驯鹿狂犬病灭活疫苗的长期体液免疫原性、安全性和保护效果

驯鹿狂犬病根除战略的核心要素是定期接种疫苗，以获得并维持足以终止狂犬病病毒传播的疫苗接种覆盖率。本文报道了以Shchelkovo-51狂犬病病毒株为基础的两种形式的狂犬病灭活疫苗(含佐剂的液体疫苗和不含佐剂的冻干疫苗)免疫后驯鹿体液免疫强度和持续时间的研究结果。通过在中和试验中测量动物血清病毒中和抗体水平来评估疫苗后免疫的效率。该研究确定有效的狂犬病疫苗注射剂量等于3ml。单剂量3ml这种疫苗早在接种后7天就在驯鹿体内诱导产生稳定的特异性中和抗体，到免疫后30天，大大超过了OIE接受的最低阈值水平。需要间隔30天注射两剂疫苗，以获得至少2年的狂犬病毒特异性中和抗体滴度超过0.5 IU/ml的强免疫力。数据不支持佐剂疫苗对预防驯鹿狂犬病的益处。

狂犬病是一种哺乳动物和人类的病毒性疾病，其特征是中枢神经系统损伤和不可避免的死亡。狂犬病病毒是一种典型的狂犬病病毒的属弹状病毒科家庭。其基因组为负单链非节段RNA，编码五种结构蛋白:核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和依赖RNA的RNA聚合酶(L)。糖蛋白G是狂犬病病毒的唯一抗原，能够诱导病毒中和抗体(VNA)的产生。

除了澳大利亚和南极，全球都发现了陆生哺乳动物中的狂犬病。尽管在几个欧洲国家成功地根除了这种疾病，但欧亚、非洲和美洲许多国家的流行病状况仍然令人担忧。在俄罗斯联邦，狂犬病的情况也仍然紧张。接种疫苗被认为是预防狂犬病最有效的手段。需要有效的狂犬病疫苗来对抗这种感染，在对目标动物接种后能够快速诱导强烈和长期的免疫。

在俄罗斯，许多种狂犬病疫苗可用于许多动物物种，但关于在野外接种的鹿的保护性免疫的数据很少，尽管有一些关于鹿免疫持续时间的报告。基于Schelkovo-51狂犬病毒株的疫苗已在俄罗斯成功用于宠物和牛类动物的疫苗接种多年。在此，作者研究了在应用基于Schelkovo-51株的两种形式的灭活狂犬病疫苗(液体和冻干)后驯鹿的体液免疫水平和持续时间。驯鹿疫苗的有效性是数年研究的主题(从2012年到2017年)；这些研究是在萨哈共和国(雅库特)的驯鹿农场进行的，在研究期间没有观察到传染病的爆发。与冻干疫苗不同，液体疫苗还含有氢氧化铝作为佐剂。由于萨哈共和国(雅库特)全年的气温从-35°C到20°C不等，因此不可能在这种条件下为液体疫苗的储存和使用提供合适的温度范围。可以在任何零下温度下储存和运输的冻干疫苗是更适合在这些地区使用的形式。因此，在此作者也检测了液体疫苗中佐剂对病毒中和抗体滴度形成的作用。

驯鹿放牧是北方、西伯利亚和远东土著人民的传统职业，是他们民族文化的组成部分，也是他们在恶劣气候条件下生存的方式。俄罗斯联邦有170多万头家养鹿，约占世界家养驯鹿的2/3。

在过去十年里，俄罗斯联邦与狂犬病有关的动物流行病形势变得紧张，在驯鹿种群中发现狂犬病病例就是证明。狂犬病疫源地在俄罗斯各地区的分布并不均匀，这种分布每年都有很大变化。特别是，在科米和萨哈(雅库特)共和国、涅涅茨和亚马尔-涅涅茨自治区、泰梅尔和楚科奇发现了驯鹿狂犬病病例。最常见的是，狂犬病袭击狐狸、北极狐、狼和狼獾。动物健康办公室在冬末春初(二月至三月)动物迁徙和交配活跃时检测到这种疾病。家养鹿中的病例表明，野生动物的代表在冬季至春季期间与伴随家养驯鹿群的受感染北极狐接触后，通过驯鹿狗传播狂犬病。还有，有狂犬病的狼獾经常攻击鹿。由于驯鹿在开阔地带放牧，野生食肉动物攻击的可能性更大，因此感染狂犬病病毒的可能性也更大，因此防治驯鹿狂犬病的策略必须在很大程度上依赖于定期注射疫苗，以达到并维持终止狂犬病病毒传播所需的疫苗接种覆盖率。使用诱饵通过活疫苗进行口服免疫导致狂犬病从野生动物种群中消失。例如，使用安全有效的狂犬病疫苗，如基于SAD Bern病毒株的减毒活狂犬病病毒疫苗SAG2，在很大程度上有助于在几个欧洲国家消除狂犬病。自20世纪末以来，基于病毒株SAD Bern和SAD B19的外国诱饵疫苗已在俄罗斯用于野生动物的口服免疫。后来，使用了使用减毒狂犬病病毒株RB-71、TS-80、Vnukovo-32/07、RV-97和ERA-G333开发的俄罗斯口服疫苗。基于表达狂犬病病毒G蛋白的痘病毒、腺病毒和副流感病毒的病毒载体疫苗目前已成功用于预防狂犬病。例如，基于痘苗病毒载体的RABORAL V-RG狂犬病疫苗用于赤狐、金豺和貉。基于各种腺病毒毒株的病毒载体狂犬病疫苗目前也用于接种动物。

萨哈共和国(雅库特)全年的气温从+20°с到-35°с不等，因此很难满足液体疫苗储存和应用的温度要求。这就是为什么也使用冻干疫苗的原因，因为它可以在任何冷冻温度下储存和运输。此外，与冻干疫苗不同，液体疫苗还含有氢氧化铝作为佐剂。这就是作者决定基于病毒中和抗体滴度研究两种狂犬病疫苗有效性的基本原理，其中病毒中和抗体滴度是使用国际公认的FAVN方法测定的。该方法测量免疫系统对狂犬病疫苗接种的反应，并允许分析血清抗体水平。这种类型的中和反应被广泛用于检查从将被运送到国外的狗和猫收集的血清样本，并进行国际比较测试。

自从路易斯·巴斯德在19世纪末研制出第一种狂犬病疫苗以来，疫苗已广泛用于免疫家畜。目前的疫苗制造商采用多种固定疫苗狂犬病病毒株，即巴斯德病毒(PV)、 Pitman Moore (PM)、Challenge Virus Standard (CVS、Flury low egg passage (LEP)、Flury high egg passage (HEP)、 Kelev, Evelyn Rokitniki Abelseth (ERA)、and Street Alabama Dufferin (SAD).。这些毒株在许多国家使用，在适应生产条件的过程中获得了新的毒株衍生物。

在这项工作中，使用了基于高传染性毒株Schelkovo-51的灭活疫苗。路易·巴斯德病毒(PAS)是1882年由法国的路易·巴斯德从一头牛身上分离出来的。该毒株在兔中传代2061次，适应于Vero细胞培养物(19代)，然后适应于BSR细胞培养物(5代)，然后用于生产兽用和医用狂犬病疫苗。该毒株于1886年被运送到俄罗斯，在那里它成为几种疫苗毒株的祖先。在兔中病毒减毒3500代后获得莫斯科株。传代导致从莫斯科品系获得绵羊品系；前者是在俄罗斯广为人知的两种制造狂犬病病毒株的祖先:Shchelkovo-51和PV-97。Shchelkovo-51疫苗狂犬病病毒株适应于来自金黄地鼠肾的BHK-21悬浮细胞系，并且是高度免疫原性的。

狂犬病糖蛋白G是唯一暴露在病毒表面的病毒蛋白。先前的研究表明，糖蛋白G是一种保护性抗原，能够诱导病毒中和抗体(VNA)的合成，该抗体负责宿主的免疫反应。GenBank数据库中没有关于Shchelkovo-51疫苗株全基因组测序的数据。鉴于狂犬病病毒糖蛋白G作为保护性抗原的特殊重要性，作者决定对这一精确的基因组片段进行测序，以评估其核苷酸序列与其他已知狂犬病病毒株的核苷酸序列的同源性水平。对Shchelkovo-51狂犬病病毒株的核苷酸序列的分析表明，它们与其他狂犬病病毒株的序列的同源性在93%至99%之间。值得注意的是，Shchelkovo-51病毒株和在狂犬病参考中心用作实验室标准的攻击病毒标准(CVS-11)株的糖蛋白G核苷酸序列同源性为89%。作者通过比较第2代和第16代毒株的糖蛋白G序列，对Shchelkovo-51狂犬病病毒毒株在疫苗生产的不同阶段的遗传稳定性进行了研究。已经确定Shchelkovo-51毒株的糖蛋白G编码RNA序列在这些传代中保持100%相同。该数据使得有可能确认在制造过程阶段毒株的高水平稳定性，至少就所考虑的片段而言。

在本研究中使用了两种基于在俄罗斯广泛用于宠物和牛动物接种的Shchelkovo-51狂犬病病毒株的灭活疫苗，以达到针对狂犬病的体液免疫保护水平(≥0.5 IU/ml)在驯鹿。这两种疫苗对目标动物物种都具有很高的安全性和有效性。这些疫苗促进了剂量等于3.0ml的保护性病毒中和抗体滴度的发展，并满足了OIE的要求。单剂量疫苗在接种后第7天就已经在驯鹿中诱导了特异性中和抗体的稳定产生，在第30天，抗体滴度大大超过了OIE确定的保护阈值。接种2剂保持了24个月的抗体保护水平。这些结果与早期的数据一致，证明接种一剂灭活佐剂狂犬病疫苗可在驯鹿中诱导良好但持续时间短的免疫力。根据他们的数据，大多数动物初次接种疫苗1年后没有发现抗体滴度，需要加强剂量的疫苗才能提供足够的保护水平。作者的结果表明，初次接种后30天需要加强剂量的疫苗，以确保至少2年的足够保护。

驯鹿疫苗的有效性是多年研究的主题。在田间试验中，所述疫苗被证明是无害的，并且能够在接种的动物中诱导强烈的免疫力。测试期间驯鹿狂犬病发病率的下降也证实了疫苗的保护作用。

令人惊讶的是，有佐剂的液体疫苗和无佐剂的冻干疫苗的效果接近。因此，氢氧化铝不能刺激产生更高滴度的病毒中和抗体。氢氧化铝是经典佐剂之一，存在于许多蛋白亚单位和灭活疫苗中。然而，近年来，关于铝盐的弱免疫刺激活性的数据一直在积累。作者的结果与该数据一致，但不支持氢氧化铝作为灭活疫苗佐剂预防驯鹿狂犬病的益处。

根据这项研究的结果，在疫苗接种手册中增加了以下数据:这两种疫苗都推荐用于驯鹿的皮下2剂免疫接种(间隔30天),剂量为3.0ml，可有效预防北极地区的这种危险疾病。作者的研究表明，液体和冻干疫苗对驯鹿都是安全的，可以推荐使用。

有效的疫苗接种计划对于在有限的区域内消除野生动物中的狂犬病至关重要。这样，基于Schelkovo-51病毒株用于保护驯鹿的狂犬病疫苗的成功经验应通过在其他动物如红狐、北极狐和狼獾中使用基于减毒活病毒或病毒载体的口服狂犬病疫苗诱饵来补充。

Matveeva I, Karpova O, Nikitin N, Akilin O, Yelnikov V, Litenkova I, Melnik R, Melnik N, Asimov K, Zaberezhny A, Fyodorov Y, Markova E. Long-term humoral immunogenicity, safety and protective efficacy of inactivated vaccine against reindeer rabies. Front Microbiol. 2022 Sep 8;13:988738. doi: 10.3389/fmicb.2022.988738. PMID: 36160222; PMCID: PMC9493026.