代谢学人

Science ：权衡利弊肝自健 取舍之间糖自解

撰文 | 夏志蕊 王颖雯 闪光余 朱丽君 刘爽 曹玉香

编辑 | 孟美瑶

校对 | 朱丽君

背景介绍

糖原合成和脂肪生成是细胞储存能量的两条基本途径。在进食后，葡萄糖作为基础能量分子经门静脉转运至肝脏，肝细胞承担起处理多余葡萄糖的生理任务。胰腺β细胞产生的胰岛素引导肝细胞通过糖原合成过程将葡萄糖储存为糖原，或通过脂肪生成将葡萄糖储存为脂质。糖原合成从葡萄糖-6-磷酸（G6P）开始，G6P可以在葡萄糖磷酸变位酶1（Pgm1）的作用下生成G1P，再经UDP-葡萄糖焦磷酸化酶2（UGP2）催化生成UDPG，UDPG则在糖原合酶（GYS）催化下转化为糖原。在脂肪生成过程中，葡萄糖通过糖酵解途径被氧化并生成丙酮酸，然后在线粒体中转化为柠檬酸，柠檬酸被转运回细胞质中并被分解为乙酰辅酶A（acetyl-CoA）和草酰乙酸。细胞质中的乙酰辅酶A通过乙酰辅酶A羧化酶（ACACA）和脂肪酸合成酶（FASN）合成脂肪酸。尽管这两种储存能量的形式都很重要，但是机体利用葡萄糖合成糖原还是脂肪来进行碳储存的选择性仍然不清晰。

糖原合成和脂肪储存这两种方式之间存在的一个主要差异是它们在自身分解以提供能量的这个过程中对于活性氧（ROS）的调节。脂肪酸的氧化分解通过逆向电子运输导致ROS产生，但是糖原分解通过磷酸戊糖途径促进还原剂NADPH的产生，从而来增强ROS的清除（小编注：机体内葡萄糖升高时会引起线粒体负荷加重，产生过量的NADH和FADH2进入呼吸链，ROS则会在这个过程进一步增加，为了防止过高的葡萄糖引起的ROS，一部分葡萄糖会进入磷酸戊糖途径产生NADPH还原力以应对氧化应激；此外磷酸戊糖途径受到NADPH/NADP+比例的调节，当细胞内ROS增加，更多的NADPH为了清除ROS被消耗，磷酸戊糖途径中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶被激活，使得更多的葡萄糖流向磷酸戊糖途径而不是糖酵解。）。因此，通过脂肪生成来储存葡萄糖可能会带来潜在的风险，因为ROS水平的升高会导致脂肪变性并进一步诱导非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。为了避免这一情况，肝细胞可能会优先利用糖原合成这种方式来储存葡萄糖，从而在机体需要时供应能量，但其背后具体的选择机制仍有待深入探究。

近期发表在Science杂志上一篇题为“Hepatic glycogenesis antagonizes lipogenesis by blocking S1P via UDPG”的文章，研究人员发现肝细胞优先将葡萄糖转化为糖原以储存能量，并证明糖原合成的中间代谢产物UDPG可以转运到肝细胞的高尔基体中，通过与site-1蛋白酶（S1P）结合，抑制S1P介导的固醇调节元件结合蛋白（SREBPs）的剪切，从而抑制脂肪生成。

肝糖原生成通过UDPG阻断S1P，从而拮抗脂肪生成

拓展阅读

糖原合成途径

糖原合成过程是细胞内将葡萄糖转化为糖原储存能量的一种方式。糖原是一种葡萄糖多聚体，以α-1，4-糖苷键形成长链，约10个葡萄糖组成分枝，分枝处以α-1,6-糖苷键连接，主要储存在肝脏和肌肉细胞中（肝糖原和肌糖原），由以下几个步骤组成：

（1）葡萄糖经葡萄糖激酶（肝脏）或己糖激酶（肌肉）磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸（此步骤与糖酵解共用）；

（2）葡萄糖-6-磷酸经Pgm1（磷酸葡萄糖变位酶）生成G1P（1-磷酸葡萄糖），由于糖原主链需要α-1,4-糖苷键，因此葡萄糖C1上的半缩醛必须活化，才有利于与原来的糖原分子末端葡萄糖的C4羟基缩合；

（3）G1P和UTP经UGP2（UDPG焦磷酸化酶）生成UDPG（尿苷二磷酸葡萄糖）和焦磷酸，UDPG在体内作为葡萄糖的供体；

（4）UDPG的葡萄糖基不能直接与游离的葡萄糖相连接，而只能与糖原引物相连（小编注：糖原蛋白作为最初的葡萄糖基受体，通过糖基化修饰，将尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的葡萄糖基连接到自身的酪氨酸残基上，形成糖原合成的初始引物）。在GYS（糖原合酶）的作用下，糖链只能延长不能分枝，生成α-1,4-糖苷键，延长了一个葡萄糖。当糖链长度达到12-18个葡萄糖时，分枝酶将一段糖链转移到邻近的糖链上，以α-1,6-糖苷键相连，从而形成分支。

参考文献：

[1] Blanco A, et al. Medical Biochemistry, 2022, p.319-321.

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SREBP活化过程

甾醇调节元件结合蛋白(SREBPs)是控制哺乳动物细胞脂肪生成的转录因子。无活性的SREBP前体通过与SREBP裂解激活蛋白(SCAP)的C端WD40结构域结合而被隔离在内质网(ER)中（小编注：SREBP的活化过程会有SCAP、INSIG的参与。SCAP是一种内质网膜整合蛋白，含有8段跨膜的α螺旋；INSIG也是位于内质网上的一类含有六次跨膜螺旋的膜蛋白。在SREBP、SCAP与INSIG形成复合物以后，SREBP就被“困”在内质网。在细胞内胆固醇浓度低的时候，SCAP/SREBP复合物与INSIG 解离，这时可受一种称为Sar1的小G蛋白的作用。无活性的Sar1在被吸引到内质网膜面向细胞质基质一侧时，在内质网膜上一种名为 See12的鸟苷酸交换因子催化下，与其结合的GDP被 GTP取代，直接导致 Sar1的构象发生变化使其暴露出一段疏水尾。通过这段疏水尾,Sar1插入脂双层的内部，从而锚定到内质网膜上。而一旦Sar1 结合到内质网膜上，Sec23/24和See13/31等蛋白质即先后被招募过来，由此形成一个庞大的包被蛋白质复合物。这种复合物的形成可促使周围的膜扭曲、变形，然后出芽形成小泡离开内质网，随后与高尔基体融合）。SCAP通过外壳蛋白复合物II (COPII)从内质网将SREBP护送到高尔基体后，SREBP在高尔基体被1位点蛋白酶(S1P)和2位点蛋白酶(S2P)进行蛋白水解裂解，释放SREBP蛋白的N端，转运到细胞核中诱导脂肪代谢相关基因的转录。哺乳动物中有三种SREBPs亚型:SREBP1a、SREBP1c和SREBP2。SREBP1调控脂肪酸合成相关基因，SREBP2调控胆固醇合成代谢相关的基因。SCAP-SREBPs还可以将NLRP3和STING从内质网转运到高尔基体，从而调节免疫反应。与其同时，内质网应激诱导caspase 2的表达，caspase 2与S1P共定位并切割它以产生可溶的活性片段，该片段启动内质网中独立于SCAP的SREBP1/2激活（小编注：2018年一篇发表在CELL上的文章（DOI：10.1016/j.cell.2018.08.020）表明在内质网应激的情况下caspase-2被激活，它与S1P共定位于内质网并切割S1P，被切割了的S1P也可以行使水解SREBP的功能最后产生有活性的SREBP，但被切割了的S1P以何种方式激活SREBP尚未有文献报道）。

参考文献：

[1] Fei X, et al. Cell Rep. 2023;42(6):112586. 

[2] Kim JY, et al. Cell. 2018;175(1):133-145.e15.

敲黑板啦！

1.糖原合成的中间代谢产物UDPG抑制脂肪生成；

2. UDPG通过与S1P相互作用抑制SREBP的剪切从而抑制脂肪生成；

3. UDPG由SLC35F5转运到高尔基体中发挥抑制脂肪生成作用； 

4. UDPG治疗改善小鼠和人类NAFLD患者的肝脏脂肪变性。

研究结果

1.糖原合成抑制肝细胞中的脂肪生成

为了探索葡萄糖中的碳源更倾向于糖原合成还是脂肪生成，研究人员在培养原代肝细胞的无糖培养基中补充葡萄糖（图1A），发现肝细胞迅速利用葡萄糖合成糖原，并且通过比色法验证发现糖原水平在培养基补充葡萄糖后15min开始增加（图1B）；相反，脂肪生成在1h后开始（图1B）。研究人员通过¹³C示踪实验也验证了肝细胞中糖原合成优先性更高（图1C-E）（小编注：脂肪酸合成的最终产物是软脂酸（即16：0棕榈酸），机体其他的脂肪酸类型一般是通过软脂酸的延伸反应和去饱和反应得到的。在动物体内，软脂酸可以通过延伸酶得到18：0硬脂酸，硬脂酸再通过去饱和反应得到18：1油酸；同时软脂酸还可以直接通过去饱和酶得到16：1棕榈油酸）。为了排除血清胆固醇对脂肪生成的潜在影响，研究人员又使用无血清无糖培养基预处理细胞2小时，这种情况下细胞产生了最低糖原水平（图S1A），并且得到了与上述实验相似的结果（图S1B-D），提示肝细胞优先以糖原的形式储存葡萄糖。肝脏磷酸葡萄糖变位酶1（PGM1）是第一个催化糖原合成过程发生的酶。利用小干扰RNA敲低Pgm1导致葡萄糖碳源从糖原合成快速转化为脂肪合成（图1F-I，图S1E）。与此一致，当敲低催化G1P生成UDPG的第二个糖原合成酶即UDPG焦磷酸化酶2的相应编码基因（Ugp2）后，同样导致了向脂肪生成的转变（图S1F-J）。研究人员将过表达Pgm1和Ugp2的质粒转染到敲低的细胞中，发现可以挽救糖原合成并抑制碳源流向脂肪生成（图1J-L、图S1K-M）。此外，研究人员通过对Pgm1^+/−小鼠进行的¹³C葡萄糖示踪实验发现，和野生型小鼠相比，Pgm1^+/−小鼠有更多的碳源流向脂肪酸（图S1N）。以上结果表明，在葡萄糖代谢过程中，糖原合成过程可能拮抗肝细胞中的脂肪生成。

图1 糖原生成拮抗肝细胞中的脂肪生成

图S1 糖原合成抑制肝细胞中的脂肪生成

2.UDPG抑制脂肪生成

接下来，研究人员对肝细胞中糖原合成抑制脂肪生成的作用方式进行了研究，并预测糖原合成的中间代谢产物对脂肪生成有抑制作用。UDPG是糖原合成过程中的关键代谢产物，受到PGM1和UGP2的共同调控（图2A）。研究发现Pgm1或Ugp2的敲低导致肝细胞中UDPG含量减少（图2B）。UDPG的添加则抑制葡萄糖碳源流向脂肪生成的，表现为甘油三酯含量减少（图2C）和13C标记的棕榈酸和油酸减少（图2D）。同时，在使用UDPG处理的肝细胞中，包括Acaca，Fasn和Scd1在内的脂肪生成基因表达下调（图2E），表明UDPG抑制脂肪生成。由于在糖原合成过程中PGM1催化G6P生成G1P，UGP2催化G1P生成UDPG，这一发现提示存在脂肪生成受G1P调控的可能性。然而，在Ugp2基因敲低的肝细胞中导入外源G1P并不影响脂肪生成（图S2A）。此外，研究人员用糖原抑制剂（GPI）（小编注：糖原抑制剂GPI（Glycogen Phosphorylase Inhibitors）是一类能够抑制糖原磷酸化酶（Glycogen Phosphorylase, GP）活性的药物。GPI通过抑制GP的活性，减少糖原的分解）阻断糖原分解增加了糖原和UDPG的水平（图2F-G），这也导致了肝细胞中脂肪生成的减少（图2H-I、图S2B-C）。相反，糖原磷酸化酶（PYGL）（小编注：糖原磷酸化酶(Glycogen phosphatase)是糖原分解的限速酶，它催化糖原的磷酸解作用，使糖原分子从非还原端逐个断开α-1，4-糖苷键移去葡萄糖基，从糖原中释放出1-磷酸葡萄糖）的过表达下调了糖原和UDPG水平（图2J-K），并趋向于增强脂肪合成（图2L-M、图S2D-E）。此外，研究人员为了排除糖原对脂肪生成的影响，在肝细胞中敲低了Gys2基因的水平(小编注：糖原合成酶(Glycogen synthase)在哺乳动物体内由Gys1和Gys2这两个基因编码,Gys1主要在肌肉和其他组织中表达，而Gys2则主要在肝脏中特异性表达) ，这导致肝细胞中糖原和甘油三酯减少（图2N），但是增加了肝细胞中UDPG含量（图S2F） 已修改。同时，13C葡萄糖示踪实验显示，在预先经过无葡萄糖无血清培养基处理的原代肝细胞中13C-UDPG M+6含量变化趋势与脂肪生成相反（图2O、图S2G）。UDPG通常由UDP-葡萄糖6-脱氢酶（UGDH）催化为尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA）。实验探究发现UDPGA的添加对肝细胞的脂肪生成没有影响（图2P、图S2H-I）。嘌呤受体P2Y14可以被UDPG识别，在多种细胞类型中转导信号。用PPTN（4,7-二取代-2-萘酸衍生物）或siRNA阻断P2Y14并不改变UDPG对肝脏脂肪生成的影响（图S2J-O）。胰岛素在脂肪生成中发挥重要作用，所以研究人员在UDPG、胰岛素或UDPG+胰岛素三种处理条件下，用13C葡萄糖处理禁食2小时的肝细胞。在胰岛素存在的条件下，脂肪生成滞后于糖原生成，研究发现即使在胰岛素存在的条件下，UDPG依然保持其对脂肪生成的抑制作用（图S2P-T）。AKT和S6K（小编注：胰岛素通过与受体结合可以激活PI3K/Akt通路，而PI3K/Akt通路是通过mTOR传递信号的，mTOR下游的一个主要效应因子是S6K）的磷酸化未发生改变，这说明并不是由于UDPG处理使胰岛素信号失活造成的（图S2U）。以上结果表明，糖原合成可以动员中间代谢产物UDPG来拮抗肝脏脂肪生成。

图2 UDPG被确定为抑制脂肪生成的中间代谢物

图S2 UDPG抑制脂肪生成非依赖性嘌呤能受体P2Y14

3.UDPG破坏高尔基体中SREBP的剪切

研究人员继续探究UDPG抑制脂肪生成的分子机制。SREBP1a、SREBP1c和SREBP2是参与脂合成的关键转录因子。SREBP-1的表达受胰岛素调节（小编注：胰岛素刺激的PI3K-AKT途径和mTOR途径激活并调节SREBP1c，主要包括：（1）胰岛素激活下游AKT表达，使其磷酸化GSK3β并抑制其下游的FBXW7，导致FBXW7介导的泛素蛋白酶体系统减少了SREBP的降解；（2）AKT磷酸化并抑制INSIG2A，导致SREBP-SCAP复合物离开内质网进入高尔基体；（3）AKT磷酸化TSC蛋白导致mTORC1被Rheb激活，促进SREBP的翻译；（4）mTORC1磷酸化lipin-1，从而激活核SREBP1；（5）mTORC1磷酸化并抑制CRTC2导致SEC31的释放，从而促进了sec23-sec24复合物的形成，该复合物进而促进了SREBP1从内质网到高尔基体的转运。在能量丰富或合成代谢状态下，胰岛素信号和mTOR可能激活多种途径，在多种水平上激活或稳定SREBPs），SREBP-2的表达更多地依赖于甾醇。SREBP1在肝脏中的主要形式SREBP1c，对肝脏脂肪生成至关重要；它最初以全长形式存在于内质网膜上，与SREBP剪切激活蛋白（SCAP）相互作用。在没有胆固醇的情况下，SCAP会协助SREBP进入COPII囊泡，然后进入高尔基体，在高尔基体中S1P和site-2蛋白酶（S2P）剪切SREBP成为n-SREBP，而n-SREBP能够反式激活脂肪生成基因。在UDPG处理的肝细胞中，SREBP1a、SREBP1c和SREBP2的mRNA水平不受影响，而SREBP1的剪切形式被抑制（图3B）。同时，在UDPG处理的肝细胞中，进入细胞核的n-SREBP1减少（图3C），同时伴随着Scd1、Fasn和Acaca基因表达的下调（图2E）。核内SREBP2及其靶基因（Hmgcr和Hmgcs1）也呈现出了类似的结果（图3D，图S3A-B），以上结果表明UDPG阻碍SREBP的剪切。在胰岛素存在的条件下，UDPG处理也降低了n-SREBP1的水平（图S3C），这与之前的结果（S2T）一致。同时，通过敲低Pgm1或Ugp2来降低UDPG水平，使得nSREBP表达增加（图2B，图3E），同时伴随着成脂基因表达的上调（图S3D）；而加入UDPG后nSREBP的表达降低（图3F-G、图S3E-F），同时伴随着成脂基因的表达下调（图3H、图S3G）。利用Flag-SREBP1（Flag位于N末端）转染肝细胞，在胆固醇剥夺后，Flag标签可以从内质网转移到肝细胞的细胞核中，但是UDPG的加入并不影响Flag标签进入高尔基体，但阻碍了其进入细胞核（图3I-J）。 

除了SREBP1c，碳水化合物反应元件结合蛋白( carbohydrate responsive element-binding protein，ChREBP )（ChREBP与脂合成的机制在20240307期“Cell Metabolism：奶茶全糖去冰，肝脏还原应激！”说明）是肝脏脂肪生成的另一个转录激活因子。然而，UDPG处理并不影响肝细胞中ChREBP的mRNA和蛋白水平（图S3H-J）。此外，在ChREBPa敲减的肝细胞中，UDPG仍然保持其对脂肪生成的抑制作用（图S3K-N）。以上结果表明UDPG在高尔基体中负调控SREBP的剪切，从而抑制肝脏脂肪生成。

图3 UDPG调节高尔基体中的SREBP剪切

图S3 UDPG独立于ChREBP调节SREBP的剪切

4.UDPG通过结合S1P阻断SREBP的剪切

研究人员尝试阐明UDPG调控SREBP剪切的机制。使用荧光标记的UDPG处理胆固醇剥夺的肝细胞，研究人员发现UDPG没有定位于内质网，而是定位于高尔基体中（图4A），并使用液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）证明UDPG不定位于ER中，而是存在于高尔基体中（图4B）。在使用饥饿的肝细胞进行实验时，研究人员发现葡萄糖的供应可以导致高尔基体与细胞质中UDPG的比率初期增加，1小时后达到峰值，随后逐渐减少，与肝细胞内脂肪合成的增加相关（图S4A）。但是敲低Pgm1或Ugp2或过表达Pygl都能降低高尔基体中UDPG的含量（图4C-D）。S1P和S2P分别在高尔基体的腔内环和跨膜域处裂解SREBP，生成n-SREBP。于是研究人员推测UDPG通过结合S1P或S2P或同时结合S1P与S2P，从而干扰SREBP的切割。使用血凝素( HA )标记的SREBP1c、S1P或S2P与UDPG共孵育（小编注：血凝素HA标签是一段由9-10个氨基酸组成的短序列，来源于流感病毒血凝素蛋白的特定区域，可以融合到蛋白质的C端或N端，通过抗HA标签的抗体进行特异性的识别和检测），通过LC-MS / MS证明 UDPG与S1P结合，而并不与SREBP1c或S2P结合（图4E-F）。与此同时，研究人员采用点击化学的方法将与UDP-2-N3-Glc （Azido-UPG）连接的蛋白拉下来进行质谱分析。结果表明，UDPG只与S1P结合，而不结合S2P或SREBP（图4G-H）。研究人员使用GO和KEGG分析，所得的结果表明UDPG结合蛋白富集在脂肪酸代谢途径（图S4B）。同时，利用过表达S1P和SREBP1c的293T细胞，研究人员发现UDPG的添加抑制了S1P介导的SREBP1c剪切（图4I）。然而，这种UDPG介导的效应在S1P敲低的肝细胞中并没有发生（图S4C-F）。研究人员通过生物膜干涉技术(BLI)实验（小编注：生物膜干涉技术（BLI）采用探针式生物传感器对样品直接进行检测，对检测样品无需做任何荧光或同位素标记。通过仪器发射白光到传感器表面并收集反射光，不同频率的反射光谱受到生物传感器的光膜层厚度的影响并形成干涉。通过对分子结合过程的实时监测，系统会测定结合常数（ka或kon）和解离常数（kd或koff），以及起始结合速率，并通过拟合计算分析得到亲和力（KD）和浓度信息），发现UDPG可以直接与S1P结合（图4J、图S4G）。为了探究UDPG调控S1P活性的结构基础，研究人员使用基于Uniprot网站的分子操作环境(MOE)软件进行了分子对接模拟。如图4K和图S4H所示，2D和3D结合模式下UDPG与S1P的结合亲和力估计为-7.77949kca/mol，残基N328、N329、E435、N438、M522、E592和T593显示与UDPG (N, Asn; E, Glu; M, Met; T, Thr)存在潜在的相互作用。通过构建带有HA标签的相应S1P突变体载体[ N328A ( Asn328→Ala )、N329A、E435A、N438A、M522A、E592A或T593A]进行探究发现N438A和T593A突变对S1P的表达和折叠没有影响，但破坏了UDPG与S1P的结合（图4L、图S4I-L）。研究人员对突变条件下n-SREBP1c表达量的分析也得到了相同结果（图4M、图S4M）。在Hep3B细胞中敲入突变的S1P（N438A）也导致UDPG与S1P结合受抑制，从而促进了S1P对SREBP1的剪切（图S4N-P）。除SREBPs外，S1P对其他底物的剪切，如ATF6和GlcNAc-1-磷酰转移酶等，也被UDPG所抑制（图S4Q-R）。并且研究人员也发现UDPG不改变肝细胞中S1P的mRNA水平，但下调其蛋白表达，提示UDPG很可能影响S1P的蛋白稳定性（图4N、图S4S）。 

同时，研究人员通过圆二色谱（小编注：圆二色谱（CD谱）是一种广泛应用于生物化学和结构生物学领域的分析技术，主要用于测定蛋白质、核酸和多糖等手性分子的二级结构和立体构型。CD谱通过测量生物分子对左、右圆偏振光不同程度的吸收差异（称为圆二色性），进而揭示分子的结构和构象信息。这种差异通常以椭圆度（Ellipticity，θ）表示，并通过特定的光学仪器—圆二色光谱仪进行检测）揭示了UDPG结合后S1P的构象变化（图S4T）。构象变化通常诱导蛋白质通过泛素-蛋白酶体途径进行降解（小编注：蛋白质构象变化所引起的改变与蛋白质本身功能有关，如果该蛋白质是酶类，依赖于特定的三维结构催化化学反应，那么构象变化可能会导致酶活位点暴露或隐藏，因此改变催化效率；如果该蛋白质通过和其他蛋白质相互作用来传递信号，那么构象变化可能会导致蛋白质间的相互作用模式改变，从而影响传导途径。但是通常构象变化容易导致蛋白质的稳定性降低，使其更加容易被降解，或形成新的结构，影响稳定性），研究人员发现与自噬抑制剂巴弗洛霉素A1 (BafA1)相比，蛋白酶体抑制剂MG132能够阻断UDPG诱导的S1P降解（图4O）。研究人员进一步使用蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)证明UDPG处理促进S1P的降解，但没有使S1P (N438A)突变体发生降解（图4P）。同时UDPG处理增强了S1P的泛素化，但没有增强S1P的突变体（N438A）的泛素化（图4Q）。S1P两个赖氨酸位点（K433和K443）位于N438附近，研究人员将它们分别突变为K433R和K443R，均不影响UDPG与S1P的结合（图S4U）；然而，K443R突变抑制了UDPG介导的S1P泛素化降解（图S4V-W）。以上结果表明UDPG与S1P相互作用并促进其降解，从而抑制SREBP在高尔基体中的剪切。

图4 UDPG通过结合S1P阻碍SREBP的剪切

图S4 UDPG通过结合S1P阻碍SREBP的剪切

5.SLC35F5将UDPG转运至高尔基体

 鉴于糖原生成发生在产生UDPG的细胞质中，研究人员进一步研究了UDPG如何从细胞质转运至高尔基体。溶质载体家族35（SLC35）是一种Ⅲ型跨膜蛋白，包含从SLC35A到SLC35G的7个亚家族，介导胞质核苷酸糖向高尔基体囊泡腔的转运。研究人员通过对mRNA表达水平的检测，在小鼠肝细胞中鉴定出了大量SLC35成员(图5A）。研究人员使用siRNA敲低前10个候选基因（a1、a3、a4、b1、d1、d2、e1、e2、f5、f6）的表达，并用流式细胞术分析脂质结合染料BODIPY发现，Slc35f5基因敲减后的细胞荧光强度最高（图5B和图5A）。并且LC-MS/MS和荧光显微镜观察结果同样显示，Slc35f5敲低抑制了UDPG进入高尔基体（图5C-D），同时伴随着肝细胞n-SREBP1含量、成脂基因表达水平和脂肪酸合成的上调（图5E-G、图S5B-C）。研究人员在体内做了验证，利用基于流体力学的基因递送技术在小鼠肝细胞中敲低Slc35f5，发现在Slc35f5敲低小鼠的肝脏组织中葡萄糖向糖原的流动减少，而向甘油三酯的流动增加（图S5D-F）。相反，在细胞中过表达Slc35f5促进了UDPG进入高尔基体，进而减少n-SREBP1含量、下调成脂基因表达和脂肪酸合成水平（图5H-L、图S5G-H）。此外，UDPG处理的Slc35f5过表达肝细胞产生了更强的抑制脂肪生成作用（图5H-L，图S5G-H）。以上结果表明是由肝细胞动员SLC35F5将UDPG转运到高尔基体的。

拓展阅读

核苷酸糖与高尔基

核苷酸糖是核苷二磷酸或核苷一磷酸与不同单糖异头体羟基形成的衍生物，是糖类合成或相互转换时的活化形式。常见的核苷酸糖有UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-半乳糖、UDP-GalNAc、UDP-木糖等。高尔基体是真核细胞中的一个重要细胞器，参与蛋白质和脂质的后期修饰、糖基化、蛋白质的分选和包装、细胞壁合成、分泌作用、膜转化、细胞信号转导、细胞死亡等生物功能。其中核苷酸糖和3 ' -磷酸腺苷5 ' -磷酸硫酸盐(PAPS)从细胞质运输到内质网和高尔基体，以此作为蛋白质、脂质和蛋白聚糖的糖基化和硫酸化的底物。而这种易位过程是由核苷酸糖转运蛋白(NSTs)完成的，这是一个高度保守的疏水蛋白家族，具有多个跨膜结构域，是溶质载体家族35 (SLC35)的一部分。以CMP-唾液酸和UDP-半乳糖的转运为例：CMP-唾液酸转移到受体分子后，释放的CMP通过CMP-唾液酸转运体（CST，SLC35A1）转运出高尔基体。然而，从UDP-半乳糖上释放的UDP则需要先通过ENTPD转化为UMP才能转运出高尔基体，更加具体的机制还有待进一步探索。

参考文献：

[1] Song Z. Mol Aspects Med. 2013;34(2-3):590-600.

图5 SLC35F5介导UDPG转运到高尔基体中

图S5 SLC35F5抑制UDPG诱导的脂肪生成

6.UDPG治疗缓解小鼠的肝脏脂肪变性

UDPG可能会通过抑制肝脏脂肪生成减轻肝脏脂肪变性。研究人员将小鼠禁食12 h后，腹腔注射葡萄糖（2g/kg）。通过比色法对肝脏进行生化分析，发现糖原水平在补充葡萄糖15min后开始增加，60min后在肝细胞中检测到脂肪生成  （图6A）。值得关注的是，腹腔注射UDPG可进一步延迟脂肪生成时间点（图6B）。通过腹腔注射UDPG类似物UDP-2-N3-Glc验证外源性UDPG能够进入肝细胞（图S6A）。与糖原合成和脂肪生成的变化保持一致，¹³C标记的葡萄糖在体内示踪显示肝脏M+6 UDPG水平先升高后降低（图S6B）。接着用UDPG（8mg/kg，每日1次）处理正常饮食的小鼠7天（图6C），检测结果显示，虽然总甘油三脂含量只下降了13%（图S6C），但与未处理小鼠相比，新合成的脂肪酸含量显著减少（图6D），这提示UDPG可能是抗NAFLD的潜在药物。研究人员对小鼠进行16周的高脂饮食（HFD）喂养，以形成小鼠NAFLD模型，表现为肝脏气球样变、脂滴积累，以及肝脏和血清中三酰甘油和胆固醇积累（图6E-H）。特别的是PAS染色和LC-MS/MS分析结果显示，肝脏中糖原含量和UDPG水平降低（图6I-J），同时伴随着Pgm1和Ugp2表达的下调（图6K），表明NAFLD小鼠中肝脏糖原合成受到限制。HFD组小鼠从第8周开始接受UDPG治疗，治疗时间持续8周，结果发现UDPG处理对摄食量没有明显影响，但可以降低小鼠体重（图6L、图S6D）。HE染色结果显示，UDPG处理改善肝脏气球样变和脂滴积累，并且降低肝脏和血清中的三酰甘油和胆固醇含量（图6F-H），同时伴随着Acaca、Fasn和Scd1基因表达的下调和n-SREBP1的减少（图6M，图S6E）。同时，UDPG处理恢复了肝脏糖原合成，表现为糖原含量和Pgm1和Ugp2表达的增加（图6I-K）。并且UDPG处理不影响血糖水平、糖耐量和酮体水平（β-羟丁酸），也不改变肝脏糖异生酶和胰岛素信号传导（图S6F-J）。添加的UDPG可以转移到高尔基体，与S1P结合（图6N-O）；在UDPG处理后，SLC35F5在高尔基体中表达上调（图6P）。以上结果表明UDPG可能是治疗肝脂肪变性的潜在药物。

图6 UDPG给药可缓解小鼠HFD模型中的肝脂肪变性

图S6 UDPG治疗可缓解小鼠NAFLD进程

7.糖原合成的关键代谢产物UDPG拮抗脂肪生成

研究人员尝试在人肝细胞和NAFLD患者样本中进行验证，用人S1P、S2P和SREBP1c证实UDPG能够与人S1P的结合，而不是人S2P或SREBP1c，研究人员通过LC-MS/MS分析和BLI实验（图7A-B）也证明了这一点。同时如果将关键氨基酸残基进行突变(N438A或T593A)则破坏了人S1P与UDPG的结合（图S7A）。研究人员通过将人S1P和SREBP1c载体共转染HEK 293T细胞，证明了UDPG阻碍了S1P对SREBP1c的切割（图S7B）。研究人员又从肝血管瘤患者的肝脏组织中分离出原代肝细胞，使用UDPG处理原代肝细胞后，糖原含量增加（图7C），但甘油三酯和人n-SREBP1水平降低（图7D-E、图S7C）。此外，在用无血清无糖培养基预处理的人原代肝细胞中添加葡萄糖后，在30min内糖原含量开始增加，但在葡萄糖补充2h后甘油三酯含量增加(图7F)。这种糖原生成的优先性也被¹³C葡萄糖示踪实验所证实（图7G-H）。研究人员通过收集正常和NAFLD肝组织（图S7D），发现与正常组织相比，糖原含量和UDPG水平在NAFLD组织中降低（图7I-J），同时伴随着PGM1和UGP2的表达下调（图7K-L）。ACACA、FASN和SCD1在NAFLD肝细胞中表达上调，同时伴随着n-SREBP1表达上调（图S7E-F）。为了进一步验证以上结果，研究人员使用游离脂肪酸（油酸与棕榈酸比例为2 : 1）诱导原代肝细胞发生脂肪变性，再用UDPG处理后发现糖原含量增加（图S7G），甘油三酯和n-SREBP1含量降低（图S7H-I），ACACA、FASN和SCD1表达下调（图S7J）。此外，UDPG处理增加了细胞中SLC35F5 mRNA的表达（图S7K）。此外，研究人员还使用油酸诱导人肝细胞类器官发生脂肪变性，发现UDPG处理确实增加了类器官中糖原含量，降低了甘油三酯含量（图7M-N、图S7L-M）。以上结果表明UDPG抑制人肝细胞和NAFLD患者的脂肪生成。

图7 在NAFLD患者中，糖原生成通过UDPG拮抗脂肪生成

图S7 UDPG抑制人肝细胞中的脂肪生成

总结

糖原合成与脂肪合成是机体储存能量最关键的两条途径，但进食条件下葡萄糖倾向于糖原合成还是脂肪合成却尚未得知。在本研究中，研究人员证明了肝细胞中的葡萄糖优先转化为糖原，在糖原含量达到饱和之后才流向脂肪酸，并且发现了肝细胞中糖原生成对脂肪生成的调控机制。糖原一直被认为只在肝脏和肌肉中储存和供应能量，然而糖原代谢异常可能导致肿瘤发生。因此，糖原的生理功能不仅限于能量储存，其病理生理作用值得全面考察。在本文中研究人员发现UDPG水平随着糖原生成和脂肪生成的变化而先升高后降低。并且这种UDPG介导的调节具有特异性，为了实现这种调控，UDPG需要进入高尔基体，在高尔基体腔中运输。同时研究人员也进一步证明了核苷酸糖转运体SLC35F5能够介导UDPG进入高尔基体腔，在高尔基体中UDPG与S1P结合。S1P能够通过剪切SREBP并启动具有转录活性的N-末端片段的释放来控制肝细胞和其他细胞中的脂肪生成，同时利用LC-MS/MS和BLI验证UDPG能够与S1P结合，从而抑制S1P介导的SREBP的剪切和随后的脂肪合成。脂肪从头合成的增加是NAFLD形成的重要原因，因此UDPG可能成为NAFLD治疗的一个有前途的候选者，并且UDPG介导的脂肪生成调节可能为人类脂代谢异常的调节开辟新的治疗途径。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.adi33325605&lang=zh_CN

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转载本文请联系原作者获取授权，同时请注明本文来自徐凌燕科学网博客。

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