代谢学人

Cell Metabolism: 脂去体轻，肝净神清

撰文 | 程诗淼 高铭远 生茂正 郭盈盈 于剑 

编辑 | 孟美瑶

校对 | 生茂正

背景介绍

近年来，非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)已成为慢性肝病的主要原因，但目前还没有批准的药物专门用于治疗NAFLD。NAFLD的特征是肝脏中脂肪的过度积累，并且随着炎症的加剧，最终导致肝纤维化、脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)的发生。持续的NASH将对肝脏造成严重损伤，继而发展为肝硬化、肝细胞癌或肝功能衰竭。除此之外，超重和肥胖经常与NAFLD息息相关，约75%的超重人群和90%的极度肥胖人群受到NAFLD的影响，并且肥胖还会显著增加NAFLD患者的死亡率。肥胖中的NAFLD被认为是脂肪组织功能失调，无法扩张自身储存脂质，从而导致脂质溢出并在肝脏中积聚。此外，NAFLD也可在脂肪营养不良综合征即脂肪扩张受限的情况下发生，这些疾病通常与较低BMI相关。

治疗NASH药物作用机制

目前NASH治疗药物的作用靶点主要包括法尼酯X受体(Farnesoid X Receptor, FXR)、甲状腺激素受体β、过氧化物酶体增殖物激活受体等。

作为首个进入NASH临床III期的药物，奥贝胆酸(Obeticholic acid)曾受到广泛的关注。奥贝胆酸是一种FXR激动剂，可以调节肝脏中的糖异生和糖原分解，控制葡萄糖代谢过程，并抑制胆酸生物合成的限速酶CYP7A1，从而改善胆固醇和胆汁酸代谢。虽然饱受期待，但奥贝胆酸在临床III期实验的结果却不尽人意，在NASH缓解、肝纤维化不再恶化的终点评价中被认为和安慰剂组无显著差异。基于其已被探明的药物性肝损伤等副作用，因此最终并未获得FDA的上市批准。

Elafibranor是一种过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂，PPARα的激活降低甘油三酯水平并参与能量稳态的调节，而PPAR-β/δ的激活增强脂肪酸代谢。与奥贝胆酸相同，该药物也因为在III期临床研究中未能达成改善NASH进程的终点指标而被终止临床研究。

目前，全球唯一一款达成两个终点指标，并获得FDA批准上市的NASH治疗药物仅有瑞司美替罗(Resmetirom)。该药物是一种肝脏甲状腺激素受体β选择性激动剂，能够通过激活肝细胞中的β受体，在肝脏中调节脂代谢，降低血清胆固醇、甘油三酯和致动脉粥样硬化性脂蛋白的含量。在III期实验中，约30%的肝脏炎症和26%的肝纤维化程度得到改善，远优于安慰剂组，且副作用可控。该药物的上市也为广大患者带来新的曙光。

参考文献：

[1]Dufour JF et al. Gut. 2022 Jun 16;71(10):2123–34.

目前NAFLD的治疗策略主要是通过增加身体活动和减少食物摄入以促进体重减轻。然而大约80%通过改变生活方式减肥的人们体重会反弹，这说明需要额外的治疗手段进行干预。最近一项大规模的人类外显子组测序研究报告显示孤儿G蛋白偶联受体75(G protein-coupled receptor 75,Gpr75)突变与较低的体脂和BMI相关，因此科研人员对该受体产生强烈兴趣。目前已有研究发现在小鼠中靶向抑制Gpr75能够预防饮食诱导的肥胖，这表明该受体在调节体重的过程中具有重要作用。鉴于部分基因的缺失减轻肥胖的同时能够导致脂肪萎缩和脂质异位堆积，增强脂肪肝风险（小编注：本文作者并未对所提出的这一结论给出参考文献。23年iScience曾报道磷脂合成关键酶Agpat2敲除可引起脂肪萎缩和脂质代谢紊乱，增加肝脂肪变性和糖尿病风险，并验证了该基因在脂肪分化中的重要作用。但目前大多数研究认为导致肥胖的基因缺失能够促进能量代谢，主要通过增强脂质代谢减轻肥胖和脂肪肝，如24年发表的Nature Metabolism发现白色脂肪细胞特异性RalA基因缺失能够增强能量消耗，进而减轻HFD条件下的肥胖和脂肪肝），因此确定GPR75缺失对肝脏脂质积累的影响至关重要。为了解决这一问题，英国阿伯丁大学的Lora K. Heisler团队进行相关研究，其成果“Loss of GPR75 protects against non-alcoholic fatty liver disease and body fat accumulation”近期发表在Cell Metabolism上，该研究发现Gpr75 KO小鼠在HFD喂养下，能够通过调整热量摄入和能量消耗而保持能量平衡。人类Gpr75功能缺失性突变以性别依赖的方式影响脂质沉积，Gpr75突变与肝脏脂肪变性呈负相关。

敲黑板啦！

1、下丘脑RNA-seq显示Gpr75与促食欲神经元共表达

2、Gpr75 KO小鼠通过抑制HFD食物摄入量保持能量平衡

3、在Gpr75突变的人类和小鼠中检测到肥胖特征的性别效应

4、人类和小鼠中Gpr75的突变可以预防脂肪肝疾病

研究结果

1.下丘脑细胞Gpr75的单细胞RNA-seq和组织化学表征

研究人员首先分析了小鼠中Gpr75 mRNA的表达情况，发现其在大脑中表达水平最高，在肝脏中几乎不表达(图1A)。鉴于Gpr75在大脑中的丰度，研究人员使用原位杂交(RNAScope)绘制了Gpr75 mRNA表达图谱，发现其广泛分布于整个大脑，包括但不限于与能量稳态相关的区域，如下丘脑（小编注：RNAscope技术可以在单张切片上同时检测多个RNA靶标，也兼容和免疫荧光的共染，同时能够展示非编码 RNA 在胞核或者胞膜上的定位情况，使用RNAscope能够对细胞的转录模式进行灵敏的空间和定量分析。此外，神经元中受体靶点较多，这些受体通常在胞外暴露的特异性氨基酸序列较少，难以通过抗体检测，因此通常以RNAscope为替代手段。目前RNAscope技术广泛应于无抗体靶点如各种受体靶点的鉴定和表征以及神经元细胞亚群的组织分布或新神经元的表征）(图S1)。

接下来，研究人员详细表征了Gpr75在下丘脑中的表达(小编注：下丘脑是大脑中调节肥胖的主要区域)，以探究Gpr75调节脂质积累的潜在机制。HypoMap是一个由18个小鼠下丘脑单细胞RNA-seq数据集组成的大型集成单细胞RNA-seq数据集。在HypoMap的384,925个细胞中，有11,970个是Gpr75阳性细胞，占所有细胞的3.12%，并且以神经元细胞居多(10609个，占阳性细胞的88.6%)。于是研究人员将重点放在Gpr75^+VE(即Gpr75阳性)神经元上，并重新生成UMAP图(图1B)。HypoMap中可以从低到高进行七种不同层次的聚类，从而在数据集中改变粒度级别(小编注：粒度指数据的详细程度，粒度越小，数据越详细，但也可能影响结果的准确性)。在改变粒度级别后聚类分析获得的185个细胞群中，有130个神经元群为Gpr75^+VE细胞(表S1A)，表达Gpr75的最大细胞群是位于视交叉上核的C185-72: Fam122b.Vipr2.GABA-2(图1C)，占所有Gpr75^+VE细胞的4.26%。第2 - 4名的Gpr75^+VE细胞群则分别为C185-30: Hmcn2.Gpr149.GLU-3(2.65%)；C185-115: Npy.Agrp.GABA-4(2.46%)；C185-19:foxb1.glu-2(2.03%)和C185-106:Sox6.Lhx8.GABA-1(1.99%)(图1C-F)。

研究人员进一步探究了食欲和肥胖的关键调节因子神经肽Y(Neuropeptide Y,Npy)、刺鼠相关肽(Agouti-related protein,Agrp)和GABA共表达神经元(“NAG”)（小编注：GABA能神经元产生哺乳动物中枢神经系统中主要的抑制性神经递质γ-氨基丁酸（GABA），GABA通过诱导Cl-内流或K+外流使神经元超极化，从而抑制神经活动，降低神经元活性，抑制神经细胞通过化学信号与其他神经细胞交流）。已有研究报道，NAG神经元的激活能够有效地刺激进食，而成年小鼠NAG神经元缺失会减少食物摄入量，导致体重减轻。研究人员通过将hrGFP序列插入Npy的翻译起始位点，构建出Npy-hrGFP小鼠，并采用组织学方法探究Gpr75与NAG神经元的共表达情况。已有文献报道99.5%的Npy-GFP神经元表达Agrp mRNA（小编注：作者检测的是AgRP/Npy神经元，这类神经元均为GABA能神经元，因此被称为NAG神经元。GABA能神经元中仅有15%左右为表达AgRP和Npy的NAG神经元）。RNAScope实验表明Gpr75的一小部分与NAG神经元共表达(使用Npy-hrGFP小鼠)，该结果与HypoMap数据库中的比对结果相吻合。此外，研究人员发现大约四分之一的NAG神经元共表达Gpr75(图1G)。从机制上来说，Agrp与阿片促黑激素皮质素原(Pro-opiomelanocortin,Pomc)衍生肽通过竞争结合黑皮质素4受体(Melanocortin 4 Receptor,Mc4r)以调节体重。基于此，MC4R激动剂setmelanotide被用于治疗遗传形式的极端肥胖（小编注：目前在食欲调控方面研究多集中于下丘脑弓状核(ARC)，该脑区存在两类与饮食相关的神经元：促进摄食的AgRP神经元和抑制摄食的POMC神经元，二者在调节能量平衡方面作用相反。AgRP神经元通过释放MC4R的拮抗剂NPY、GABA、AgRP，抑制MC4R的活性，刺激食物摄入，增加食物摄入量。而POMC神经元通过激活MC4R，抑制食物摄入，因此激活MC4R能够降低食欲，减少食物摄取，同时提高能量利用率）。以上数据表明，Gpr75影响约四分之一的NAG神经元的活动，提示Gpr75在大脑中具有异质性表达并参与调节参与食物摄入和脂质积累的区域的特定神经元群。

图1.Gpr75表达的表征

图S1.下丘脑Gpr75的表达

2. Gpr75 KO小鼠将HFD摄入量调整为与食物热量摄入量相当

为了探究Gpr75是否能够调控食欲，研究人员使用CRISPR-Cas9方法在Gpr75中产生5个碱基对的缺失，使得Gpr75序列提前终止(图2A、B)，从而生成了Gpr75 KO小鼠。研究人员发现雄性和雌性Gpr75 KO小鼠在NCD喂养时热量摄入与WT小鼠相似(图2D-G)，而在HFD喂养时，雄性和雌性Gpr75 KO小鼠减少摄食量，使得热量摄入量与NCD饮食相当。当WT和Gpr75 KO小鼠在对两种饮食进行选择时，两组小鼠均更偏好于HFD饮食，这表明HFD摄入量的降低与小鼠的饮食偏好无关(图S2N、O)。相比之下，WT小鼠在HFD喂养时的每日热量摄入量显著增加(图2D-G)，进而促进肥胖(图3)。随后研究人员进行了膳食模式分析，以探究小鼠在提供两种不同饮食情况下的摄食行为，结果发现与NCD喂养相比，WT和Gpr75 KO小鼠在HFD喂养时，每日的进食量和进食时间均减少，这与高热量食物产生的热量和饱腹感更高相一致(图2H、I)。与NCD喂养相比，HFD喂养的WT小鼠的进食频率更高(图2J)同时进食间隔时间更短(图2K)，进而导致HFD喂养下每日的热量摄入量增加(图2D-G)。而Gpr75 KO小鼠在HFD喂养下调整了进食量和进食时间，但没有改变进食频率和进食间隔(图2H-L)。以上数据表明，在HFD喂养下，Gpr75 KO小鼠摄入热量降低以维持能量代谢平衡。

研究人员还对WT和Gpr75 KO小鼠的能量消耗进行研究，发现雌性和雄性Gpr75 KO小鼠的身体活动明显增加(图2M-P、图S2A-D)，特别是在刚进入黑暗阶段时(图S2H-K)。当小鼠被NCD喂养或急性HFD喂养4天后，在每日能量消耗方面没有检测到基因型之间的总体差异 (图2Q、R)。研究人员对HFD喂养4-5个月的小鼠的能量消耗也进行了量化，结果发现最低代谢率（MMR;测量72小时内数值最低的20分钟）（小编注：作者在本文中使用MMR值来表征小鼠在完全静息情况下的基础代谢率，由于该数值可以排除活动等其他条件造成的影响，且仅和Lean Mass正相关，因此作者在后文中使用实时代谢率和MMR的比值用以消除小鼠的个体差异）与瘦体重显著相关，但不受性别或基因型的影响（图S2E）。在雌性小鼠中，测量的实时代谢率/MMR比值（小编注：此处作者把MMR作为代谢率基准，因为MMR仅和Lean Mass正相关，因此使用实时代谢率/MMR比值定量能量消耗情况，可以排除小鼠间的个体差异）显示黑暗周期比光照周期消耗更多的能量(图S2F)。除此之外，基因型也有很大影响，与WT小鼠相比，雌性Gpr75 KO小鼠在光照和黑暗周期中都具有更高的能量消耗(图S2J)，这种效应在雄性小鼠中没有达到统计学意义（图S2G）。然而由于KO小鼠身体活动量显著增加，因此研究人员认为能量消耗的小幅增加仍然可能具有生理意义（图S2H、I）。研究人员通过进一步的统计分析发现，与雄性Gpr75 KO小鼠相比，雌性Gpr75 KO小鼠活动更活跃(图S2M)。此外，与WT小鼠相比，雌性Gpr75 KO小鼠在黑暗阶段的能量消耗增加更大(图S2J)。以上数据表明，与WT小鼠相比，HFD喂养的Gpr75 KO小鼠在黑暗阶段的身体活动更加活跃，这与其在黑暗周期能量消耗升高相一致。

图2.Gpr75 KO小鼠在HFD饮食中表现出食物摄入量减少和活动增加

图S2.HFD喂养的WT和Gpr75 KO小鼠的能量平衡和食物选择

3. Gpr75 KO小鼠体脂较少，且在雌性小鼠中效果更为突出

由于Gpr75 KO小鼠在NCD饮食中表现出与WT小鼠相似的热量摄入和能量消耗水平，研究人员在NCD饮食下探究肥胖状态的基因型差异。研究人员对NCD喂养的WT和Gpr75 KO小鼠进行了为期4-5个月的体重和体脂监测，发现在NCD喂养下，雄性Gpr75 KO小鼠的体重与WT小鼠相当，而雌性Gpr75 KO小鼠的体重略低于WT小鼠。但在体脂方面，两种小鼠具有较大差异，雄性和雌性NCD喂养的Gpr75 KO小鼠的总脂肪量显著降低，内脏和皮下脂肪垫重量的减少尤为明显(图S3A-P)。

研究人员探究了HFD喂养对Gpr75 KO小鼠体重和脂质积累的影响。研究发现与HFD喂养的WT小鼠体重显著增加，而与WT小鼠相比，雄性Gpr75 KO小鼠体重增加量减少了50%，雌性Gpr75 KO小鼠减少了76%(图3A、F)。与WT小鼠相比，雄性Gpr75 KO小鼠在HFD喂养下增加的脂肪量减少了35%，雌性小鼠减少了74%。(图3B、G、图S3Q-V)，并且在内脏和皮下脂肪组织库中均发现了脂质的减少(图3D、E、I、J)。性别比较显示，HFD喂养的雌性Gpr75 KO小鼠体重和体脂的增加程度明显少于雄性Gpr75 KO小鼠(图3K、L)。内脏脂肪的组织学分析显示，HFD喂养的雌性Gpr75 KO小鼠的脂肪细胞发生了显著变化，而在NCD喂养的雌性Gpr75 KO小鼠、NCD喂养的雄性Gpr75 KO小鼠、HFD喂养的雄性Gpr75 KO小鼠中的变化并不明显(图3M)。研究人员通过qPCR分析发现HFD喂养的雌性Gpr75 KO小鼠的白色脂肪组织具有组织学上的棕色化特征(图3M-S)，HFD喂养的雄性Gpr75 KO小鼠产热基因表达水平和组织学结果均未发生显著变化(图S4C、D)。与WT小鼠相比，Gpr75 KO小鼠的棕色脂肪组织未发现显著变化(图S4B、E、F)。进一步的身体成分分析显示，与WT小鼠相比，雌性Gpr75 KO小鼠具有更高的骨矿物质含量和密度(图S4H、J)。这些数据表明，Gpr75功能的扰动可以保护雄性和雌性小鼠免受体重增加的影响，即使在HFD饮食下，这种表型也会保留，并且在雌性小鼠中更为明显。

图3.Gpr75的缺失与小鼠和人类的肥胖程度降低有关

图S3.NCD和HFD喂养的Gpr75 KO小鼠体脂减少

图S4.Gpr75 KO小鼠的脂肪组织和骨密度分析，以及Gpr75突变、体脂和肝功能的相关性

4. 人类GPR75 LOF突变对人类的影响

最近一份研究发现GPR75功能缺失突变与645,626人的BMI和全身脂肪较低具有相关性（小编注：2021年Science 中研究人员对 640,000 个外显子组进行测序分析以及功能缺失突变的预测结果发现GPR75具有46个罕见的预测功能缺失突变体，同时研究人员确定了46 个 LOF 变体在 GPR75 蛋白上的分布，其功能缺失归因于GPR75蛋白的截短突变，在46个LOF突变中有45个与较低BMI相关。本文引用21年Science鉴定出的LOF突变进行实验）。基于上述小鼠模型实验，研究人员推测GPR75可能对身体脂肪沉积具有性别二态效应。研究人员使用由428,719个欧洲血统个体组成的公开可用的UKBB外显子组，鉴定出145个个体(68个男性和77个女性)在GPR75编码区携带功能丧失(Loss-of-function,LOF)突变。并且研究人员证实与该组的非突变携带者相比，GPR75 LOF携带者具有较低的总体脂百分比。接下来，研究人员检查了不同性别的总体脂百分比，发现GPR75 LOF携带者中体脂百分比与BMI的变化与性别无关(图3T、图S4L、M)。当研究人员使用腰臀比WHR作为替代指标检查GPR75 LOF对体脂分布的影响时，在调整BMI后，GPR75 LOF突变与女性较高的WHR相关，而这种影响在男性中并不存在(图3U)。上述结果表明GPR75 LOF突变可能以性别依赖的方式影响人体内脂肪沉积。

目前大多数缺失后具有减肥效果的基因，也会导致脂肪营养不良，这种疾病损害脂质在脂肪细胞中的储存，从而导致有害的脂质在其他组织尤其是肝脏中的积累。于是研究人员进一步探究了GPR75 LOF突变是否可以预防或促进NAFLD。然而由于GPR75 LOF突变的罕见性，加上众所周知的UKBB健康参与者偏倚，导致与其他队列相比，UKBB中NAFLD的非代表性低患病率阻碍了对该疾病的直接分析。因此，研究人员通过血液中谷丙转氨酶、天冬氨酸转氨酶水平以及肝脂肪变性指数在内的肝功能测试来确定肝脂肪变性的可能性。尽管与非携带者相比，GPR75 LOF携带者的血液ALT和AST水平难以区分(图S4N、O)，但二者确实显示出BMI依赖性的低肝脂肪变性指数(Hepatic Steatosis Inde,HSI)评分（小编注：本研究中该指数的计算公式为:HSI=8×ALT/AST+BMI，如果是2型糖尿病患者或者女性则+2)(图3V)。以上结果表明，GPR75 LOF携带者具有较低的肝脏脂质积累风险。接下来，研究人员利用Gpr75 KO小鼠进一步探究了Gpr75突变对肝脏疾病的保护作用。

5.Gpr75 KO小鼠免受NAFLD的发展

为了研究GPR75对NAFLD的影响，研究人员对WT和GPR75 KO小鼠进行为期4-5个月的HFD喂养，通过分析脂肪含量、脂肪储存标志物和纤维化程度来评估肝脏健康情况。研究发现雄性和雌性Gpr75 KO小鼠的肝脏重量较轻，甘油三酯和脂质百分比降低(图4A-J)，而Gpr75 KO小鼠对肝脏脂质积累的保护作用未观察到性别差异(图S4K)。Gpr75 KO小鼠肝脏甘油三酯含量和脂质百分比的降低与脂滴储存标记物的表达降低相关，这些标记物包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator activated receptor gamma,Pparg)和脂肪酸结合蛋白4(Fatty acid binding protein-4,Fabp4)(图4K、L、Q、R)。Gpr75 KO小鼠的细胞外基质标志物Col1a1、Col2a1、组织金属蛋白酶抑制剂1(Tissue inhibitor of metalloprotease-1,Timp1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,aSMA)的表达也降低，表明与WT小鼠相比，HFD诱导的Gpr75 KO小鼠的肝纤维化减轻(图4M-P、图4S-V、图S4P)。这些数据表明Gpr75的缺失通过改变能量平衡而不是像脂肪营养不良那样通过限制脂肪组织的扩张来减少脂肪量。与WT小鼠相比，雄性和雌性Gpr75 KO小鼠都明显免受HFD诱导的肝脏脂质积累，并且NAFLD严重程度降低，这与UKBB的Gpr75 LOF携带者的分析结果一致。（小编注：本研究基于2021年再生元公司在Science期刊上发表的通过对人类外显子组研究，发现GRP75的LOF突变与低BMI正相关的报道进行进一步探索。通过综合人类测序数据和小鼠实验数据，发现GPR75缺失能够抑制肥胖，降低NAFLD相关的脂质积累，且表现为性别二态性，证明了GPR75是非酒精性脂肪肝病治疗的潜在药物靶点。本研究的创新性在于首次将孤儿受体GRP75和NAFLD/NASH治疗相关联。相较于GLP-1激动剂索马鲁肽，由于目前正在研发的GRP75拮抗剂效果显著更好，且无厌食、营养不良、索马鲁肽耐药等副作用，因此GRP75在药物治疗肥胖领域一直备受关注，但大多数研究仍局限于糖尿病和肥胖方向。该研究的出现进一步拓宽了人们对GRP75影响代谢的认知。）

图4.Gpr75 KO小鼠免受脂肪肝的侵害

总结

在本研究中，研究人员发现GPR75大量表达参与食欲调节的下丘脑神经元细胞亚群。在HFD喂养下，Gpr75 KO小鼠能够通过调整热量摄入和能量消耗以保持机体的脂类代谢维持稳定能量平衡，从而预防NAFLD的发生。通过对人类样本的大规模全外显子测序数据分析表明，GPR75缺失突变与肝脏脂肪变性呈负相关，因此该研究表明GPR75可能是NAFLD治疗的潜在药物靶点。

文章链接:https://www.cell.com/cell-metabolism/fulltext/S1550-4131(24)00120-7