磷酸化修饰在植物生长发育中具有重要作用。总结植物蛋白磷酸化相关生理过程调控的分子机制，注重体现其中一些重要发现的研究策略与技术手段。

蛋白磷酸化

磷酸化(phosphorylation)是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，一般通过蛋白激酶(protein kinase)和蛋白磷酸酶(protein phosphatase)对底物(substrate)蛋白的特定氨基酸进行调控，在真核生物的生命活动中发挥关键作用。研究表明磷酸化修饰调控蛋白质的构象、活性、稳定性和亚细胞定位等，因而对底物蛋白发挥功能具有重要决定作用。

1953 年，Watson 与Crick 发现了脱氧核糖核酸(DNA)的双螺旋结构，由此揭开了现代分子生物学的序幕。现在，“DNA-RNA-蛋白质”的“中心法则”几乎是分子生物学领域的常识，但是蛋白质要行使功能仍需要不同的加工和修饰。在翻译完成后，蛋白质会发生如磷酸化、糖基化、乙酰化、甲基化等翻译后修饰(post-translational modification)，其中，可逆磷酸化(reversible phosphorylation)是一种最常见的修饰，由蛋白激酶和蛋白磷酸酶负责调控。

图  G蛋白可逆蛋白磷酸化反应示意图。蛋白激酶以ATP作为磷酸基团的供体，通过与底物结合进行磷酸基团传递，将其转移到底物的羟基上；而蛋白磷酸酶可以通过水解反应去除底物羟基上共价结合的磷酸基团。在这个过程中，由于激酶、磷酸酶都可以与底物结合，可以通过检测蛋白互作的方法，也可以通过放射性核素32P标记的ATP（γ-32P-ATP）在试管中模拟磷酸化反应证明激酶与底物的反应可否直接发生。

目前的研究表明蛋白磷酸化是一种十分普遍的调控机制，几乎参与了每个生命活动过程和整个生命周期。质谱分析数据显示人类蛋白质的70%可以被磷酸化，而且一般具有多个磷酸化位点。在人类、酵母与植物等真核生物中，蛋白磷酸酶与蛋白激酶的总量可以占到基因组编码蛋白质的2%~4%。拟南芥基因组中大约编码了150个左右的蛋白磷酸酶，与约1050 个蛋白激酶(Kerk et al., 2008)。普度大学在其PlantsP 数据库(http://plantsp.genomics.purdue.edu/index.html)中对拟南芥的蛋白激酶与蛋白磷酸酶作了系统的分类及芯片信息的整合，基本明确拟南芥基因组中有130 个蛋白磷酸和989 个蛋白激酶。而在水稻中有1508 个蛋白激酶(Rice Kinase Database, RKD; http://rkd.ucdavis.edu)。从近年来的磷酸化组分析结果来看，植物全蛋白质组的大量蛋白质都可以被磷酸化，考虑到植物基因组所编码的大量蛋白激酶与蛋白磷酸酶，不排除植物与人类等具有相当比例的蛋白质受磷酸化调控(Uhrig et al., 2013)。

图  植物类受体激酶（RLK）广泛参与植物生长发育和环境响应。类受体激酶在植物生长发育和环境响应的各个方面发挥重要作用：CLAVATA1、CLAVATA2和ACR4对维持植物茎顶端分生组织和根顶端分生组织十分重要；ERECTA调控叶片气孔细胞的排列；BAM1、BAM2和EMS/EXS与雄蕊体细胞绒毡层分化有关；TMK1、BRI1和SR160等能够识别植物激素信号；FLS2、Xa21和EFR等在植物应对有害生物侵袭方面十分关键。

真核生物的蛋白磷酸化可以发生在线粒体、叶绿体、胞质、细胞核、高尔基体，甚至于细胞外。从目前的研究报道和磷酸化组结果来看，尽管植物基因组中并未编码典型的酪氨酸激酶(tyrosine kinases)，但植物蛋白质组中却有相当数量的蛋白质可以在酪氨酸位点上发生磷酸化修饰。植物蛋白质组的磷酸化位点中，丝氨酸(serine, Ser, S)约为84%~86%，苏氨酸(threonine, Thr, T)约为10%~12%，酪氨酸(tyrosine, Tyr, Y)约为2%~4%，这样的比例与其他真核生物比较类似(Uhrig et al., 2013)。

总结与展望

20世纪80 年代末至今，随着分子生物学的发展，模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)正向遗传学的兴起，生物化学、蛋白质组学和结构生物学的发展，植物蛋白磷酸化的研究取得了重要发展，人们对蛋白磷酸化在植物生长发育过程中的功能有了相当的了解。特别是近10 年以来，对蛋白磷酸化的研究表明其参与了植物细胞间信息交流、胞内信号转导、免疫反应和表观遗传调控等许多重要过程，在植物生长发育和环境响应等方面发挥了重要调节作用。人们也发现除蛋白激酶和磷酸酶对特定底物的调控外，一些磷酸结合蛋白也参与了相关信号转导过程。我们将对植物蛋白激酶和蛋白磷酸酶的分类、生物化学特性和重要功能作系统阐述，并总结蛋白磷酸化相关生理过程调控的分子机制，注重体现其中一些重要发现的研究策略与技术手段，以为今后的蛋白磷酸化研究工作提供借鉴。

植物蛋白磷酸化的研究伴随植物分子生物学的发展，特别是近20 年来取得了丰硕成果。磷酸化修饰在植物生长发育中具有重要作用，参与了胞间信号交流和“植物-环境”相互作用等多个过程，对各个“激酶/磷酸酶-底物-表型”关系的明确和相关机制的深入了解，有助于人们从分子水平上认识生命过程。近年来发展的结构生物学、化学遗传学和磷酸化组学等技术为蛋白磷酸化的深入研究提供了更全面的手段。

在蛋白磷酸化的研究中，要清楚一个蛋白激酶或蛋白磷酸酶的作用机制，证明酶与底物的关系十分重要，在这个过程中，往往需要通过一系列的体外实验(如yeast twohybrid、GST pull down、in vitro kinase assay 甚至晶体结构分析)来证明酶与底物的直接互作或修饰关系，为可能的分子互作提供一个模型。进一步要想证明体内这种情况是否发生，以及这种互作关系的生理功能，就需要根据体外实验得到的线索，比如互作的结构域、基序及修饰的位点(某个氨基酸)对酶或底物作相应的突变或重组，进行体内验证。体内、体外实验的相互佐证，才能够有效地证明蛋白磷酸化的生理功能。

图  蛋白磷酸化机制与功能研究的一般模式。要证明某个蛋白激酶或磷酸酶通过对底物磷酸化调控而参与到某个生命过程中，一方面需要通过“试管”中的一系列体外试验，证明酶与底物之间的相互作用、磷酸化修饰关系、三维结构、磷酸化位点、活性中心位点等，说明某个酶与底物具有直接的关系。另一方面，要证明体外实验室的结果是植物体内，乃至生物体内发生的生命活动的原因，需要通过对酶与底物的表达水平、相互作用、修饰位点、相互作用区段进行细致研究，检测其对相关生命活动的影响。体内、体外实验室结果的相互验证和补充才能充分说明该酶与底物的修饰关系确为特定生命活动的调控机制。

从目前蛋白磷酸组的质谱数据来看，细胞内全蛋白的相当大一部分都受到磷酸化修饰，且蛋白激酶或磷酸化酶的数量远远不是“一酶一底物”这种一对一的关系。由于许多蛋白激酶具有类似的生化性质，表明一个蛋白激酶或蛋白磷酸酶可能负责体内许多底物的修饰，从而参与不同生理过程的调控。从这点看，质谱技术的发展为全面研究某个激酶或磷酸酶的功能及机制提供了新手段，即不仅可以直接鉴定某个特定底物的磷酸化位点，也可以高通量地在全蛋白质组的基础上鉴定可能的底物(如Jiankang Zhu 实验室对SnRK2 的研究, Wang et al., 2013)。此外，生物信息学和系统生物学研究让人们从整体上了解某个途径成为可能，如前面已述的Peter McCourt 实验室对ABA 信号途径的系统生物学研究(Lumba et al., 2014)。

图 PP2C-SnRK2所介导的核心ABA信号通路发现示意图。

结构生物学研究不仅可以帮助阐明受体作用的重要位点，也为设计同源类似物(analog)提供了借鉴，如在PP2C 调控SnRK2 的作用机制方面提供了普通生化手段不可能发现的有效信息。质谱技术及系统生物学、结果生物学的发展为进一步研究蛋白激酶或蛋白磷酸酶的功能提供了新的技术手段和思路，也是未来植物蛋白磷酸化研究的一个新方向。

本文由刘四旦节选自《新生物学年鉴2014》一书中《植物中的蛋白磷酸化》一文，作者：中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所薛红卫、谭树堂、晏萌。本文对植物蛋白激酶和蛋白磷酸酶的分类、生物化学特性和重要功能作系统阐述，并总结蛋白磷酸化相关生理过程调控的分子机制，注重体现其中一些重要发现的研究策略与技术手段，以为今后的蛋白磷酸化研究工作提供借鉴。

《新生物学年鉴2014》为一本由《新生物学丛书》6位编委组稿并把关、各地大学及研究所骨干研究人员撰写的文集，包括植物功能性状研究、植物蛋白激酶在生态学领域的应用、免疫生物学研究、神经科学研究，以及哺乳动物全脑神经测量等内容，共6篇文章。这些文章的内容均为撰写者的最新研究成果，因此年鉴可以在一定程度上体现出我国生物学领域的发展现状。

《新生物学年鉴2014》文章目录

1. 刘晓娟、马克平，植物功能性状研究进展

2. 薛红卫、谭树堂、晏萌，植物中的蛋白磷酸化

3. 邓子木、许可、刘小龙，抗原受体V(D)J基因重排

4. 黄海艳、汤其群，脂肪细胞的发育分化与代谢

5. 尚春峰、穆宇、杜久林，以透明脑，观澄明心：斑马鱼神经功能研究进展    

6. 龚辉、李向宁、袁菁、吕晓华、李安安、陈尚宾、杨孝全、曾绍群、骆清铭，基于直接测量的哺乳动物全脑神经——血管网络精细结构及三维可视化

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