狂犬病的实验室诊断(10)

前记: 

目前国际上关于狂犬病研究最权威最全面的大型学术专著是《狂犬病：科学基础和管控（RABIES: SCIENTIFIC BASIS OF THE DISEASE AND ITS MANAGEMENT）》，简称《狂犬病(RABIES)》。该书最新版（第４版）已于2020年5月面世。

该书共有22章，其中第12章是《Laboratory diagnosis of rabies(狂犬病的实验室诊断）》。现将此章的内容全文翻译成中文供参考。

第12章 狂犬病的实验室诊断(10)

(Laboratory diagnosis of rabies)​

3 病毒抗原的检测（续）

(Detection of viral antigen 

3.1 直接荧光抗体试验（续）

(The direct fluorescent antibody test)

3.1.2 免疫荧光检测方案

(Immunofluorescence test protocol)

丙酮固定后，待测玻片和对照玻片在室温下风干。按照建议，可通过装有0.45μm低蛋白结合滤膜的注射器分别加入两种不同的抗狂犬病毒结合物，每种结合物加至一组玻片中。玻片在37°C高湿度湿盒中孵育30分钟。染色后，用PBS缓冲液短暂冲洗玻片，然后在PBS中浸泡 3–5 分钟，需注意对照玻片和每只待测动物的玻片应分置于不同的冲洗容器中以避免交叉污染。随后将玻片在新的PBS中再次浸泡 3–5 分钟。小心吸干玻片上多余液体（无需冲洗），再短暂风干。将少量 20% 甘油-Tris 缓冲盐溶液（pH 9.0）滴加在置于吸水纸上的盖玻片上。将风干的玻片翻转并覆盖在带有封片剂的盖玻片上，轻轻按压玻片背面，使多余封片剂被吸水纸吸去。玻片应在封片后 2 小时内用荧光显微镜观察。

最低狂犬病诊断程序要求：对于每种结合物和每个检测的脑区，由 2 名实验室诊断人员以 200 倍或更高放大倍数检查 40 个视野。因此，对于基础诊断，2 种结合物 × 2 个采样脑区 × 2 名观察者 × 每个 40 视野，共计320 个视野的观察才能得出确诊结论。若观察到荧光，应在 400 倍放大倍数下检查荧光包涵体，以分辨非常细微的尘样包涵体并识别某些类型的非特异性染色（图 12.1）。

【图12.1】显示 EBLV-1 感染脑细胞的特异性苹果绿色染色。 

3.2 直接快速免疫组织化学染色试验

(Direct rapid immunohistochemical test)

直接快速免疫组织化学染色试验 (DRIT) 是 OIE 认可的一线诊断方法 (OIE, 2018b)，对于来自非洲、北美、欧洲和亚洲多种不同动物的疑似狂犬病脑组织样本，其敏感性和特异性与 DFA 试验相当 (Durr et al., 2008; Lembo et al., 2006; Madhusudana, Subha, Thankappan, & Ashwin, 2012; Middel, Fehlner-Gardiner, Pulham, & Buchanan, 2017)。DRIT 既可在实验室使用，也可在现场使用。自 2005 年以来，美国农业部野生动物服务局(USDA WS) 项目已使用 DRIT 检测了从狂犬病战略管理区域野生动物中收集的超过 94,000 份样本。DRIT可在 1 小时内完成，正迅速成为 DFA 检测的一种具有成本效益的替代方法，特别是在现场监测中 (Patrick et al., 2019; Rupprecht et al., 2018)。从疑似动物采集脑组织的触印片，并在 10% 缓冲福尔马林中固定。DRIT 不使用 FITC 标记的抗体，而是使用生物素化的狂犬病毒特异性单克隆或多克隆抗体对触印片进行染色，然后与链霉亲和素-过氧化物酶及显色底物（如乙酰基-3-氨基-9-乙基咔唑）一起孵育，以检测受感染组织内的病毒核蛋白包涵体。

与 DFA 试验相比，DRIT 的一个显著优势是使用普通光学显微镜，而非昂贵的荧光显微镜 (Durr et al., 2008; Ehimiyein et al., 2014)。其结果比 DFA 试验的苹果绿色荧光更易于判读，但仍强烈建议在条件允许时由两名操作人员共同判读。虽然试剂在使用前需要冷藏，但检测过程中的孵育步骤在室温下进行，从而使其能够在现场使用。生物素化抗体可从南非OIE狂犬病参考实验室 (Onderstepoort) 获取。

（未完待续）

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权威的大型学术专著《狂犬病（Rabies）》最新版已面世　（https://mp.weixin.qq.com/s/7v3fyBpGaHqHUZbZgPc3fw）

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