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狂犬病的实验室诊断(9)

已有 369 次阅读 2026-5-7 10:00 |个人分类:狂犬病防治|系统分类:科普集锦

狂犬病的实验室诊断(9)

前记:

目前国际上关于狂犬病研究最权威最全面的大型学术专著是《狂犬病：科学基础和管控（RABIES: SCIENTIFIC BASIS OF THE DISEASE AND ITS MANAGEMENT）》，简称《狂犬病(RABIES)》。该书最新版（第４版）已于2020年5月面世。

该书共有22章，其中第12章是《Laboratory diagnosis of rabies(狂犬病的实验室诊断）》。现将此章的内容全文翻译成中文供参考。

第12章狂犬病的实验室诊断(9)

(Laboratory diagnosis of rabies)

3 病毒抗原的检测（续）

(Detection of viral antigen

3.1 直接荧光抗体试验

(The direct fluorescent antibody test)

3.1.1 荧光结合物的选择、制备与评估

(Fluorescent conjugate selection, preparation, and evaluation)

用于实验室DFA检测的FITC标记抗体可通过内部开发或商业途径获得。部分实验室使用针对主要抗原（如核蛋白或糖蛋白）制备的小鼠来源单克隆抗体混合物，而其他实验室则采用在适宜物种（如兔或山羊）中针对全灭活病毒产生的多克隆抗狂犬病抗血清。大多数市售试剂针对狂犬病病毒，对其他狂犬病病毒属成员的检测效果参差不齐。因此，任何FITC试剂必须使用本地流行的狂犬病病毒属病毒及相关诊断标本进行充分验证，以确保最佳敏感性和特异性。

所有新批次的狂犬病试剂在使用前必须进行适用性测试。对于DFA检测中使用的FITC标记狂犬病结合物，需通过滴度测定确定工作稀释度，并与先前批次保持一致。尽管复染剂为非必需成分，但使用专为免疫荧光检测配制的伊文思蓝可提供以下优势：增强玻片上组织的对比染色（与阳性免疫荧光结果的苹果绿色形成对比）、淬灭背景荧光，并直观确认检测试剂已实际添加到玻片中。复染剂的添加量需在确定结合物工作稀释度时通过滴度测定决定。

通常，每种结合物的工作稀释度通过初始评估系列二倍稀释度（例如1:10、1:20、1:40或更高）确定。这些稀释液的制备方式应与实际检测样本所用试剂完全一致（如相同的稀释液、试管、针头滤器和复染剂浓度）。需由两名或以上诊断人员独立读取并记录结果，随后通过比较结果达成共识，以确定能提供清晰+4级染色（即耀眼的苹果绿色荧光且背景荧光最低）的最佳稀释度。若需更精确确定工作稀释度，可对终点附近有限稀释度的性能进行补充检测。由于不同病毒样本的抗原呈递、抗体亲和力及亲抗原性存在差异，且病毒包涵体因试剂不同而呈现显著差异，适用性验证必须包括使用新批次试剂检测本地流行的各类病毒（相关情况下包括狂犬病病毒属成员）。对照物料应分装保存于-40°C或以下，避免反复冻融。

检测试剂的储备液可至少分装冷冻保存于-20°C（选更低温度更好）。工作稀释度的试剂可在使用前过滤，并于+4°C短期储存，但若7天内未使用则需丢弃。对于可直接连接注射器的用完即丢弃的过滤装置，可在将结合物工作稀释液添加到检测玻片时进行过滤。稀释后的检测试剂（准备分装至检测玻片）可储存于+4°C的带过滤装置注射器中，但需通过注射器尖端封口或塑料膜密封，防止试剂在滤膜或注射器尖端干燥。

每份标本制备的两套玻片应使用FITC标记的抗狂犬病病毒抗体（例如两种不同的单克隆抗体混合物或超免疫血清结合物）进行评估。超免疫血清结合物包含多样性最丰富的抗狂犬病病毒抗体，因此具有与多种狂犬病病毒及相关病毒发生反应的广泛潜力，但这些制剂具有较高的非特异性反应的固有风险。可通过使用特异性对照试剂控制该风险。抗狂犬病超免疫试剂的特异性对照是与狂犬病试剂在同一动物宿主中产生但针对非狂犬病病毒其他因子的FITC标记血清试剂。相比之下，单克隆抗体试剂很少出现非特异性反应，但存在无法与缺乏特定表位（单克隆抗体所针对的表位）的变异株反应的风险。因此，建议使用两种不同单克隆抗体混合物制备的试剂，以降低无法识别任何特定变异株的风险。单克隆试剂的特异性对照包括与狂犬病试剂具有相同同种型和蛋白质浓度但针对非狂犬病病毒其他因子的FITC标记小鼠单克隆抗体。