撰文 | 李欣茜 郑宇含 张彦康 张婷 仲银召 李雨

编辑 | 孟美瑶

校对 | 张婷

研究背景

衰老是一个不可避免的过程，随着时间的推移，最终导致细胞稳态和自我修复能力的逐步丧失，进而导致全身生理功能的下降。许多与衰老相关的慢性疾病，如心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病和癌症，给医疗保健系统带来了巨大的负担。因此，探究衰老的基本机制，寻找对抗衰老和治疗衰老相关疾病的方法是非常必要的。

从机制上来看，衰老过程主要归因于细胞、细胞器和大分子随机损伤的逐步积累。但损伤的确切机制尚不完全清楚，可能与细胞自主过程相关，包括基因组不稳定、端粒磨损、表观遗传改变、蛋白质稳态丧失、营养感知失调、线粒体功能障碍、细胞衰老和干细胞衰竭。然而，非细胞自主机制，特别是细胞间或组织间交流的改变，对衰老也有着至关重要的影响。组织间的有效交流依托于血液流动造就的环境因素，这对维持整个身体的健康状态至关重要。因此，衰老相关疾病的发生被认为是由组织间交流受损引起的，且血液中循环分子是主要贡献因子。最近的研究表明，在异体共生(一种将两只不同年龄动物的循环系统连接在一起的外科手术)实验中，来自年轻小鼠的血液能使衰老小鼠的大脑、心脏、肝脏、胰腺、肾脏、骨骼肌和骨骼恢复活力。随后几项研究进一步表明，血浆输注能重现异体共生模型中血液共循环所造成的表型。从此，人们一直致力于寻找血浆中与逆转年龄相关损伤有关的因子。迄今为止，已经发现了几种存在于年轻血浆中的年轻化因子(也称为血源性因子、促青春因子或抗衰老因子)。然而，这些血浆因子发挥作用的确切机制尚未明晰。

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血浆中的年轻化因子

异体共生的动物研究表明，年轻的血液对衰老相关疾病具有强大的治疗作用。近年来，越来越多研究揭示了在这一效应中发挥关键作用的血液因子，如GDF11（生长分化因子11）、CCL11（C-C基序趋化因子11）、TIMP2（组织金属蛋白酶抑制剂2）、OCN（骨钙素）和PF4（血小板因子）。 GDF11是一种属于转化生长因子-β超家族的分泌蛋白，随着年龄增长血液中GDF11水平逐渐下降，而给衰老小鼠静脉注射重组GDF11蛋白（rGDF11）4周，衰老小鼠血液中GDF11水平可恢复至年轻小鼠水平，并改善衰老小鼠心脏肥厚现象。此外，GDF11还可直接作用于海马神经元，通过促进自噬途径，增强神经元活性，改善衰老小鼠认知水平。 血液中CCL11水平随着年龄的增长而积累。有研究发现给予年轻小鼠CCL11处理，可减少突触并促进海马中小胶质细胞的激活，破坏年轻小鼠的认知功能。 TIMP2是一种富集于人脐带血浆、幼鼠血浆和幼鼠海马中的血源性因子。给衰老小鼠补充TIMP2，可显著增加衰老小鼠的突触可塑性和海马依赖性认知水平。而将缺乏TIMP2的人脐带血浆注射到衰老小鼠体内，并不能改善衰老小鼠的学习记忆水平；利用TIMP2中和抗体注射年轻小鼠，可破坏年轻小鼠的学习记忆能力。提示TIMP2是脐带血浆改善大脑衰老的关键介质。 血液中OCN水平随着年龄增长而下降。研究发现，给衰老小鼠补充OCN，OCN可穿过血脑屏障，与海马神经元上GPR158受体结合，通过BDNF信号途径（该信号途径是海马依赖性记忆的关键分子突进，可促进神经细胞生存，神经发生和突触可塑性）改善衰老小鼠认知功能。 近年来，研究人员发现血小板衍生的趋化因子PF4是一种促年轻因子，可减轻衰老相关的神经炎症，引起突触可塑性相关的分子变化，并挽救衰老小鼠海马依赖的学习记忆水平，提示PF4可作为减轻炎症和挽救衰老认知的潜在治疗靶点。

参考文献：

[1] Loffredo FS, et al. Cell. 2013 May 9;153(4):828-39.

[2] Moigneu C, et al. Nat Aging. 2023 Feb;3(2):213-228. 

[3] Das MM, et al. Commun Biol. 2019 Feb 20;2:73. 

[4] Castellano JM, et al. Nature. 2017 Apr 27;544(7651):488-492. 

[5] Khrimian L, et al. J Exp Med. 2017 Oct 2;214(10):2859-2873.

[6] Schroer AB, et al. Nature. 2023 Aug;620(7976):1071-1079.

在过去十年中，细胞外囊泡（EV）介导的细胞间通讯为我们对多细胞生物遗传信息传递和稳态维持的认识增加了一个新的维度。EV是一类异质性纳米膜囊泡，由富含蛋白质的脂质双分子层和来自EV产生细胞的蛋白质和RNA组成。EVs 通过血液循环输送至全身，是细胞间通信网络的信使，促进供体细胞和受体细胞之间的物质传递。由于血液中存在大量具有生物活性的EVs，而且EVs会对全身生理机能和稳态造成多方面的影响，因此血液中的EVs可能会通过一种非细胞自主机制来介导衰老过程，并作为关键介质参与年轻血液改善衰老组织功能的过程。

在这项研究中，研究人员重点研究了小细胞外囊泡（sEVs，<200 nm），并通过向衰老小鼠多次注射来自年轻小鼠或人类的sEVs探索其年轻化作用。此外，研究人员还利用体内和体外模型，进一步阐明了年轻sEVs在逆转与年龄有关的损伤和退行性变化方面发挥关键作用的分子基础。

敲黑板啦！

1.年轻sEVs可以延长衰老小鼠的寿命，减轻衰老表型，并改善多个组织中与年龄相关的功能衰退

2.年轻sEVs治疗后，衰老小鼠组织的蛋白质组学会发生实质性的变化，并与代谢过程密切相关

3.年轻sEVs通过其miRNA负载促进PGC-1α在体外和体内的表达，从而起到改善线粒体功能并减轻衰老组织中线粒体缺陷的作用

研究结果

1.年轻sEVs长期治疗对寿命和衰弱的影响

首先，研究人员分别从年轻（2月龄）和衰老（20月龄）雄性小鼠血浆中纯化sEVs（小编注：本文采用超速离心的方法纯化sEV。首先用等体积PBS稀释血浆，然后在4°C条件下以以下转速和时间依次离心：500g离心5分钟，3000g离心25分钟，12000g离心60分钟，最后120000g离心70分钟，收集sEV沉淀。然后利用外泌体分离试剂盒（Invitrogen，沉淀法）进一步处理上清，获取sEV，提高sEV纯化效率。此种纯化方法从1mL血浆中可以获得约1000μg总蛋白含量的sEV。），并通过纳米颗粒跟踪分析（NTA），发现年轻和衰老小鼠血浆中sEVs的数量级相同（年轻血浆中sEVs为1.7×109粒子/毫升，衰老血浆中sEVs为1.04×109粒子/毫升），同时颗粒大小相近（在约100 nm处达到峰值）（图S1a）。透射电镜（TEM）结果表明纯化后的年轻sEVs具有正常sEVs的形态特征和大小（图S1b）。WB结果显示，在纯化的年轻sEVs和衰老sEVs中经典sEVs标记物（CD9、CD63、Alix和Tsg101）高度富集，并且没有检测到主要的血浆蛋白（Albumin）和内质网蛋白（Calnexin）（图S1c），这表明纯化的sEVs未被血浆和细胞内组分污染。

为了探究从年轻小鼠血浆纯化的sEVs是否能延长衰老小鼠寿命，研究人员向20月龄衰老雄性小鼠每周静脉注射1次PBS或年轻sEVs（小编注：研究人员根据sEVs中的总蛋白含量定量，用PBS将提取的sEV稀释到蛋白浓度为1.80μg/μl，每次注射200ul，共注射含360μg蛋白的sEVs。由于研究人员的纯化方式从1mL血浆中可以获得约1000μg总蛋白含量的sEVs，因此换算下来每只小鼠每次注射量相当于0.36mL年轻小鼠血浆。），直至小鼠死亡。结果表明，每周注射年轻sEVs可使衰老小鼠的中位寿命显著延长12.42%（注射年轻sEVs的小鼠寿命为34.4个月，注射PBS的小鼠为30.6个月）（图1a）。通常情况下年轻小鼠背部的毛发乌黑有光泽，衰老小鼠则毛发灰白且伴有脱落，而年轻sEVs治疗使衰老小鼠外观看起来更健康，基本阻止了衰老小鼠的毛发脱落现象（图1b）。

衰弱是一种衰老相关的综合征，其特点是许多生理系统功能衰退，导致体内平衡失调，更容易对健康造成不良影响。此前的研究建立了一套不对小鼠造成侵入性伤害的衰弱评估体系，即通过临床评估来量化衰老小鼠的衰弱状态。依照这一客观指标，研究人员发现衰老小鼠的平均衰弱指数得分远高于年轻小鼠，而用年轻sEVs治疗能够明显降低衰老小鼠的衰弱指数（图1c），这使sEVs治疗的衰老小鼠的生物年龄（与生理退化程度相符的估计年龄，而非实际年龄）仅为15.1个月，而它们的实际年龄为24个月。特别的是，年轻sEVs治疗明显改善了衰老小鼠所有具有缺陷的临床症状，其中对皮肤和肌肉骨骼系统的改善最明显。

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非侵入性衰弱评估体系

传统的小鼠衰弱评估体系需要使用专用的设备和一些侵入性方法，例如专业的血液成分分析仪、利用X射线测量小鼠身体组分等。非侵入性衰弱评估体系共测量了31个与健康相关的临床指标，测量的指标更多，包括体表情况、肌肉骨骼系统、听觉、视觉、嗅觉、消化、泌尿生殖系统、呼吸、不适迹象、体表温度和体重变化等多方面。此外，与传统衰弱评分不同，非侵入性衰弱评估体系的衰弱评分与年龄之间的指数关系在小鼠和人类中具有相似性，能更好地利用小鼠模型反映人类的衰老情况。

参考文献：[1] Whitehead JC, et al. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2014 Jun;69(6):621-32.

                            图S1.表征纯化sEVs

               图1.年轻sEVs长期治疗对衰老小鼠寿命和全身生理的影响

2.年轻sEVs长期治疗对全身生理的影响

首先，为了评估年轻sEVs对不同组织和器官的长期改善作用，研究人员给20月龄衰老雄性小鼠每周静脉注射一次PBS或年轻sEVs，持续注射18周（图S2a）。据报道，高龄会对男性生育功能造成负面影响，会导致精子数量减少、精子活力降低和DNA片段化，于是研究人员首先探究了年轻sEVs能否改善雄性衰老小鼠的精子质量和生育能力。与年轻小鼠相比，衰老小鼠血浆和睾丸中的睾酮浓度明显降低，而用年轻sEVs治疗能显著提高衰老小鼠血浆和睾丸内睾酮浓度（图S2b-c）。此外，衰老小鼠的精子数量及活力明显降低，但年轻sEVs治疗能明显增加衰老小鼠的精子数量并提高精子活力（图1d-e）。接着，研究人员通过精子染色质结构分析评估精子DNA对变性的敏感性，发现衰老小鼠精子的DNA断裂增加，而用年轻sEVs治疗明显提高了衰老小鼠精子染色质的完整程度，降低了精子DNA断裂比例（图S2d-e）。为了进一步评估年轻sEVs治疗的衰老小鼠的生育能力，研究人员让具有生育能力的性成熟雌性小鼠与衰老或年轻雄性小鼠交配12小时，然后在交配4.5天后检测胚胎植入情况。结果表明，与年轻雄鼠交配的雌鼠子宫内平均有7.7±0.3个胚胎着床点，与衰老雄鼠交配的雌鼠子宫内没有可见的着床点（图1f-g）。然而，年轻sEVs治疗在很大程度上弥补了衰老雄性小鼠的生育缺陷，使每只怀孕雌鼠子宫内胚胎着床点增加到3.4±1.4个（图 1f-g）。此外，研究人员发现与年轻雄鼠交配的雌鼠平均每胎产仔8.4±1只，与衰老雄鼠交配的雌鼠平均每胎仅产仔4.4±1只（小编注：前面是仅交配12h，然后在4.5天后查看胚胎植入情况，发现于衰老雄鼠交配的雌鼠子宫内未见胚胎着床。在这里研究人员是将衰老雄鼠与雌鼠连续交配一个月，可能有一定的概率有成功着床的胚胎），而与年轻sEVs治疗的衰老雄鼠交配的雌鼠平均每胎产仔7.8±1只，接近与年轻雄鼠交配的雌鼠的产仔数（图1h）。

接下来，研究人员采用间接量热系统来评估小鼠的代谢健康。与年轻小鼠相比，衰老小鼠在黑暗和光照周期中的耗氧量（VO2）和二氧化碳产量（VCO2）都较低，且活动量和产热都减少，而年轻sEVs治疗显著促进了衰老小鼠的VO2、VCO2、活动量和产热能力（图1i）。这些结果表明，将年轻的sEVs注射到衰老小鼠中，可以显著改善衰老小鼠代谢健康。

有研究表明，进行性左心室（LV）肥厚和收缩/舒张功能障碍是心脏衰老的标志。在此，研究人员发现和年轻小鼠相比，衰老小鼠的心脏射血分数（EF）和左心室短轴缩短率（FS）显著降低，左心室质量、舒张末期左心室体积（LV Vol;d）和收缩末期左心室体积（LV Vol;s）显著增加（图1j-l和图S2f-h），这表明衰老小鼠出现左心室肥厚、心室充盈和心肌收缩受损的问题。然而，年轻sEVs治疗显著改善了衰老小鼠心脏健康和功能（图1j-1和图S2f-h）。

据报道，与年龄相关的骨质流失和结构恶化通常表现为松质骨骨小梁数量减少、骨小梁间距增加和骨小梁连通性丧失，这可以通过显微CT（micro-CT）观察到。于是，为了探究年轻sEVs治疗是否可以减缓衰老小鼠骨质流失的速度，研究人员利用micro-CT发现衰老小鼠股骨近端有多孔的骨小梁结构，而年轻小鼠股骨近端的骨小梁结构良好且致密（图1m）。定量分析结果显示，与年轻小鼠相比，衰老小鼠的骨组织体积与组织总体积的比例（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）较低，骨小梁间隙（Tb.Sp）较高（图1n- o和图S2i- j）。然而，用年轻sEVs治疗可以显著改善衰老小鼠的骨结构，使骨小梁达到与年轻小鼠相似的水平（图1m-o和图S2i-j）。

据报道，海马和大脑皮层在学习、记忆和执行功能中具有关键作用，其形态容易受衰老的影响而变化，具体表现为神经元萎缩和丧失引发的海马和大脑皮层的进行性萎缩。于是，研究人员利用磁共振成像（MRI）监测衰老小鼠海马和大脑皮层的体积变化。与年轻小鼠相比，衰老小鼠的绝对海马体积和相对海马体积（海马体积/全脑体积）均显著减少，而年轻sEVs治疗显著缓解了衰老小鼠的海马萎缩（图1p-q和图S2k-n）。同样的，在衰老小鼠中也观察到大脑皮层明显萎缩，但注射年轻sEVs能降低皮层萎缩程度（图1p-r和图S2k-m,o）。总之，这些结果表明，年轻sEVs具有将衰老组织、器官的形态和功能恢复到年轻状态的能力。

                图S2.年轻sEVs长期治疗对衰老小鼠全身生理产生的影响

3.年轻sEVs短期治疗对认知和耐力的影响

据报道，衰老对大脑和骨骼肌的负面影响尤为显著，会导致认知功能障碍和肌少症。于是，研究人员采用了一系列行为学实验来研究年轻sEVs短期治疗（两周内共注射7次sEVs）是否能迅速改善衰老小鼠的认知和耐力。首先，为了评估依赖于海马的学习和记忆功能，研究人员利用Morris水迷宫实验，结果发现与年轻小鼠相比，衰老小鼠到达隐藏平台所需时间更长，在目标象限停留的时间更短，穿越平台的次数也更少（图2a-c）。年轻sEVs治疗能显著提高衰老小鼠找到隐藏平台的能力，并延长它们在目标象限的停留时间，增加穿越平台的次数（图2a-c）。这表明年轻sEVs治疗显著提高了衰老小鼠的空间学习和记忆能力。随后，为了探究依赖于海马的联想记忆，研究人员利用情境恐惧条件反射测试，发现衰老小鼠表现出更低的冻结反应，而经年轻sEVs治疗后，衰老小鼠的冻结反应恢复，提示小鼠联想记忆增强（图2d）。总之，这些结果表明年轻sEVs能弥补衰老小鼠海马相关的记忆缺陷。接下来，为了探究小鼠耐力，研究人员利用渐进式跑步机检测小鼠到力竭时的跑步时间，发现年轻小鼠跑步时间高达32.34±0.73分钟，衰老小鼠的跑步时间仅为19.77±2.76分钟，而注射年轻sEVs后衰老小鼠的跑步时间显著延长，可达29.19±0.27分钟，即sEVs治疗可使衰老小鼠跑步时间增加47.6%，显著提高了衰老小鼠耐力（图2e）。由于衰老小鼠的基础生理指标和行为活动存在较大的个体差异，研究人员对同一批衰老小鼠在注射PBS或sEVs前后进行了行为学测试（图S3a）。结果表明，注射PBS前后，衰老小鼠的行为表现没有明显变化（图S3b-f）。然而，与注射sEVs前相比，注射年轻sEVs后的衰老小鼠空间记忆增强，联想记忆明显改善，耐力也显著增强（图S3b-f）。随后，研究人员分别向衰老小鼠注射等量的年轻或衰老sEVs（小编注：每2天注射一次，两周内共注射7次。完成7次注射后开始检测小鼠行为表现，具体没有说在注射后多久检测，而在前面比较同一批小鼠注射sEVs前后的模型中描述的是在完成7次注射后，即第14天开始实验）（图S4a），结果发现注射衰老sEVs的衰老小鼠与注射PBS的衰老小鼠的行为表现相似，而注射年轻sEVs的衰老小鼠表现较好（图S4b-f）。这一结果排除了sEVs本身的影响，表明sEVs诱导生理反应并影响衰老过程的能力与供体小鼠的年龄有关。综上，这些结果表明，年轻的sEVs能迅速改善衰老小鼠的功能衰退。

由于已经在生理和行为学水平上证明了年轻小鼠的sEVs能使衰老组织恢复活力，那么衰老小鼠的sEVs是否会发挥完全相反的作用，加速衰老过程呢？为了探究这一问题，研究人员在2周内分7次给年轻小鼠静脉注射PBS或衰老sEVs（图S4）。与注射PBS的年轻小鼠相比，注射衰老sEVs的年轻小鼠空间记忆下降（图S4h-j），联想记忆受损，耐力更差（图S4k-l）。总之，这些结果表明，衰老sEVs会导致年轻小鼠的记忆能力和耐力迅速下降。

此前的研究表明，年轻的血液可以改善衰老小鼠认知功能障碍和突触可塑性损伤。例如，在3周内分8次给18月龄衰老雄性小鼠静脉注射3月龄雄性小鼠的血浆，可以显著改善衰老小鼠的认知功能。接下来，为了探究年轻血浆是否通过sEVs发挥改善衰老组织的功能，研究人员在2周内分7次向衰老小鼠静脉注射PBS或年轻小鼠血浆（图S5a），发现注射年轻小鼠血浆能显著改善衰老小鼠行为特征，且改善程度与注射年轻sEVs相似（图S5b-f）。此外，研究人员还观察到注射衰老小鼠血浆的年轻小鼠与注射衰老sEVs的年轻小鼠有相似的行为表现（图S5g-l）。总之，年轻或衰老sEVs处理的小鼠大多数行为表型与年轻或衰老血浆处理的行为表型相似，这表明sEVs至少部分介导了先前研究中异体共生模型和血浆输注中观察到的年轻或衰老血浆的作用。

            图2.年轻sEVs短期治疗对衰老小鼠记忆能力、耐力和衰老表型的影响

             图S3.年轻sEVs短期治疗前后同一批衰老小鼠记忆能力和耐力的变化

               图S4.注射衰老sEVs对衰老和年轻小鼠记忆能力和耐力的影响

            图S5.短期注射年轻/衰老血浆对衰老/年轻小鼠认知功能和耐力的影响

4.年轻sEVs对衰老表型的影响

接下来，研究人员检测了年轻sEVs短期治疗的衰老小鼠衰老相关表型的变化。据报道，衰老细胞通常会表达衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal），因此可用SA-β-Gal表征细胞是否处于衰老状态。与年轻小鼠相比，衰老小鼠的肝脏、脾、肺、肾、海马和睾丸中SA-β-gal活性显著升高，而年轻sEVs短期治疗能迅速降低衰老小鼠各组织中的SA-β-gal水平（图2f）。此外，与年轻小鼠相比，衰老小鼠各组织中细胞周期抑制因子p21和p16的表达水平升高（图S6a,b），但年轻sEVs短期治疗显著降低了p21和p16表达水平（图2g和图S6c）。此外，有研究表明衰老细胞不能增殖，因此研究人员检测了小鼠海马中内源性细胞增殖标志物Ki67的表达，发现与年轻小鼠相比，衰老小鼠海马中Ki67阳性细胞比例明显降低，而年轻sEVs短期治疗的衰老小鼠海马中Ki67阳性增殖细胞明显增多（小编注：海马神经元的发生过程包括神经干细胞的增殖以及向神经元和胶质细胞的分化，而成熟神经元不具备增殖能力）（图2h和图S6d）。有研究表明，衰老细胞线粒体功能失调会导致活性氧（ROS）水平升高。在此，研究人员发现与年轻小鼠相比，衰老小鼠各组织中ROS水平显著升高，而年轻sEVs短期治疗能使衰老小鼠ROS水平恢复到与年轻小鼠相似的正常水平（图2i）。晚期糖基化终末产物（AGE）是由糖的酮基或醛基与蛋白质的氨基发生非酶反应而形成的，其积累是衰老或退行性疾病的标志。在此，研究人员发现衰老小鼠各组织中AGE积累明显增多，但年轻sEVs短期治疗能迅速消除衰老小鼠体内AGE的过量积累（图 2j）。同样的，脂褐素是一种随着年龄的增长而在有丝分裂后细胞的溶酶体中积累的色素，研究人员发现衰老小鼠的肝、心、肾和海马的脂褐素积累增多，但给衰老小鼠短期注射年轻sEVs后，这些组织中脂褐素聚集明显减少（图 2k）。

另一方面，长期注射年轻sEVs也能有效恢复衰老组织活力，抑制细胞衰老。如SA-β-gal染色所示，经年轻sEVs长期治疗的衰老小鼠各组织中SA-β-gal活性明显降低 （图S7a），同时各组织中p21和p16的表达水平也明显降低（图S7b-c）。

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晚期糖基化终末产物（AGE）

晚期糖基化终末产物（AGE）是由糖的酮基或醛基与蛋白质的氨基发生非酶反应而形成的不可逆化合物，主要来源于食物摄入或内源合成。随着年龄的增长，AGE会在组织中积累，从而影响许多衰老相关生理过程。一般认为，体内AGE的形成是一个漫长的过程，因此更容易影响长寿命蛋白质，如血红蛋白、碱性磷酸酶、溶菌酶、胶原蛋白等。由于AGE会改变蛋白质结构和增加蛋白质交联，这会导致晶状体、动脉、肌腱等失去弹性或硬度增加。除了影响蛋白质结构外，AGE可能进一步通过细胞表面受体RAGE（如AGE-R1/OST-48, AGE-R2/80K-H等）激活不同的信号通路，引发炎症、氧化应激等反应，在衰老、糖尿病、慢性炎症、免疫功能障碍等过程中参与调控代谢。例如，有研究表明AGE通过激活AGE受体诱导成骨细胞样分化，促进血管钙化，而糖尿病动脉钙化通常与其中风水平、死亡率升高相关。一般而言，AGE-R1的激活能抑制细胞氧化应激水平，而在糖尿病和衰老过程中AGE-R1表达下调，使细胞抗氧化应激能力减弱。AGE在脑内沉积会引发脑内蛋白异常交联和氧化应激增多，诱导神经元丧失，参与阿尔兹海默症发病过程。AGE还参与调控骨代谢，衰老过程中AGE的积累可能引发骨质疏松。 由于AGE在衰老过程具有重要作用，并且高水平的AGE可能给机体造成不良影响，因此AGE的临床检测对于衰老相关慢性疾病的早期预测、干预和长期监测具有重要意义。目前检验AGE的方法主要有高效液相色谱法、ELISA、免疫组化等。

参考文献：[1] Ott C, et al. Redox Biol. 2014 Jan 9;2:411-29.

                  图S6.年轻sEVs短期治疗对衰老小鼠衰老表型的影响

                 图S7.年轻sEVs长期治疗对衰老小鼠衰老表型的影响

5.年轻sEVs改变了多个衰老组织的蛋白质组

为了在蛋白质组水平上探究年轻sEVs改善衰老表型的机制，研究人员从注射PBS和注射年轻sEVs的衰老小鼠中收集了心、肝、脾、肺、肾、海马、肌肉和睾丸组织，进行定量蛋白质组学分析（图3a），鉴定出14474种蛋白，并对其中10319种蛋白进行定量（图3b）。热图表明在PBS处理组和年轻sEVs治疗组中，尽管大部分蛋白的表达水平无明显差异，但仍有小部分蛋白表现出明显的上调或下调（图3c）。研究人员进一步进行统一流形逼近与投影（UMAP）分析，发现PBS处理和年轻sEVs治疗的衰老小鼠脾、海马和肺部样本中蛋白表达有明显的整体差异（图S8）。

接下来，为了进一步阐明年轻 sEVs诱导的蛋白质组变化的生物学功能，研究人员利用GSEA进行GO分析。之后，为鉴定在这八个组织中具有重要生物学意义的基因集，对结果进行了Leading edge分析，鉴定出2046个GO通路，并进一步利用“二元切割”算法进行聚类分析，将这些GO通路富集为5个集群（图3d）。（1）集群1特异性地富集了“信号转导和信号通路”（例如：细胞内信号转导的调节、凋亡信号通路和雄激素受体信号通路的调控）；（2）集群2与“代谢”（例如：线粒体RNA代谢过程、细胞呼吸、NADH氧化和脂质生物合成过程）和“蛋白质/DNA修饰”（例如：DNA甲基化和去甲基化、蛋白质羟基化和蛋白质去糖基化）密切相关；（3）集群3与“组织发育、形态发生和分化”紧密相关（例如：肌肉组织发育、血小板形态发生和白细胞分化）；（4）集群4与“组织和组装”相关 （例如：染色体组织、染色质组装或拆卸、染色质重塑、组蛋白泛素化、组蛋白H3去乙酰化和组蛋白甲基化的调节）和“细胞器组装和拆卸”（例如：核膜组织，细胞器拆卸，蛋白质-脂质复合物组装，线粒体自噬，蛋白酶体组装和有丝分裂纺锤体组装）；（5）集群5与“运输、定位和分泌”密切相关（例如：生长激素分泌、突触囊泡胞吐、高尔基体蛋白定位和细胞内脂质转运调节）。在这5个集群中，集群2和集群4中下调的GO通路主要与线粒体功能障碍、表观遗传改变和基因组不稳定这3个衰老典型特征密切相关。此外，研究人员进一步分析了与集群2和集群4中衰老标志密切相关的GO通路（图3e），发现年轻sEVs治疗促进衰老小鼠不同组织中多个衰老相关GO通路下调。综上，这些结果反映了年轻sEVs可能通过多种机制逆转与年龄相关的退行性变化，并全面发挥促进衰老组织年轻化的作用。

              图3.年轻sEVs治疗促进多种衰老组织中的蛋白质组改变

        图S8.iTRAQ定量蛋白质组学数据的UMAP图（注射PBS和年轻sEVs的衰老小鼠的8种组织）

6.年轻sEVs能在体内发挥弥补线粒体缺陷的作用

线粒体是细胞内普遍存在的细胞器，主要作用是为细胞提供三磷酸腺苷（ATP），在细胞代谢中起核心作用，同时也是衰老过程中最常受损的细胞器。随着年龄的增长，线粒体发生损伤，ATP产量逐渐减少，线粒体DNA（mtDNA）也会累积损伤，最终导致各种组织的代谢异常和功能衰退。蛋白质组分析显示，年轻sEVs治疗的衰老小鼠中蛋白质组的改变主要与“代谢”相关，于是研究人员分析了这些小鼠线粒体功能和代谢表型的变化。结果显示，与年轻小鼠相比，衰老小鼠海马和肌肉中ATP合成、线粒体呼吸链复合体V（CⅤ）活性和mtDNA拷贝数明显降低，而年轻sEVs短期治疗能显著促进衰老小鼠海马和肌肉中ATP合成、CⅤ活性和mtDNA拷贝数（图4a-f和图S9a-b）。此外，短期注射年轻sEVs也能减少衰老小鼠心脏、肝脏、脾、肺、肾和睾丸中mtDNA含量的损失（图S9c-h）。相反，衰老sEVs则无法改善衰老小鼠各组织中的ATP生成、CⅤ活性和mtDNA含量（图S10a-f），这进一步证实了年轻而非衰老sEVs能改善线粒体能量代谢（小编注：mtDNA是线粒体内相对独立的基因组，负责编码13个与呼吸链组成相关的关键亚基、2个rRNA和22个tRNA。mtDN拷贝数减少会损害线粒体蛋白的表达，引起线粒体氧化磷酸化功能受损，降低线粒体ATP产生和质量。mtDNA拷贝数受mtDNA复制转录体、氧化应激水平和线粒体自噬调控。研究表明TFAM是启动mtDNA复制过程的重要调节因子，TFAM缺失会导致胚胎mtDNA拷贝数减少42%，并引起线粒体ATP合成降低50±22%。氧化应激对mtDNA拷贝数具有双重作用，轻度氧化应激会促进mtDNA转录，提高mtDNA拷贝数，代偿性增强线粒体呼吸功能，重度氧化应激会导致线粒体损伤程度超过线粒体自我调控能力，引起mtDNA拷贝数下降，线粒体功能发生障碍。线粒体自噬是清除受损或冗余线粒体的重要途径，会引起mtDNA拷贝数的下降，是mtDNA的一种降解机制）。

据报道，在衰老细胞中会逐渐累积嵴缺失或异常堆叠的受损线粒体。为了探究年轻sEVs对线粒体质量和形态的影响，研究人员用TEM观察线粒体，发现与年轻小鼠相比，衰老小鼠海马和肌肉中的线粒体数量较少且有较多线粒体肿胀或破碎，而年轻sEVs短期治疗的衰老小鼠海马和肌肉中的线粒体数量明显增多且异常结构线粒体比例下降（图 4g-j）。此外，年轻sEVs治疗也能增加衰老小鼠心脏、肝脏、脾、肺、肾中线粒体的数量，改善线粒体肿胀和线粒体基质破碎情况（图S11）。随后，为了观察肌纤维中线粒体的分布，研究人员用SDHA（线粒体呼吸链复合物II主要的催化亚基，可作为线粒体标志物）和Desmin（肌源性标志物）共染小鼠肌肉组织，发现与年轻小鼠相比，衰老小鼠肌肉中SDHA含量明显降低，而年轻sEVs短期治疗能显著促进肌肉中SDHA含量（图4k-l），表明年轻sEVs治疗促进衰老组织中线粒体含量（小编注：从图S8来看，UMAP分析的结果中只有脾、海马和肺部样本中蛋白质组存在整体差异，肌肉蛋白质组整体差异不大。UMAP分析是一种非线性降维和可视化算法，其优点是能在重叠区域中表现出不同的集群，体现集群整体的分离情况，但在此过程中也会丢失一些信息。因此单从S8的结果并不能认为肌肉蛋白质组没有差异。事实上，从图3c和3e来看，肌肉蛋白质组在许多通路上是存在明显差异的。）。总之，这些结果表明，年轻sEVs可以增加线粒体含量，维持线粒体功能，从而增加ATP供应，弥补衰老组织线粒体缺陷。

此外，研究人员发现衰老sEVs处理会显著抑制年轻小鼠海马和肌肉中细胞ATP合成、 CⅤ活性和mtDNA含量显著降低（图S10g-l），并且会导致线粒体数量减少和线粒体结构受损（图S10m-p）。这些结果表明，衰老sEVs会加剧小鼠组织中线粒体的损伤，从而导致能量缺乏。

              图4.年轻sEVs治疗弥补线粒体缺陷并改善衰老小鼠代谢健康

                图S9.年轻sEVs治疗改善了衰老小鼠mtDNA含量的损失

               图S10.衰老sEVs处理对衰老和年轻小鼠代谢表型的影响

                 图S11.年轻sEVs治疗改善衰老小鼠各组织线粒体结构

7.年轻sEVs能在体外增强细胞呼吸

为了探究年轻sEVs对细胞能量代谢的恢复作用，研究人员用年轻sEVs处理神经上皮细胞（NE-4C）和肌源性细胞（C2C12）（图S12a），发现年轻sEVs处理显著促进了NE-4C和C2C12细胞中ATP合成、CV活性和mtDNA拷贝（图S12b-g）。此外，年轻sEVs处理能显著促进两种细胞的基础耗氧率（OCR）、ATP偶联OCR和最大OCR（图S12h-k），表明细胞中氧化磷酸化（OXPHOS）和电子传递活性显著增强。此外，年轻sEVs能抑制这两种细胞衰老，恢复细胞增殖能力（图S12l-q）。

为了进一步证实年轻sEVs能够改善衰老线粒体的功能障碍，研究人员用H2O2处理NE-4C和C2C12，构建衰老细胞模型（图5a）。H2O2处理显著抑制了两种细胞中ATP合成、CV活性和mtDNA拷贝，破坏线粒体呼吸作用，而年轻sEVs处理能显著改善H2O2诱导的衰老细胞线粒体功能障碍（图5h-k）。此外，在NE-4C和C2C12细胞中，H2O2能诱导p21表达并抑制细胞增殖，而年轻sEVs逆转了H2O2造成的不良影响，抑制细胞衰老并恢复细胞增殖能力（图5l-q）。总之，这些结果表明，年轻sEVs可以促进衰老细胞线粒体生物合成，改善线粒体功能障碍。

               图S12.年轻sEVs处理改善细胞线粒体功能，抑制细胞衰老

             图5.年轻sEVs处理改善H202诱导的线粒体功能障碍和衰老表型

8.年轻人的sEVs能改善小鼠衰老表型

据报道，sEVs的生物活性几乎没有物种特异性。于是，为了探究年轻人的sEVs是否可以改善小鼠的衰老表型，研究人员从年轻男性（19-24岁）的血浆中纯化sEVs，并用与小鼠sEVs相同的剂量和频率静脉注射到衰老小鼠体内（图S13a）。结果表明，年轻人sEVs能有效改善衰老小鼠的认知缺陷和耐力（图S13b-f），显著改善衰老小鼠海马和肌肉中线粒体功能、数量和结构（图S13g-m）。同样，琥珀酸脱氢酶（SDH）染色结果表明年轻人sEVs处理显著恢复了衰老小鼠肌肉中的线粒体活性（图S13n-o）。此外，年轻人sEVs处理能促进NE-4C和C2C12细胞的ATP合成、CV活性和mtDNA含量（图S14a-g），同时增强细胞线粒体呼吸水平（图S14h-k），抑制p21表达水平，并促进细胞增殖（图S14l-q）。总之，这些结果表明，与年轻小鼠血浆sEVs作用相似，年轻人血浆sEVs也能挽救衰老小鼠组织功能障碍和线粒体中缺陷。

             图S13.年轻人血浆sEVs改善衰老小鼠衰老表型并弥补线粒体缺陷

              图S14.年轻人血浆sEVs处理改善细胞线粒体功能和衰老表型

9.血浆sEVs中的特异性microRNA会随年龄改变

从上述表型来看，目前尚不清楚年轻血浆sEVs的年轻化作用与何种成分有关。sEVs的固有结构使信息分子（包括蛋白质、脂质、DNA和RNA）能在细胞间进行有效传递。迄今为止，大量研究都是针对了解sEVs中的RNA成分，尤其是microRNA（miRNA）。事实上，包裹在sEVs中的miRNA可以转运到受体细胞中，从而对靶基因和细胞通路产生影响。于是，研究人员推测血浆sEVs中的部分miRNA可能是年轻血液中的年轻化因子。为了证实这一猜想，研究人员首先通过小RNA深度测序检测了衰老和年轻小鼠血浆中的miRNA谱，结果发现，与年轻小鼠血浆相比，衰老小鼠血浆中有75个miRNA呈现显著差异表达(其中升高32个，降低43个)（表S2）。基于血浆miRNA图谱，通过层次聚类分析能将衰老血浆样本与年轻血浆样本清楚地区分开来（图 6a）。随后，研究人员全面分析了与年龄相关的循环miRNA的现有文献，总结了它们在整个衰老过程中的变化规律，并鉴定出90个miRNA作为衰老过程的特征标志，其中53个随着年龄的增长而增加，37个随着年龄的增长而减少（表S3）。紧接着研究人员将小RNA测序结果与文献总结结果进行了比较，筛选出15个有显著差异的miRNA（在衰老小鼠血浆中含量高于年轻小鼠血浆的有7个，低于年轻小鼠血浆的有 8 个）（图 6b）。定量分析进一步证实， 在衰老小鼠与年轻小鼠血浆中有10个、老年人类与年轻人类血浆中有9个miRNA呈现显著差异表达，其中9个miRNA在小鼠血浆与人血浆中变化一致（图6c-d）。为了进一步评估与年龄相关的循环miRNA的生物学相关性，研究人员测定了衰老小鼠、年轻小鼠、老年人类和年轻人类血浆sEVs中的9个miRNA，发现miR-29a-3p、miR-29c-3p和miR-34a-5p在衰老小鼠和人类血浆sEVs中的含量显著升高，而miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p在年轻小鼠和年轻人类血浆sEVs中的含量显著升高（图6e-f）。因此，miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p被认为是年轻sEVs中的特征miRNA，而miR-29a-3p、miR-29c-3p和miR-34a-5p则是衰老sEVs中的特征miRNA。

随后，研究人员探究了年轻sEVs注射后，其包含的miRNA可否被衰老组织吸收。于是，研究人员用PKH26（一种专门用于标记sEVs脂质双层的红色荧光染料）标记年轻sEVs，然后将PKH26标记的sEVs静脉注射到衰老小鼠体内，并追踪年轻sEVs在衰老小鼠体内的分布。结果发现，只注射PKH26染料，在衰老小鼠的组织切片中无法观察到荧光积累，但注射PKH26染料标记的年轻sEVs后，在衰老小鼠的海马和肌肉中观察到明显的红色荧光（图S15），表明年轻sEVs可能通过血液转移到海马和肌肉等组织。

接下来，研究人员检测了衰老组织对sEVs中miRNA的摄取情况，即将年轻小鼠sEVs注射到衰老小鼠后，在衰老小鼠中分别测量miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p的成熟和前体形态，结果发现，在衰老小鼠的心、肝、脾、肺、肾、海马、肌肉和睾丸中成熟的miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p含量显著增加（图S16a）。然而，在这些组织中未观察到前体miRNA含量的改变（图S16b），这表明年轻sEVs无法诱导内源性miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p的水平变化。因此，衰老组织中miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p的升高可能是由于sEVs介导外源性miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p递送到相应组织。

                 图6.衰老过程中血浆和sEVs中miRNA含量的变化

             图S15.追踪荧光标记的年轻sEVs在衰老小鼠海马和肌肉中的分布

           图S16.衰老小鼠注射年轻血浆sEVs后，衰老组织对sEVs miRNA的摄取

10.无论体内或体外，年轻sEVs中的miRNAs皆可诱导PGC-1α表达

接下来，研究人员预测了可能受年轻和衰老血浆sEVs中miRNAs调控的靶基因。通过文献调研，研究人员确定了衰老和年轻血浆sEVs中具有代表性的miRNA所共有的关键靶基因。如图S17a所示， PGC-1α是miR-29a-3p、miR-29c-3p和miR-34a-5p负调的常见靶标，其是线粒体生物发生和功能的主要调控因子。相反，由于miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p的下游靶基因，如β淀粉样蛋白前体蛋白（APP）、多聚（ADP-核糖）聚合酶-2（PARP-2）和低氧诱导因子1-α抑制剂（HIF1an），与PGC-1α呈负相关，因此miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p可被认为是PGC-1α表达的间接刺激物（图S17a）。可能的结合位点见图S17b。不同物种的miRNA序列和miRNA结合位点序列高度保守（图S17b-c）。

作为线粒体稳态的关键调节因子，PGC-1α通过协调核基因组和线粒体基因组编码的线粒体蛋白的表达来促进线粒体的生物发生，并通过调控线粒体质量和促进线粒体再生来维持线粒体质量和数量的稳定。PGC-1α在线粒体生物发生和OXPHOS中的重要作用引发研究人员作出假设，在年轻血浆sEVs中富集的miRNA可能通过正向调节PGC-1α对线粒体能量代谢产生有益影响，而在衰老血浆sEVs中富集的miRNA可能通过负向调节PGC-1α而加剧线粒体生物发生受损。与之相符，在NE-4C和C2C12细胞中的实验证实miR-29a-3p、miR-29c-3p和miR-34a-5p模拟物可以抑制PGC-1α的表达（图7a）。此外，miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p模拟物能直接抑制APP、PARP-2和HIF1an的表达（图7b），这反过来导致细胞中PGC-1α表达增加（图7a）。

随后，研究人员在体内外研究了PGC-1α是否与年轻sEVs促进衰老组织年轻化的作用有关。与先前的研究结果一致，PGC-1α通常在ATP需求大的组织中高表达，其表达随年龄增长而降低。与其他代谢基因相比，PGC-1α尤其容易受到衰老的影响；并且与年轻小鼠相比，衰老小鼠的海马和肌肉中PGC-1α表达显著降低（图S18a）。研究人员将来自年轻小鼠的sEVs注射到衰老小鼠体内，发现其可增加海马和肌肉中PGC-1α的表达（图7c-d），同时在NE-4C和C2C12细胞中也增加了PGC-1α的表达（图7e）。相反，将衰老sEVs注射到衰老小鼠体内，并没有改变海马和肌肉中PGC-1α的表达（图S18b）。另一方面，来自年轻人类供血者的sEVs对衰老小鼠海马和肌肉以及NE-4C和C2C12细胞中PGC-1α的表达有正面刺激作用（图S18c-e）。为了确定年轻sEVs是否通过调控PGC-1α的表达来发挥年轻化的作用，研究人员将靶向PGC-1α的小干扰RNA (siRNA)与年轻sEVs一起转染到NE-4C和C2C12细胞中，结果发现，siRNA介导的PGC-1α沉默大大降低了年轻sEVs对线粒体呼吸的有益作用（图S19）。这些发现表明，年轻sEVs的年轻化作用至少部分是由PGC-1α介导的。

为了评估sEVs中miRNA对年轻sEVs的年轻化作用是否不可或缺，研究人员用Triton X-100(能渗透sEVs的膜)和RNase(核糖核酸酶)预处理年轻sEVs，然后将所得的年轻sEVs培养NE-4C和C2C12细胞。结果发现，结构完整的年轻sEVs能够改善NE-4C和C2C12细胞的线粒体呼吸，但在用Triton X-100和RNase预孵育的年轻sEVs处理的细胞中，检测到线粒体OCR显著降低（图S20），表明年轻sEVs的作用因miRNA的降低而显著减弱。（此前的研究表明，sEVs的膜结构能够保护其RNA载体不被RNase降解；因此，Triton X-100和RNase共同处理可以快速降低sEVs中miRNA的含量。）

最后，研究人员探究了年轻sEVs中的miRNA载体是否能通过增强PGC-1α的表达来改善线粒体代谢。通过转染相应的模拟物来诱导NE-4C和C2C12细胞中miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p的表达，结果发现，可显著提高呼吸速率、ATP产量和线粒体质量（图7f-h）。为了特异性地阻断内源性miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p的功能，研究人员将miR-144-3p、miR-149-5p和 miR-455-3p的反义寡核苷酸（能特异性敲低目标miRNA含量）与年轻血浆sEVs共转到NE-4C和C2C12细胞中，并与仅用年轻sEVs处理的细胞比较来评估细胞的代谢和衰老表型（图8a）。在NE-4C和C2C12细胞中，年轻sEVs能够显著增强PGC-1α表达、增强线粒体呼吸、促进ATP合成和提高线粒体含量，而反义寡核苷酸则完全逆转了年轻sEVs在促进PGC-1α表达和线粒体能量代谢方面的有益作用（图8b-i）。同样，年轻的sEVs能有效抑制细胞衰老并激活细胞增殖，细胞中p21表达的减少和EdU结合的增加证实了这一点，而反义寡核苷酸在很大程度上抑制了年轻sEVs这些有益的作用（图8j-m）。因此，包含在年轻血浆sEVs中的miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p是起年轻化作用的关键miRNA，具有促进PGC-1α表达和改善线粒体能量代谢的潜力。

随后，研究人员探究了衰老sEVs中的miRNA是否会降低PGC-1α的表达并驱动与年龄相关的线粒体损伤。与预期相符，衰老sEVs很大程度上能抑制年轻小鼠海马和肌肉中PGC-1α的表达（图S18f）。同样，直接转染miR-29a-3p、miR-29c-3p和miR-34a-5p模拟物会导致NE-4C和C2C12细胞中PGC-1α表达降低（图7a），同时导致线粒体活性降低和mtDNA含量下降（图7f-h）。接着，研究人员将miR-29a-3p、miR-29c-3p和miR-34a-5p的反义寡核苷酸与年老血浆sEVs共转到NE-4C和C2C12细胞中，发现年老sEVs能显著抑制NE-4C和C2C12细胞中PGC-1α的表达，导致线粒体活性受损，mtDNA含量降低，细胞衰老标志物p21表达升高;然而，与反义寡核苷酸共同处理能显著挽救衰老sEVs对线粒体生物发生和代谢的有害影响，使PGC-1α表达、线粒体功能和p21水平恢复到正常状态（图S21），这进一步证明衰老sEVs的促衰老作用至少部分是通过其miRNA负载来实现的。因此，衰老血浆sEVs中的miR-29a-3p、miR-29c-3p和miR-34a-5p是促进衰老的关键miRNA，其功能与年轻血浆sEVs中miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p完全相反。

           图7.年轻和衰老sEVs中的miRNA通过调节PGC-1α的表达影响线粒体代谢

图8.miR-144-3p、miR-149-5p和miR-4553p的反义寡核苷酸阻断了年轻sEVs对线粒体代谢和细胞衰老的有益作用

图S17.PGC-1是miR-29a-3p、miR-29c-3p、miR-34a-5p、miR-144-3p、miR-149-5p和miR-455-3p的

直接或间接下游靶点

               图S18.年轻和衰老sEVs调控PGC-1α在体内和体外的表达

              图S19.PGC-1α siRNA能阻断年轻seEV对线粒体呼吸的有益作用

         图S20.用Triton X-100和RNase预处理年轻sEVs可阻断其对线粒体呼吸的有益作用

总结：

本项研究中，研究人员发现来自年轻小鼠血浆的sEVs在分子、线粒体、细胞和生理水平上具有缓解衰老的功能。首先将年轻血浆sEVs静脉注射到衰老小鼠中，显著延长了衰老小鼠的寿命，减轻衰老表型，并改善多个组织中与年龄相关的功能衰退。对衰老小鼠组织进行定量蛋白质组学分析发现，在年轻血浆sEVs治疗后，衰老小鼠多个组织的蛋白质组学发生了实质性的变化，这些变化与代谢过程密切相关。机制研究表明，年轻血浆sEVs通过miRNA促进PGC-1α表达，从而改善线粒体功能并缓解衰老组织中线粒体受损现象。总之，本研究表明，年轻sEVs能通过粗肌PGC-1α表达和增强线粒体能量代谢，在一定程度上逆转了年龄相关的代谢功能障碍和退行性变化。

链接：https://www.nature.com/articles/s43587-024-00612-4