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如何实现光学超分辨(二) 精选

已有 23018 次阅读 2012-5-22 15:32 |系统分类:科研笔记| style, 光学, 如何

如何实现光学超分辨(二)

席鹏著

 

第二章: STED--You jump, I jump

    在上一章,我们讲到一次不能分辨。Stefan Hell就在想,那么,是不是可以通过两步的方法来实现分辨?

    这个问题如果用通俗的语言描述,就是,如果你有一根粗笔,怎么能够用它画细线?

    你可能会想到,买块橡皮。先画个粗的,再擦去两边的多余部分,自然就是细线了。没错,STED用的就是这个原理。

    STED,全名是Stimulated Emission Depletion,受激辐射光淬灭。请看下图:

    这幅图是一幅典型的STED系统结构示意图。在右上角,有一副能级图。其中,你看到红色的箭头和黄色的箭头了吗?

    如果看到了,说明这两个箭头是很好"分辨"的,对不对?

    好,接下来稍加科普一下这个图的意义:绿箭头代表粒子被激发从低能级S0到高能级S1,然后粒子会弛豫到亚稳态---高能级的最低点。接下来粒子会在这抽根烟,休息一下。好吧,现在已经禁烟了,所以他没抽烟,只是喝了个下午茶。这个时间短到几个纳秒。这个短暂的快乐时光被叫做粒子的寿命(lifetime)。然后粒子选择不再高帅富S1,回到屌丝阶层S0。(苏轼曰:吾欲乘风归去,又恐琼楼玉宇,高处不胜寒。。。)

    这大概是绝大多数电子的选择。跳下来的时候它们会降落在S0能级的不同高处,并形成一定的分布。这个分布我们可以用发射光谱来描述其统计特性。

    上图是一幅某染料ATTO647N的激发光谱(蓝色曲线)与发射光谱(红色曲线)。可见,粒子辐射跃迁从620nm-850nm均有可能,在670nm处几率最大。

    这就是现实。

    "这样不好,"有一个同学突然站起来说,"看着不整齐"。他,就是爱因斯坦。

爱因斯坦补充说:"大家都看过《泰坦尼克号》这部电影了吗?最感人的,不就是You jump, I jump吗?"

    "如果Rose遇到了Jack,那么他俩会一起跳,不分你我。"这句话,让Titanic的导演詹姆斯·卡梅隆得了奥斯卡小金人,也让相信小爱同学预言的Chaels Townes, A. Prokhorov 及N. Basov得了诺贝尔奖。后来发明的激光Laser,其中的SE就是受激辐射。正因为这整齐划一的一跃,使得激光成为功率最强的光。

[注:诺贝尔奖委员会有时候是十分无厘头的,比如爱因斯坦竟未因他的广义狭义相对论、受激辐射等获得诺贝尔奖。反倒是一个光电效应获奖了。惊人相似的不公正待遇还有激光的发明人Theodore Maiman,教科书里第一人,一直未得诺奖。]

    回到超分辨的问题,当年还是个博士后的Stefan Hell躺在宿舍里,突然灵光一闪:"X,我可以把受激辐射和自发辐射分开!"

    当然,笔者无从考证Stefan当年是否用了国骂,但是此时此刻的激动心情,可能只有这样方能表达。

    咱们再回到刚才那个黄箭头和红箭头。如果绿色箭头引发的荧光现象的最小PSF是绿色的圆圈半径,这时候如果给它套上一个红色橡皮擦(粒子做受激辐射波长相同),不久剩下为数不多、居于中间的荧光了吗?缩小点扩展函数,这不就是超分辨吗?

    接下来的实验就非常简单了:选一种合适的荧光物质,按顺序先给激发脉冲(2ps左右),等它跃迁上去了马上给一个受激辐射波长的脉冲(250ps左右),然后用二向色镜区分受激辐射跟自发辐射,探测过来的自发辐射信号。受激辐射越大(橡皮擦得干净),剩下的PSF越小,也就是分辨率越高。这个就是Pulsed STED.当然,如果你觉得时间控制太麻烦,其实可以都给连续信号,因为反正二向色镜能区分,只不过擦得没那么干净罢了。这个就是CW STED。

 对仪器方面的补充说明:要想STED,先做Confocal。顺着635nm,DC1将激发光通过物镜照到样品上;从样品回来的荧光信号透过DC1,到达APD被探测。移动物体,实现三维共聚焦成像。 接下来STED。利用一个位相片实现光位相调制,最终在焦点处形成环形光分布。放上样品,成像,STED实现。



--------华丽的分割线------

写到这里的时候,笔者刚好有一篇文章在Opt. Express刊出,内容是关于如何用一小片塑料或纸片,用共聚焦扫描显微就能在透明的样品(细胞、组织切片都行)实现和DIC一样震撼的位相浮雕成像的。同时,告诫大家不要将打印纸含在嘴上,有剧毒致癌物----我们实验发现,从三无小饭馆来的餐巾纸荧光极强,打印纸荧光也不弱
链接:
http://www.opticsinfobase.org/oe/abstract.cfm?uri=oe-20-13-14100



https://blog.sciencenet.cn/blog-499502-573771.html

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