翻译成蛋白质之后，常常需要同其它的基因及其产物相互作用才能发挥功能。例如基因S，翻译成蛋白质S，如果它是配体，就需要和受体结合，然后受体激活信号通路。如果S鉴定出来了而其余的通路基因没有鉴定出来，那就可以研究上游的配体和下游的信号通路基因分别是什么。一个转录因子，常常可以激活或抑制一系列基因的表达，究竟可以控制哪些下游基因，也值得研究。蛋白质发挥功能，常常会有正性调控和负性调控因子。从上游来看，哪些基因及其产物可以促进或抑制研究基因的表达水平？具体机制是怎样的？从下游来看，哪些基因及其产物可以增强或者减弱研究基因的功能？具体机制是怎样的？这些都可以研究。

 

所以，研究一个基因，就可以在不同的表达水平和不同的作用水平上“上下求索”。

 

 

第四招：背井离乡

 

背井离乡，指的是misexpression，就是在非正常时间、非正常位置、非正常物种（时间、地点、人物）表达一个基因。如果在正常情况下，研究基因具有特定功能，而且在非正常时间、非正常位置和非正常物种间表达的时候同样导致该功能，则我们下“该基因具有该特定功能”的结论就更有把握。

 

值得注意的是，misexpression不产生预期表型，并不能认为研究基因与该表型无关。因为一个基因发挥作用，需要很多其它基因的帮助。如果misexpression的部位、时间、物种缺乏该基因发挥功能需要的辅助基因，或者多了可以抑制该基因功能的其它基因的表达，则可以导致预期表型无法产生。如果misexpression产生了某一表型，不代表该表型是该基因的正常功能，原因同上。所以，misexpression告诉我们：该基因“可以”做什么，不代表该基因实际上做了什么。打个比方，我们把一个教授放到农村去，他没法接触到做科研需要的设备、文献等，而且迫于生计，他不得不自己种田维持生存。我们能够下结论说：教授的社会职能是种田吗？当然不可以。但是我们可以说：教授是“可以”种田的。

 

 

第五招：内外兼修

 

体外实验（In vitro）简单便捷，可以很快得到结果。可是，体外实验的条件和体内的情况不一样，体外实验得到的结果一般还需要体内实验（In vivo）来验证。“内外兼修”指的是既做体外实验， 又做体内实验。这一招不是太常见，有些文章不一定同时做体内和体外实验。

 

 

第六招：十面埋伏

 

当你论证一个观点的时候，可能会有人反驳你。一篇好的文章，必须提前想到这些反驳，并通过做相应实验设下“埋伏”，反驳这些可能的反驳；此外，还应通过类似实验重复验证来增加结论的可靠性，这就叫做“十面埋伏”。

 

中医诊治病人，需要“望闻问切”，把四种方法得到的信息综合起来才能做出正确的诊断，这叫“四诊合参”。（题外话：电视剧里仅仅通过望诊或者仅仅把脉就开药的中医，基本上都是骗人的。实际生活中遇到这样的中医，可以判断为江湖游医。）历史学上有一个说法叫做“孤证不立”，就是说如果只有一条证据支持一个论点，那么这个论点是不可靠的。生活中，如果有一个人说某人有问题，他不一定真的有问题。可是如果很多人都说他有问题，那他就很可能真的有问题了。

 

如果仅仅从一篇文章的角度来考虑，做这么多的实验不是很有必要。例如，做了第一个实验，结论成立的可能性是80%，做了第二个，可能性上升到95%。可是，科研是积累性的，你的结论是别人推理的基础，你推理的基础则是前人的结论。假如A1引用了你的文章，A2又引用了A1的文章，如此反复一直到A10。如果每篇文章结论正确的概率是80%，则A10文章结论正确的概率是0.80¹⁰=10%，如果每篇文章结论正确的概率是95%，则A10文章结论正确的概率是0.95¹⁰=60%。差别从一开始的15%，变成6倍了。所以，多做实验增加结论的可靠性，对于科学的长期发展是至关重要的。

 

看文献的时候，你会发现作者做了一大堆实验，这么多的实验就像唐僧在你耳边念经一样，把你弄得晕头转向。为了提高看文献的效率，一般只看关键实验，次要的实验可以略过。当你做学术报告时，由于时间有限，只报告关键实验。等到观众提问时，这些次要实验就可以派上用场了。例如，听完你的报告，有听众提问说：“我觉得你的结果还有两种可能的解释，包括。。。你怎样得出这个结论的呢？”此时，你就可以从容自若的说：“这是一个很好的问题。针对第一种可能，我们做了XX实验，结论不支持这个可能。针对第二种可能，我们做了XX实验，发现。。。” 看到了吧？这就是“十面埋伏”的妙处。

 

 

第七招：一网打尽

 

如上所述，每一个基因都有作用于它的上游基因，也有受它作用的下游基因。每一个上游基因和下游基因又分别有自己的上下游基因。除了上下游基因及其产物，细胞内、机体内的其它物质例如离子等也都会作用于基因自身。用马哲的观点来说就是联系无处不在，无时不有。这些联系构成了一个复杂的网络。目前生命科学的一个发展趋势就是研究基因网络。所以，研究一个基因的功能，还可以构建出它所处的网络。

 

 

科研中的例子：

 

为了说明上述方法的应用，我们可以看一篇发表于PNAS 2011年5月的文献。文章链接：http://www.pnas.org/content/108/19/8059.short

 

本文思路简单，用到上述“七大绝招”中的三招：天地人和：作者首先通过原位杂交和免疫染色发现JAK/STAT信号通路表达于果蝇的大脑中的蘑菇体。因为蘑菇体是果蝇嗅觉记忆中枢，所以作者推测JAK/STAT信号通路与果蝇的记忆有关。患得患失：然后通过不同的手段抑制JAK/STAT信号通路的活性，发现果蝇长期记忆受损。最后，作者得出结论：JAK/STAT信号通路是果蝇长期记忆形成所必须的。十面埋伏：在每一个阶段，作者都做了大量的实验来支持一个观点。例如为了说明JAK/STAT信号通路在蘑菇体有活性，作者首先用原位杂交的方法检测了该信号通路的总共5个基因中的4个；然后又用免疫染色的方法检测了5个基因中的3个，最后还用一种叫做enhance trap的方法检测了5个基因中的1个。一个8个实验，个个都表明JAK/STAT信号通路表达于果蝇蘑菇体（真够烦人的要不是为了写这篇博文，我都懒得看））

 

 

生活中的例子：

 

一切道理都是相通的。本文所说的方法不仅适用于研究基因功能，还适用于研究其它物质和事物的功能，例如激素、药物、疗法等。除了适用于科研，还适用于日常生活。举例来说，假如我们想知道黑社会对社会有什么影响，就可以：天地人和：调查黑社会活动的时间和地点，经常接触的人物。患得患失：铲除黑社会，看社会有何变化；增加黑社会的规模，看社会又有什么变化。上下求索：看看上面有哪些人是黑社会的保护伞，下面有哪些人是黑社会的衣食父母和后备军。背井离乡：把黑社会从我国赶到邻近国家，看对他们有何影响。十面埋伏：必须多方查证，例如敲诈勒索一起还不够，要敲诈勒索几百起，行贿受贿数十人，黄赌毒一应俱全，横行乡里，无恶不作，才可以充分证明黑社会的危害性。一网打尽：从政治、经济、文化、教育等社会各方面看黑社会与其有何联系。

 

 

三板斧：天时地利，患得患失，十面埋伏

 

为了增加适用范围，上面一共总结出了七大绝招，但却不够简练。一个研究或者一篇文章，常常只用到其中的一部分。为了更加简洁，可以总结为最重要的“三板斧”：天时地利，患得患失，十面埋伏。“天时地利”，指的是基因何时何地表达。“患得患失”，其中“患失”比“患得”重要得多。“十面埋伏”，指的是立体论证。基本上，每一个研究都离不开这三板斧，上述文章就是一个很好的例子。而只要学会这三板斧，就可以做大部分科研了。所以，科研就是这么简单！

 

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