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Cell Metabolism:脂海漫漫藏异彩,网膜深处觅真形

已有 610 次阅读 2024-6-6 17:30 |个人分类:代谢精读|系统分类:科研笔记

代谢学人

Cell Metabolism:脂海漫漫藏异彩,网膜深处觅真形

撰文| 陈江榕 马莹 武霞 胡敏 郭明伟  张俊

编辑| 孟美瑶 

校对| 张俊

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背景介绍

目前对于对人类脂肪组织(adipose tissueAT) 在代谢改变情况下引起的脂质周转和扩张动态表型的理解仍然有限。此外,这些表型因AT的解剖位置而各不相同,如有利于代谢健康的皮下(subcutaneousSC)脂肪组织和不健康的内脏脂肪组织。并且,特定解剖部位的脂肪堆积与肥胖相关胰岛素抵抗有密切关联部分原因是AT在不同部位具有不同的扩张方式,例如产生新的脂肪细胞(hyperplasia称为增生)或已有脂肪细胞体积增大(hypertrophy称为肥大),但我们对导致这些表型差异的原因知之甚少。一种可能性是,这些差异可能部分归因于不同脂肪组织之间的基质血管成分(stromal vascular fractionSVF)细胞组成的差异性,更具体地说,是脂肪干细胞和祖细胞(adipose stem and progenitor cellsASPC)的差异造成的。尽管人类脂肪组织的单细胞RNA测序(Single-cell RNA sequencingscRNA-seq)图谱已经为理解人类ASPChASPC)的异质性提供了线索,但现有研究主要聚焦于皮下(SC)脂肪组织和网膜脂肪组织(omentumOM,后者作为主要的内脏脂肪组织受到广泛关注。因此,对于SCOM之外的hASPC成分的相似性和差异,我们依然知之甚少,这有待未来研究进一步揭示。

对小鼠的研究表明,ASPC在不同的脂肪组织中具有高度异质性,但可以分为至少三个主要亚群,以特定的细胞表面标记和不同的功能特性为特征。例如,Dpp4+(或Ly6c+)细胞为代表的脂肪干细胞(adipose stem cellASC),这是一组多能间充质干细胞,在暴露于合适的细胞因子复合物下,它们能够形成脂肪。相比之下,Icam1+(或Aoc3+)细胞可被归类为前体脂肪细胞(pre-adipocytePreA),相比ASC表现出较低的增殖能力和更稳定的脂肪生成状态。而高表达F3小编注:该基因编码CD142。CD142+细胞亚群分泌的RSPO2是脂肪生成的功能性调节因子。它通过作用于LGR4受体,抑制脂肪的生成的细胞被称为脂肪生成调节细胞(adipogenesis-regulatory cellAregs),它们具有调节其他ASPC分化的能力。对hASPC亚群功能特征的初步研究表明一些hASPC亚群小鼠中发现的DPP4+ ASPC有一些相似之处,与ICAM1+ ASPC相比,DPP4+ ASPC具有高度的增殖能力和较低的脂肪生成能力。这些发现表明小鼠和人类的ASPC可能具有相似的亚群。然而,到目前为止,还没有在人体的几个脂肪组织中对hASPC的异质性进行系统的功能性表征。

在本研究中,研究人员结合约34000个非免疫性(CD45-)和非内皮(CD31-)SVF细胞(SVF/lin-)的scRNA-seq数据,对超过30个人类捐赠者的四个主要脂肪组织(皮下、肾周(perirenal,PR)、网膜、结肠系膜(mesocolic,MC))小编注:OM是腹腔内的一个脂肪组织,覆盖在胃和横结肠的前方,并延伸至盆腔。它主要由脂肪和血管组成,具有保护和支持腹腔内器官的作用。在某些病理情况下,如肿瘤转移,大网膜可能会受到影响。MC是连接肠管与后腹壁之间的双层腹膜结构,它包裹着肠管并为其提供血液供应。MC内含有血管、淋巴管和神经等,对肠管的正常功能至关重要。在结直肠癌的研究中,MC脂肪是一个重要的关注点,因为它可能与肿瘤的侵袭和转移有关。有文章报导小鼠中也有OM和MC中的SVF细胞的基因表达谱进行了全面概述。研究人员分析了不同脂肪组织中共有和不同的hASPC的主要亚群,以及它们的转录和功能特性。此外,他们建立了一种分选策略,用于从SC、OM和PR脂肪组织中分离、量化和表征具有不同成脂潜力和增殖能力的细胞亚群。最后,研究人员发现了一个全新的网膜(OM)特异性细胞亚群,该亚群能够抑制hASPCs成脂分化,研究人员还揭示了胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)细胞(IGFBP2+)表达丰度与身体质量指数(BMI)之间的显著相关性,揭示了其生物医学意义。

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敲黑板啦! 

1.单细胞转录组图谱整合了来自四个不同人体脂肪组织的Lin- SVF细胞;

2.深入分析四个不同人体脂肪组织中SVF的转录组

3.三个人体脂肪组织中五种基质细胞群的成脂特征;

4.高表达IGFBP2的网膜特异性细胞抑制脂肪生成。

研究结果

人SVF细胞在体外成脂能力和转录组方面表现出依赖于脂肪组织的差异

为了功能性表征包括hASPC在内的不同人体脂肪组织中的基质细胞,研究人员从20名捐赠者的SC、8名捐赠者的PR、19名捐赠者的OM和4名捐赠者的MC脂肪组织中分离出SVF。分离SVF后培养贴壁细胞,当细胞长满后,加入成脂诱导液培养14天(图1A)。脂滴染色显示,与之前的研究结果一致,来自腹腔外脂肪组织(SC和PR)的细胞形成了成熟的脂肪细胞(图1B和图1C)。相反,来自腹腔内脂肪组织(OM和MC)的细胞在成脂分化条件下生长缓慢且几乎不形成脂滴(图1B、图1C和图S1a–S1c)(小编注:在之前的研究中,研究人员对来自人的SC、OM和MC前体脂肪细胞进行了诱导分化,并测定了脂肪积蓄的程度,发现诱导分化10d后SC的脂质积累最多,而OM和MC中几乎不生成脂质。并且脂质积累与PPAR-γ和C/EBP-α的表达有关,转染C/EBP-α基因后,OM前体脂肪细胞的分化增强。文章指出,在大鼠中也存在类似现象,相同基因在不同脂肪组织的差异表达也会引起不同脂肪组织中脂肪前体细胞的细胞动力学和生化反应差异)。有趣的是,新鲜分离的PR细胞在体外展示了最高的成脂潜力(图1B和图1C)。然而,在较长的培养时间/传代后,它们的分化水平与SC细胞相似(图S1B)。此外,所有脂肪组织在基质细胞的分化能力上都表现出高度的个体差异(图1D)。最后,研究人员评估了实验脂分数(总脂滴面积/总核面积,图1D)与捐赠者的生理参数(如BMI、年龄和性别)之间的可能相关性,但除了PR细胞在女性和老年人中成脂能力较低的趋势外,没有发现其他相关性(图S1D–S1H)。然而,研究人员认为样本群组的人口学特征可能会对这些观察结果产生偏差(图S1D;表S1和S2),因为样本捐赠者主要是年轻人和肥胖者,且只分析了较少比例的PR样本(n = 8)。

为了探究不同脂肪组织之间不同的成脂能力是否体现在其转录组中,研究人员对来自不同个体和脂肪组织的SVF贴壁细胞在未分化状态(t0)以及成脂分化后14天(t14)进行了批量RNA条形码和测序(BRB-seq)分析(SC n=22,OM n=16,PR n=8,MC n=4小编注:BRB-seq指的是一种高通量的测序技术,它能够对大量的RNA分子进行条形码标记和测序分析。这项技术允许研究者同时分析多个样本的RNA表达情况,通过在样本中加入独特的条形码,可以在混合样本中区分每个样本的RNA来源。这种方法在转录组学研究中非常有用,因为它可以提供关于基因表达水平的全面信息,并且有助于比较不同样本之间的基因表达差异)。差异主要体现在细胞是否处于成脂诱导培养基中,其次是细胞的解剖来源(图1E和S1I-S1M)。除OM样本外,所有t0样本均高度表达THY1(一种已知的间质标志物)(图S1N)。对细胞进行分化诱导后,所有脂肪组织中与细胞外重塑、胰岛素反应以及脂肪细胞分化相关的基因上调(图1F、S1O和S1P),这表明它们可以在一定程度上参与成脂调控。然而,与OM和MC相比,SC和PR中成脂相关的基因显著富集(图1F、S1O和S1P)。此外,晚期成脂标记物仅在PR和SC样本中分化后上调(图S1Q)(小编注:研究人员将“Positive regulation of fat cell differentiation”通路上富集到的差异基因比上这条通路上的所有基因得到score。S1O和S1P的pathway score数据处理方法类似。S1Q 是以以下基因FABP4, PPARG, ADIPOQ, LIPE, LPL, PLINI, PLIN2, PLIN4, CEBPA, CEBP, CIDEC, andC/DEA的相对表达量为基础作图),与在OM和MC细胞中观察到的极低LD累积一致。成熟脂肪细胞标记物的表达与LD累积相关,研究人员对基于图像的脂分数进行量化(r=0.81,图1G),表明个体间差异体现在转录组上(小编注:这里其实就是一个相关性分析,作者首先把成熟脂肪的一些marker表达量定义为成熟脂肪细胞分数,然后发现随着脂分数越大,即脂滴越多和越大,成熟脂肪细胞分数也越高)

通路分析表明, PR和SC来源的细胞分化后的代谢通路主要富集在脂质储存和脂肪酸代谢方面(图1H)。研究人员将来自不同脂肪组织t0时未分化细胞的转录组进行比较后发现,如HOXC8-10HOXA9HOXD8等发育基因在SC样本中高表达(图1I)。此外,与形态发生和发育相关的多个基因在SC中的富集进一步说明了这一点(图1I和图1J)(小编注:HOX 基因是一组高度保守的转录因子,在早期发育中起着关键作用,Hox 基因的表达存在部位特异性,Hox 基因在内脏脂肪和皮下脂肪组织之间以及特定内脏(OM、MC和PR)脂肪和皮下(SC)脂肪之间显示出特异的表达模式。在 SC 中,HoxC 簇和一些 HoxD 基因的表达量明显较大,这表明这些基因可能对控制SC AT的发育很重要。而大多数 HoxB 基因在OM AT中的表达量明显增加,表明 HoxB 簇基因可能在网膜脂肪组织的特征中发挥关键作用。GWAS技术确定 HoxC13 和 HoxB5 都是与儿童肥胖相关的等位基因。一项大规模的全基因组关联研究发现,HoxC10 的上调可以降低腰臀比,随后的相关研究显示,SC样本中 HoxC9 和 HoxC10 的表达量高于OM样本。此外还有研究发现,HoxC10 是白色脂肪细胞中白色向米色脂肪转变的一个重要的负向调节器。有趣的是,在t14时,与其他脂肪组织相比,SC样本也显示出与(脂肪)细胞分化相关基因的富集(图1J)。相比之下,t14时PR富集的基因与产热和氧化代谢有关(图1J)。在t14时的OM样本中,研究人员观察到了非脂肪基因表达特征,其中“分化的负调控”和“白色脂肪细胞分化”的基因分别呈现上调和下调(图1J)。OM细胞在暴露于成脂培养基前后也显示出与炎症反应相关的基因表达显著升高(图1J和图S1R)。这可能是由于OM的样本人群主要是接受减肥手术的肥胖患者(小编注:OM、SC的样本相同,且捐献者D07的OM、SC和MC均被用于数据分析(图S1D),其OM脂肪可能表现出炎症迹象。OM细胞还显示出与血管形成和上皮/内皮发育相关的基因的富集(图1J和图S1S)(小编注:在此处作者想要展示脂肪组织的区域特异性,所以在S1R和S1S调取并展示了血管形成和上皮/内皮发育相关的基因的富集)。MC富集的基因与内质网应激、蛋白质折叠和转运有关(图1J)。

总而言之,从每个脂肪组织分离出的SVF细胞具有特定的基因特征,凸显了脂肪组织的区域特异性。此外,腹膜外和腹膜内脂肪组织来源细胞的促脂肪生成标记物的上调或下调反映了它们不同的脂肪生成潜能。

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图 1| 人类SVF细胞在脂肪生成潜力和转录组上表现出脂肪组织依赖性的差异

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图 S1| 不同脂肪组织中原始SVF贴壁细胞的比较

人类脂肪来源的间充质细胞在单细胞水平上具有高度异质性

接下来,研究人员探究了不同脂肪组织中的转录组和表型差异是否可能由细胞异质性造成的。为此,他们对从SC(n=3)、OM(n=3)、MC(n=2)和PR(n=3)脂肪中分离出的SVF Lin-(即CD45-/CD31-)细胞进行了scRNA-seq,共分析了34126个细胞(平均每个脂肪组织约8500个细胞)。他们首先独立分析了每个数据集,揭示了每个脂肪组织内以及脂肪之间的异质性(图2A)。研究人员总共进行了三次独立分析(小编注:单细胞测序中的“独立分析”通常指的是对单个细胞的基因表达数据进行的分析,而不是将这些数据与其他细胞的数据合并或汇总分析。在单细胞测序技术中,每个细胞的RNA被单独捕获和测序,从而能够揭示细胞群体内部的异质性。独立分析的意义在于能够揭示细胞一致性,分析细胞状态和功能,分析细胞轨迹和分化以及分析细胞间相互作用;在这里研究人员进行了三次独立分析将分析结果得以验证并进行复现,保证可靠性,在每次分析中进行优化,减少偶然性,将数据进行整合,也有利于研究人员探索细胞的一致性,多次独立分析可以提供更全的细状态和动态变化图,因为每次实验可能会捕获到不同的细胞亚群或状态。一次单细胞测序结果的多次独立分析可能会有一些差异,但主要结果应该是一致的。。以探究所识别的亚群是否在不同脂肪组织和捐赠者之间具有相同的分子特征。首先,研究人员分析了不同数据集之间每个细胞亚群共享的前100的差异基因重叠度(图S2A)。结果表明,从相同脂肪组织或捐赠者中分离的样本之间重叠度最高(小编注:这里的重叠度涉及到脂肪组织的来源,研究人员在这里共分析了6名捐赠者的脂肪组织,其中有几名捐赠者捐献了不止一种脂肪组织,所以研究人员将来自同一供体不同脂肪组织样本中细胞亚群的重叠度进行分析,发现来自同一供体的样本之间的重叠度最高;除此之外,相同的脂肪组织但是来源并不是同一捐赠者,所以研究人员也对这种情况下样本的重叠度进行了分析,结果表明虽然来自不同的捐赠者,但是相同脂肪组织样本的重叠度也比较高)(图S2B和S2C)。当研究人员将每个数据集投影到其他数据集上时,这一结果得到了证实,结果表明了无论来源脂肪组织如何,一个特定亚群的细胞平均有超过75%会投影到其他数据集中的相应亚群(图S2D)。最后,研究人员将每个数据集视为不同的批次并进行了相应的校正,以整合数据。t-SNE结果表明,来自不同脂肪组织的对应亚群之间存在很好的重叠(图2B),并进一步通过聚类分析证实了这一结论(图2C)。结果表明,来自SC、PR、OM和MC脂肪组织的人脂肪SVFs至少包含两个主要的hASPC亚群(图2D和2E),研究人员在另一处尚未研究的脂肪组织(病态肥胖患者中的胆囊周围脂肪组织)中也发现了这两个亚群(图S2E)。

根据它们的基因表达特征,研究人员将这两个hASPC亚群分别标记为ASCs(hASCs)和PreAs(hPreAs)(图2C和图2F)。来自所有脂肪组织的hASCs都共表达DPP4CD55PI16,以及参与增殖、胶原合成和干性的基因(图2F和图S2F)。相反,hPreAs差异性地表达已分化脂肪细胞的标记物,如PPARGFABP4PDGFRAAPOCAPOE,并显示出与分化、定型和脂质转运相关的基因富集(图2F和图S2F)。此外,研究人员的注释与在SC AT中观察到的ASPC状态以及使用独立的人类参考图谱预测的OM AT中的ASPC状态一致(图2G和图S2G)。

综上所述,研究人员发现,在单细胞水平上,两种典型的hASPC群体(hASCs和hPreAs)主导了SVF的转录组图谱,并且在每个分析的脂肪组织中都能找到。目前这些hASPC状态在SC和OM以外的人体解剖位置尚未被描述。(小编注:之前的研究主要聚焦于皮下(SC)和网膜(OM)脂肪组织两个脂肪库进行研究,本文中研究人员还在另外两个脂肪库中,即肾周PR和结肠系膜(MC)脂肪组织进行单细胞测序,发现PR和MC中也存在两种脂肪干细胞和祖细胞亚群,即hASPC和hPreAs。在目前的报道中,这两种细胞亚群在人类脂肪组织中是广谱存在的,具有不同的增殖和成脂特性。ASCP在小鼠和人类之间是保守的,即ASCs主要表现出高度的增殖能力,preAs表现出高成脂能力。在小鼠中,Ly6a编码的SCA1是一种广泛用于富集ASPCmarker,但是人类中却没有Ly6a的同源基因,因此SVF中的整个Lin-组分被认为是很好地代表了hASPCsCD29CD34CD13CD44CD73CD90CD142CD9CD10CD200等标记物已被用于进一步富集hASPCs)。

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图 2| 人类脂肪间质细胞在单细胞水平上高度异质性

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图 S2|人类脂肪来源的间质细胞在其转录组中显示出解剖特征

不同脂肪组织中存在共同和独有的基质细胞群

除了hASCs和hPreAs外,研究人员还鉴定出了五个在所有脂肪组织中普遍存在的细胞群(包括血管平滑肌祖细胞(VSMP)以及HHIP+IFIT+SFRP4+RBP5+细胞群),以及一个PR和MC特异性(FMO2+)和两个OM特异性(间皮细胞和IGFBP2+)的细胞群(图2C和图2D)。

VSMP细胞群是根据MYH11ACTA2TAGLN等肌肉相关标记物的表达来识别的(如图2E和3A所示),这与先前描述的特征相似。

HHIP+细胞群表达多个与小鼠Aregs间质亚群直系同源的标记物(F3CLEC11AGDF10MGPINMT)(如图3A和S3A所示),并且在转录组上与已发表的人类AT图谱中的EPHA3+细胞群相似。在本文的数据集中,EPHA3特异性地由HHIP+细胞表达(图S3A)。此外,研究人员通过将他们的注释转移到已发表的图谱上,证实了EPHA3+细胞群对于HHIP+细胞群的预测得分显著高于其他hASPCs(图S3B)(小编注:本文中的HHIP+细胞亚群表达与小鼠Aregs细胞亚群marker同源的基因,之前发表的一篇nature证明了hASPC有一个细胞亚群表达EPHA3,该基因在本文中的其他细胞亚群中都没有表达,所以研究人员认为HHIP+细胞亚群就是AregEPHA3+细胞亚群可能包含在HHIP+细胞亚群中)。最后,鉴于HHIP编码一个表面标记物,可以使用流式细胞仪确认在SC AT中存在一个人类SVF Lin-/HHIP+细胞群(图S3C和S3D)。

另一种基质细胞群,即IFIT+细胞群,存在于每个脂肪组织和捐赠者中,由特定的干扰素相关基因如IFIT3IFI6IFI27的表达所定义(如图3A和S3E所示),这反映了病毒免疫反应(如图S3F所示)。虽然在小鼠OM中报道了一种间皮Ifit+细胞群,但本文中研究人员发现的IFIT+细胞群并不表达间皮标记物,而是表达间充质标记物(图3A和S3G)(小编注:间皮细胞(Mesothelial cells)构成了小鼠和人的腹膜,是内脏SVF的特异组分,它们不仅构成腹腔壁,在visWAT内部也成簇存在,也即所谓的乳白色斑点脂肪相关淋巴团簇MslnWt1Lrn4Upk3b是间皮细胞的典型分子标记物,在体外,这些细胞显示出典型的上皮/鹅卵石形态。间充质细胞(Mesenchymal Cells)是一类具有多种潜能的基质细胞,具有自我更新和多向分化的能力。它们可以分化为骨、脂肪和软骨组织等。目前临床上最常用的间充质干细胞来源为脐带、胎盘和脂肪组织等,间充质标记物,包括CD34CD29CD24和血小板来源的生长因子受体 (PDGFR)α/β

SFRP4+细胞群的特征是高表达分泌型卷曲相关蛋白2和4(SFRP2和SFRP4)(图3A和S3H),并与已发表的人类AT图谱中的一个亚群相吻合(图S3I)。尽管SFRP4+ hASPCs存在于所有脂肪组织中,但在OM脂肪组织的hASPCs中SFRP2的表达更高,而SFRP4的表达并没有升高(如图S3J和S3K所示)。

此外,研究人员还发现了三个脂肪组织特异性细胞群:FMO2+ hASPCs特异性位于PR和MC,而IGFBP2+细胞和间皮细胞主要特异性位于OM AT。尽管在MC中也检测到了少数IGFBP2+细胞(图2C、2D和3B),这可能是由于MC也被腹膜所覆盖。在OM AT中,间皮细胞是一种丰富的细胞类型(图2A和2D),特异性表达MSLNUP3KBLRRN4和角蛋白相关基因(图3A-3C),这与大量转录本中观察到的角蛋白相关基因的表达增加一致(图3C)。类似地,与其他脂肪组织相比,OM样本中富集了包括IGFBP2在内的IGFBP2+细胞标志物,以及APOEC7(图3A和3C)。研究人员用他们定义IGFBP2+细胞亚群的注释在一篇nature文章的数据库中也找到了类似的细胞亚群(图2G和S2G)。

最后,研究人员将整合后的人类scRNA-seq数据集中计算得到的每个细胞群的表达得分映射到之前在小鼠中鉴定出的细胞群(如图3E和3F所示),发现各细胞亚群之间存在高度一致性。通过将小鼠细胞群的表达得分映射到人类整合数据集上,进一步证明了这一点(如图S3L所示)。

综上所述,研究人员在单细胞水平对人类脂肪组织来源的基质细胞交叉分析,揭示了所有已分析的脂肪组织中均存在的五个细胞群:两个典型的hASPC亚群(hASCs和hPreAs)、VSMPs以及三个数量较少的基质细胞群:HHIP+、IFIT+和SFRP4+细胞。OM SVF中特异性存在的是高度丰富的间皮细胞群和较少丰度的IGFBP2+细胞群。此外,研究人员还发现人类和小鼠之间的scRNA-seq细胞群具有高度一致性。

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图 3| 脂肪组织中存在共同和独有的间质细胞群

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图 S3| 人类间质细胞的分子特性

拓展阅读

单细胞测序揭示的小鼠和人类脂肪组织中的细胞亚群

目前,利用单细胞测序技术,在小鼠和人类脂肪组织中定义出了5种普遍存在的细胞亚群,其中主要的细胞亚群为ASPC,ASPC又被细分为3个细胞亚群:(1)ASCs(Adipose stem cells):脂肪干细胞,主要表达DPP4和CD55,该细胞亚群具有高增殖能力,但分化能力较弱,在人类的脂肪组织中发现了一个表达DPP4、CD55和MFAP5的hASPC亚群,其转录谱特征类似小鼠ASCs,另外,人源ASCs只有在受到几种成脂诱导因子的组合刺激下才显示出完全的成脂潜能,单独使用胰岛素无法诱导其成脂,这点也与小鼠相似;(2)PreAs(Preadipocytes):脂肪前体细胞,该细胞亚群表达ICAM1和AOC3,与ASCs相比,PreAs细胞亚群增殖能力较弱,分化能力较强,具有更确定的成脂命运(Committed Adipogenic State),多个参与脂肪生成的基因,如Pparg、Fabp4、Lpl、Plin2或Cd36,都在这个细胞亚群中显著上升,在人体研究中,也同样鉴定出了类似于小鼠PreAs的细胞亚群,其表达ICAM1、PPARγ和GGT5,在体外实验中,人类PreAs的表现与小鼠类似;(3)Areg:特征性表达F3(编码CD142)的第三个ASPC细胞亚群在成年小鼠的iWAT中被首次报道,与ASCs相比,其基因表达谱更接近PreAs。在功能上,这些细胞不仅在体外抵抗成脂分化,而且在体外和体内实验中,还具有抑制其他ASPCs组分成脂分化的能力。本文中的HHIP+细胞亚群表达与小鼠Areg同源的marker,所以研究人员认为HHIP+细胞亚群就是Areg。 ASPC细胞亚群在人和小鼠之间是保守存在的。

除了ASPC之外,脂肪组织中的单细胞脂肪测序还揭示了其他几种细胞亚群,但在小鼠和人类中存在差异:

1.血管平滑肌祖细胞(Vascular smooth muscle progenitor,VSMP),其标志物有α-平滑肌肌动蛋白(alpha-SMA)、肌动蛋白重链(SM-MHC)等,该细胞亚群主要参与血管的生成和修复,在脂肪组织中的血管健康和功能维持中起作用。小鼠和人类中都存在类似的平滑肌细胞。

2.IFIT+细胞亚群:该细胞亚群在小鼠数据中为白色脂肪组织特有的间皮细胞亚群,但是在人类的数据库中,该细胞亚群并不表达间皮的标志物,而是表达间充质标记物,IFIT+细胞亚群表达干扰素相关基因,参与病毒免疫反应,属于基质细胞类型,具有分化的多潜能性。

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小鼠与人类中的同源细胞亚群图示

参考文献

[1] Emont MP et al. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 2022 Mar;

[2] Wu B et al, SFRP4+ stromal cell subpopulation with IGF1 signaling in human endometrial regeneration. Cell Discov. 2022 Sep 27;

[3] Villa-Bellosta R et al. Isolation and Culture of Aortic Smooth Muscle Cells and In Vitro Calcification Assay. Methods Mol Biol. 2015;

SVF Lin-亚群的分离与表型特征描述

接下来,研究人员想要从功能上表征不同脂肪组织的细胞亚群。首先,他们关注两个主要群体:hASC和hPreA(图2C)。基于scRNA-seq表达数据,他们开发了一种分选策略(图4A和4B),其中hASC被分选为Lin-/TM4SF1-/CD26+(此后称为CD26+),这是基于DPP4(编码CD26;图S4A)的特异性表达。研究人员针TM4SF1的选择旨在剔除hASPC中的间皮细胞和IGFBP2+细胞,这些细胞主要存在于OM AT中(图S4A-S4C)。为了分离hPreA,研究人员聚焦于差异表达的hPreA标记物,如GPC3(图2F),但所测试的抗体在流式细胞仪上的表现不佳(数据未展示)。因此,他们基于血管粘附蛋白1(VAP1)在hPreA群体中的高表达(由AOC3基因编码),将hPreA分选为Lin-/TM4SF1-/VAP1+(此后称为VAP1+)。然而,这种策略存在一个缺点,即VAP1也在VSMP中高表达,并且一些hPreA亚群不表达VAP1(图S4A和S4B)。因此,研究人员增加了额外的分选层,旨在富集既不表达CD26也不表达VAP1的hPreA(Lin-/TM4SF1-/CD26-/VAP1-,标记为双阴性[DN]细胞)。

采用这种分选策略,研究人员分析了来自37名人类捐赠者的SVF中Lin-组分的特征(图4C)。他们发现,与PR AT和SC AT相比,OM AT中的CD26+细胞群较少,而SC AT主要由DN细胞(小编注:Lin-/TM4SF1-/CD26-/VAP1-,标记为双阴性[DN]细胞主导,OM AT和PR AT则主要由VAP1+细胞主导(图4D)。在两名捐赠者的MC AT中也能检测到相同的三个群体,其比例类似于OM AT(图S4D和S4E)。与转录组学的发现一致,仅来自OM的SVF表现出明显的TM4SF1阳性细胞群(图4B、4C和S4F),尽管在网膜脂肪SVF Lin-部分也检测到少量TM4SF1+细胞(图S4F)。

在确认了这些亚群的存在后,研究人员接下来旨在研究它们在体外的表型行为。当单独分选时,无论来源于哪个脂肪组织,CD26+细胞群的增殖速度都快于其他所有细胞群(图S4G)。在成脂能力方面,CD26+细胞得分最低(图4E和4F),证明它们位于成脂谱系的根部。VAP1+细胞成脂能力最高,其次是DN细胞(图4E和4F)。然而,如上所述,VAP1+细胞可能同时包含hPreA和VSMP。因此,研究人员进一步明确了是哪些亚群导致了这种高成脂能力。由于在scRNA-seq数据中,VSMP的AOC3表达高于PreA(图S4A),研究人员将VAP1+细胞群分为VAP1表达较弱(VAP1+low;排除前20%阳性细胞)和VAP1表达较高(VAP1+high;前15%阳性细胞)的细胞(图4G)。在培养过程中,VAP1+high细胞呈现出VSMP特有的长纺锤形(图4H),且不能分化为脂肪细胞(图4I)。相比之下,VAP1+low细胞呈现出典型的间充质形态,并具有显著的成脂分化能力(图4H和4I),这与hPreA富集细胞群的结果一致。因此,VAP1+群体的高成脂能力很可能是由VAP1+low/hPreA驱动的,而不是由VAP1+high/VSMP驱动的。

接下来,研究人员探究了不同脂肪组织中SVF Lin-亚群体的相对丰度与捐赠者的BMI、年龄和性别等元数据之间的潜在相关性。有趣的是,研究人员发现虽然CD26+细胞的比例不受BMI的影响,但后者似乎与DN细胞的减少呈相关性。这种负相关在SC ATOM AT中尤为显著,并伴随着VAP1+细胞比例的轻微增加(图4J)。相比之下,捐赠者的年龄或性别似乎并未影响所分析脂肪组织中SVF Lin-细胞群的平衡(数据未显示)。

SC和PR中的相应细胞相比,所有三种OM 亚群的成脂潜力均显著较低(图4E)。为了确定不同的成脂潜力是否由细胞固有特征导致,研究人员在scRNA-seq数据集中探索了这些亚群的脂肪组织特异性转录组特征。他们注意到,在不同脂肪组织中,相比于hPreA,hASC的转录组更为相似(图2F和S4H),支持了脂肪组织特异性特征随细胞定型而累积的假设。随后,他们确定了以脂肪组织特异性方式富集的hASC和hPreA的基因(图4K)。与其高成脂能力一致,SC和PR组织中的hASC和hPreA显著高表达已知的成脂基因和转录因子,如KLF4KLF6WISP2APOEAPOC1CD36(图S4I)。例如,与其他脂肪组织相比,PIK3R1在PR中的表达上调最为显著,磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路在人类间充质干细胞的成脂过程中起着关键作用(小编注:此处作者并没有富集刀是PI3K通路,只有富集到了IGFreceptor通路,但是作者发现在PR里面PI3KR1这个分子显著上升,提示这个通路可能在干细胞分化过程中非常重要。文章在前边提到刚分离的PR细胞亚群表现出更高的成脂分化潜力,但在分化后期展示出产热和氧化代谢特征)对于成脂能力有限的细胞群中,如MC细胞过表达与未折叠蛋白或蛋白质折叠相关的基因(图S4I),如热休克蛋白(图4K),这是一个大型的分子伴侣家族。据报道,HSP与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorg γ,PPARγ)相互作用,HSP90可以稳定PPARγ并促进成脂,Hsp20破坏PPARγ的稳定并抑制成脂(小编注:MC; the mesenteric fat linked to the colon,从文章看此细胞亚群不是成熟脂肪细胞,是一种介于间皮细胞和间充质干细胞状态的stromal cell)。相反,OM细胞再次表现出与炎症反应相关的基因富集(图S4I),以及一系列先前描述过的对成脂具有负调控作用的标志物(RARRES2RSPO3RPL7PTNGALALDH1A1IGFBP3;图4K)。

综上所述,研究人员发现, hASPC因解剖来源的不同而具有不同亚群丰度,其平衡状态随着BMI的增加而发生变化。此外,即使在各种脂肪组织中普遍存在, hASC和hPreA也表现出脂肪组织特异性的基因特征,这些特征似乎是在细胞定型过程中获得的。

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图 4| ASChPreAVSMP之间的表型差异探究

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图 S4| 通过选择基于scRNA-seq推断的表面标记物,可以在所有分析的脂肪组织中富集主要的SVF细胞群体

OM特异性细胞抑制网膜和皮下hASPC的成脂分化

接下来,研究人员想要探究OM特异性细胞群(如间皮细胞和IGFBP2+细胞;图5A)是否会影响该脂肪组织中SVF细胞的成脂能力,因为这些独特的亚群表达了与网膜SVF细胞成脂功能受损相关的多个基因(小编注:CD200、WT1 和 ALDH1A2 是已经报道的与SVF细胞成脂功能相关的基因。CD200,也称为OX2,是免疫球蛋白超家族的成员。它的生物学功能尚不完全清楚,但已知它与多种免疫调节活动有关,特别是在髓系和其他免疫细胞类型中。CD200 在调节免疫反应和细胞间相互作用中起作用,可能与维持免疫平衡有关。在SVF中,CD200 的高表达可能与该组织特有的炎症环境有关。WT1(Wilms' Tumor 1)是一种转录因子,最初在Wilms瘤(一种肾脏肿瘤)中被发现。它在胚胎发育、细胞增殖、分化和凋亡中起关键作用。WT1 在多种组织中都有表达,包括肾脏、心脏和生殖系统。在脂肪组织中,WT1 可能参与调节细胞命运和维持组织稳态。ALDH1A2(Aldehyde Dehydrogenase Family 1 Member A2)是一种醛脱氢酶,参与将有毒的醛类代谢物转化为无害的酸。这种酶在肝脏、心脏、大脑和其他组织中都有活性。ALDH1A2 在解毒、细胞保护、细胞周期控制和细胞分化中起作用。在脂肪组织中,ALDH1A2 的表达可能与调节细胞的代谢状态和应对氧化应激有关

研究人员使用TM4SF1作为两种OM特异性细胞群的表面标记物(图S4C),探究存在或不存在TM4SF1+细胞的OM hASPCs的成脂潜力(图5C)。研究人员发现,与总的OM Lin-细胞群相比,OM Lin-/TM4SF1-细胞(称为OM hASPC)的成脂能力显著增强(图5D和5E)。相反,OM Lin-/TM4SF1+细胞(TM4SF1+)没有积累脂滴,并呈现出间皮细胞的典型鹅卵石状形态(图5D-5F)。重要的是,与整个Lin-细胞群相比,OM hASPC细胞观察到的分化程度的提高幅度大于按比例去除TM4SF1+细胞的预期效果(约占Lin-细胞群总数的20%,图4C)。这表明TM4SF1+细胞可能抑制了OM hASPC的成脂能力。

为了评估OM特异性细胞亚群对分化的抑制作用,研究人员将通常具有高度成脂性的SC和PR Lin-细胞与不同比例的OM Lin-细胞共培养(图5G和5H为SC细胞,图S5A和S5B为PR细胞)。共培养物的成脂潜力并不与OM与SC Lin-细胞的比例呈线性关系(图5H)。然而,随着SC细胞比例的增加,SC特异性标记物DKK2的表达也线性增加(图S5C),排除了SC细胞被OM细胞过度生长的可能性(小编注:由于观察到的DKK2基因表达水平与SC细胞的比例呈线性关系,这表明SC细胞并没有在培养过程中被网膜脂肪组织(omentum, OM)来源的细胞所淹没或取代。如果OM细胞过度生长并取代了SC细胞,那么预期的DKK2表达水平将不会随着SC细胞比例的增加而增加,或者增加的模式将不会是线性的。简而言之,这个观察结果表明,在共培养实验中,尽管OM细胞被引入到SC细胞中,SC细胞仍然保持了它们的特性,并且它们的DKK2基因表达水平没有受到OM细胞的负面影响,从而保持了与SC细胞比例的线性关系。这有助于确认实验中使用的细胞标记物和模型系统的可靠性)(图5I)。研究人员通过共培养复合物分化程度的增加与PR细胞比例之间的相对线性关系证明OM Lin-细胞与PR Lin-细胞的混合培养并未显示出明显的成脂调控作用(图S5A和S5B)。因此,OM TM4SF1+细胞降低了邻近细胞的成脂能力,并且这种抑制的敏感性具有脂肪组织特异性。OM TM4SF1+细胞抑制成脂的作用表明这一亚群在OM AT扩张中可能发挥一定作用。有趣的是,OM TM4SF1+细胞在总SVF Lin-细胞群中的相对比例与捐赠者的BMI呈正相关(图5J)。

根据scRNA-seq数据,TM4SF1+ OM特异性细胞可以进一步细分为两类:经典的间皮细胞和IGFBP2+细胞亚群(图5A)。为了分别研究这两个细胞群,研究人员使用TM4SF1作为标记来富集这两种OM特异性的细胞群,并添加间皮素(MSLN)作为经典标记来专门富集间皮细胞,因为与IGFBP2+细胞相比,间皮细胞中MSLN的表达更高(图S4A和S4C)。因此,研究人员将间皮细胞定义为TM4SF1+/MSLNhigh,将IGFBP2+细胞定义为TM4SF1+/MSLNlow。为了验证这两种细胞群在体内的存在,他们首先使用针对MSLN和TM4SF1的抗体进行免疫组织化学分析,两者均高度染色脂肪组织小叶的边界(小编注:脂肪小叶的边界是一个特殊的位置,因为它是脂肪细胞群的外围界限。在人体中,脂肪组织被组织成许多小叶,每个小叶由成熟的脂肪细胞组成,这些细胞被包裹在一层称为间皮细胞的扁平细胞中。这些间皮细胞形成了脂肪小叶的边界。这里研究人员使MSLN和TM4SF1的抗体进行免疫组织化学分析,发现这两种蛋白在脂肪组织小叶的边界处高度表达并被染色。MSLN是一种已知的间皮细胞标记物,而TM4SF1则被用作区分IGFBP2+细胞和间皮细胞的标记物。通过这种染色模式,研究人员能够识别和区分两种不同的细胞群体:间皮细胞(TM4SF1+/MSLNhigh)和IGFBP2+细胞(TM4SF1+/MSLNlow)

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(图S5D),揭示了OM周围的间皮单层腹膜结构。大多数阳性染色的细胞对两种标记物的染色强度相同(图5K和S5D,红色箭头)。然而,与MSLN通道相比,一些细胞在TM4SF1通道中表现出不成比例的高染色强度(图5K和S5D,白色箭头),这与IGFBP2+细胞的基因表达特征相似。接下来,研究人员旨在更直接地可视化IGFBP2+细胞,但由于IGFBP2是一种分泌蛋白,免疫组织化学可能不适合。因此,他们使用RNAScope技术进行了原位杂交。与组织学和scRNA-seq数据一致,大多数IGFBP2阳性细胞在某种程度上共表达MSLN(图5L,白色箭头)。然而,大多数MSLN阳性细胞不表达IGFBP2(图5L,绿色箭头)。因此,scRNA-seq、免疫组织化学和RNAScope数据表明,即使IGFBP2+细胞仍然残留表达MSLN,也可以将经典的间皮细胞与IGFBP2+细胞群区分开来。

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图 5|ASC、hPreA和VSMP之间的表型差异探究

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图 S5|OM抑制细胞以脂肪组织特异性的方式发挥作用

OM特异性细胞抑制网膜和皮下hASPC的成脂分化

scRNA-seq数据集揭示了IGFBP2+细胞群具有一个有趣的双重基因表达特征,它与hASPCs和间皮细胞有共同标记物(图6A)。重要的是,IGFBP2+细胞并未显示出更大的文库数据大小或捕获的特征数量(图S6A),说明这不是因为双细胞所造成的(小编注:在单细胞RNA测序(scRNA-seq)中,每个细胞单独被分离并进行RNA测序,以获得该细胞的基因表达谱。理想情况下,每个测序文库应该只包含单个细胞的RNA。然而,在某些情况下,可能会发生两个细胞意外地被同时捕获并包含在同一个测序文库中,这种情况被称为“双细胞”(doublets)。双细胞的存在可能导致数据解释上的复杂性,因为它们的基因表达数据将代表两个细胞的混合,而不是单个细胞的准确表达水平。在上文中提到的IGFBP2+细胞群表现出双重基因表达特征,意味着这些细胞同时表达与hASPCs(人类脂肪干细胞)和间皮细胞相关的基因标记。作者指出,IGFBP2+细胞并未显示出更大的文库数据大小或捕获的特征数量(图S6A),这表明这些细胞不太可能是双细胞。这是因为如果一个文库包含了两个细胞,通常会预期会有更高的数据量和更多的基因特征被捕获。因此,IGFBP2+细胞的基因表达数据更可能是来自单个细胞的真实表达情况,而不是双细胞混合的结果。此外,这些细胞表达特定的标记物(如IGFBP2RBP1WNT4WNT6)在表达水平上高于单独的hASPC或间皮细胞(图6B)。研究人员将细胞注释转移到已发表的人类SC和OM AT单细胞图谱时,发现只有OM细胞对IGFBP2+细胞具有正预测评分(图S6B)。此外,预测为IGFBP2+的细胞与一个在AT scRNA-seq图谱中独立鉴定的细胞群对应(图S2G和图S6C-S6E),并显示出对IGFBP2+细胞标记物的富集(图S6E)。有趣的是,这种细胞群(相对于hASPC和间皮细胞)的丰度与捐献者的BMI呈正相关(r = 0.95,图S6F)。除了表达它们自己的特定标记物外(图S6G和S6H),预测的细胞还共表达间皮细胞和hASPC标记物(图S6I),并在两种细胞类型之间呈现“桥梁”排列。这种基因表达的双重性可能反映了细胞从一种类型向另一种类型的转变。为了验证这一假设,研究人员使用基于图的分区抽象(PagA)对OM scRNA-seq数据集进行了轨迹推断。推断的图预测了IGFBP2+细胞亚群将OM hASPC连接到间皮细胞的分支(图6C和6D)。作为图形结构有效性的正、负对照,hASC和hPreA通过一个稳健的分支连接,而VSMP则未与主轨迹连接。当细胞沿着从hASC到间皮细胞的轨迹拟时序排序时(图6E),可以观察到连接分支上hASPC和间皮细胞标记物的逐渐减少和增加(图6F),以及IGFBP2+细胞标记物的上调(图6G)。综上所述,这些结果表明IGFBP2+细胞可能代表了介于间皮细胞和间充质细胞类型之间的细胞。相应地,IGFBP2+细胞中富集了“上皮-间充质转变”(EMT)的通路(图6H)(小编注:在上文中提到的IGFBP2+细胞表现出双重基因表达特征,它们同时表达与hASPCs(人类脂肪前体细胞)和间皮细胞的标记物。这种表达模式暗示这些细胞可能处于一种过渡状态,介于间皮细胞和间充质细胞之间。间皮细胞是一种上皮细胞类型,它们覆盖在器官表面,而间充质细胞则是具有不同分化潜能的细胞。“上皮-间充质转变”是一种生物学过程,其中上皮细胞通过特定的分子变化获得间充质细胞的特性,这通常涉及到细胞形态的改变、粘附性的降低以及迁移能力的增强。这里提到IGFBP2+细胞中EMT通路的富集时,它并不是指典型的间皮细胞向间充质细胞的转变,而是指这些细胞表现出了EMT过程中一些关键的分子特征和特性,这可能反映了它们在两种细胞类型之间的过渡状态。这种状态可能涉及到细胞表型和功能的转换,类似于EMT过程中所发生的改变,以及Wnt家族基因、基质金属蛋白酶(MMPs)、锌指E-盒结合(ZEB)转录因子等与EMT相关的基因的高表达(图6I)。转化生长因子β(Transforming growth factor β, TGF-β)信号是与伤口愈合和纤维化相关的EMT的主要调节因子。同样地,研究人员发现IGFBP2+细胞表达响应TGF-β反应相关的基因(图6H)。与EMT相关的其他通路,如血管生成、缺氧、炎症反应、细胞周期标记物和粘附分子的下调,在IGFBP2+细胞标记物中均显著富集(图6H)。因此,这些发现表明可能存在介于间皮细胞和间充质细胞类型之间过渡的细胞(小编注:间皮细胞是一种上皮细胞,它们主要的功能包括:1. 形成屏障:间皮细胞覆盖在器官和组织的表面,形成保护层,防止外部物质的侵入;2. 分泌功能:它们可以分泌多种生物活性分子,如细胞因子、生长因子和酶,参与局部的生理和病理过程;3. 免疫调节:间皮细胞参与免疫反应,能够与免疫细胞相互作用,影响炎症过程;4. 修复与再生:在组织损伤后,间皮细胞可能参与组织的修复和再生过程。细胞类型转换在癌症中是一个常见的现象,特别是在EMT过程中,肿瘤细胞获得间充质细胞的特性,从而增强了它们的侵袭和转移能力。然而,细胞类型转换并不仅限于癌症,在正常生理过程和疾病状态中也可能出现。例如,在组织修复、发育和再生过程中,细胞可能会经历从一种类型转换为另一种类型的过渡状态。在脂肪组织中,细胞类型转换的现象已有报道,尤其是在成体干细胞和前体细胞分化为成熟脂肪细胞的过程中。例如,前体细胞(如间充质干细胞)可以分化为成熟的脂肪细胞。此外,已经分化的细胞可以通过重编程转换为其他类型的细胞。例如,通过改变关键转录因子的表达,可以将成熟脂肪细胞重编程为干细胞样状态。)

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图 6|IGFBP2+细胞在间皮和间充质状态之间的转换

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S 6|利用计算方法和独立发表的数据集识别网膜IGFBP2+细胞

网膜IGFBP2+基质细胞通过IGFBP2抑制脂肪生成

为了根据基因表达特征(图S2C)分离并功能性地鉴定出与间皮细胞不同的IGFBP2+细胞,研究人员利用荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting, FACS)技术,基于MSLN信号进一步分选Lin-/TM4SF1+细胞群。通过这种方式,间皮细胞(Lin-/TM4SF1+/MSLNhigh)与低MSLN表达的IGFBP2+细胞(Lin-/TM4SF1+/MSLNlow)得以分离。此外,剩余的OM hASPC即为Lin-/TM4SF1-细胞亚群(图7A和图S7A)。通过比较Lin-/TM4SF1+/MSLNlow细胞与OM hASPC(Lin-/TM4SF1-)和SC SVF Lin-细胞的IGFBP2表达水平,验证了这种分选策略的有效性(图7B)。有趣的是,贴壁生长的Lin-/TM4SF1+/MSLNlow细胞显示出典型的间皮细胞样卵石形态;然而,在扩张时,它们倾向于呈现纺锤形,类似于间充质细胞(图S7B),这表明它们可能处于过渡状态。IGFBP2作为分泌因子,它在OM Lin-/TM4SF1+/MSLNlow细胞上清液中的浓度显著高于Lin-/TM4SF1+/MSLNhigh细胞、网膜、皮肤或皮下脂肪hASPC上清液中的浓度(图7C)。并且研究人员证明了体外培养的OM AT会分泌IGFBP2,而且随时间呈线性趋势(图7D)。

鉴于已有研究表明IGFBP2具有抗脂肪生成的特性(小编注:IGFBP2通过其高亲和力结合IGF-1,减少IGF-1的可用性,从而降低IGF-1与其受体(IGF-1R)的相互作用。抑制IGF-1诱导的脂肪细胞分化和脂质积累;IGFBP2的RGD基序(Arg-Gly-Asp)能够与整合素(如α5β1整合素)相互作用,激活FAK(焦点粘附激酶)和Src激酶,抑制PI3K/Akt信号通路,减少脂肪生成;IGFBP2还通过调控一些转录因子(如PPARγ),间接影响脂肪的分化和功能),研究人员想要进一步探究是否表达IGFBP2的细胞能够解释OM TM4SF1+细胞群的旁分泌抗脂肪生成效应(图5D和5E)。为了验证这一点,研究人员设计了Transwell实验,他们将成脂SC SVF Lin-细胞接种在底部,将不同组分的OM基质细胞接种在顶部(图7E)。结果显示,OM Lin-/TM4SF1+/MSLNlow细胞对SC细胞的成脂抑制作用最强,而当SC细胞暴露于OM Lin-/TM4SF1+/MSLNhigh细胞群时,其抑制作用则相对较弱(图7E和7F)。与共培养实验结果(图S5A和S5B)一致,在Transwell实验中,PR hASPCs对OM SVF Lin-细胞亚群的抗脂肪生成作用具有抗性(图S7C和S7D)。

为了评估IGFBP2分泌是否与表达IGFBP2的细胞亚群的抗脂肪生成效应有关,研究人员使用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)敲低(knocked down, KD)了IGFBP2。在mRNA和分泌蛋白水平验证了敲低效果后(图7G和图7H),研究人员再次使用Transwell实验将SC SVF Lin-细胞暴露于转染了对照(NC1)或IGFBP2 siRNAs的细胞中。暴露于IGFBP2敲低细胞的SC细胞形成的脂滴明显多于对照组的细胞(图7I和图7J),这证明了IGFBP2分泌参与了Lin-/TM4SF1+/MSLNlow细胞的抗脂肪生成作用。与此一致,从2 nM开始,重组IGFBP2蛋白以剂量依赖的方式抑制SC或PR脂肪组织的SVF细胞脂肪生成,尽管在PR细胞中影响较小(图7K-7O,S7E和S7F)。这个浓度与在IGFBP2+细胞培养液中测得的浓度处于相似范围(1 nM = 33 ng/mL)(图7C)。

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7|网膜中的IGFBP2+基质细胞通过分泌IGFBP2来抑制脂肪生成

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S 7| IGFBP2+抗成脂作用的机制

IGFBP2通过整合素信号通路抑制成脂分化

IGFBP2可以通过依赖胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)的途径或不依赖IGF的途径发挥作用。在第一种情况下,hASPC细胞外环境中的IGFBP2会捕获IGF-IIGF-II,并干扰其促进脂肪生成信号。为了检验IGFBP2是否通过捕获IGF发挥作用,研究人员同时用IGFBP2IGF-IIGF-II处理SVF贴壁细胞,以及单独使用这三种重组蛋白。尽管大多数文献使用浓度约为10 nMIGF-IIGF-II,但在2.540 nM的任何浓度下研究人员均未观察到其对hASPC脂肪生成潜能的显著影响(图S7ES7F)。然而,研究人员使用的成脂培养基配方通常会引起高量的脂质积累,这可能掩盖了IGF的脂肪生成效应。为了控制这一点,他们还测试了使用低效的成脂培养基配方(小编注:如图S7G所示,研究人员对标准成脂培养基配方进行改动,只加Dex/IBMXDEX/Insulin或只加Dex。所加的成脂诱导剂较少,不能充分激活下游成脂信号通路,所以称为低效的成脂培养基IGF的效果。然而,在这种情况下,IGF-IIGF-II都没有影响脂质积累(图S7G)。此外,对于SC细胞来说,IGFBP2对脂肪生成的抑制作用在有或没有IGF存在的情况下都是相似的(图7K-7L),这表明IGFBP2以不依赖IGF的方式影响脂肪生成。同样的,PR细胞系对IGFBP2IGF处理的作用也不敏感(图S7JS7K),这与之前的观察结果一致,即PR SVF贴壁细胞在Transwell实验中对OM SVF Lin-细胞或OM SVF Lin-/TM4SF1+/MSLNlow细胞的抑制作用不太敏感(图S5AS5BS7CS7D)。

由于OM hASPC与分泌IGFBP2的细胞在解剖位置上共定位,接下来,研究人员探索了OM hASPC本身能在多大程度上响应IGFBP2IGF处理。尽管OM TM4SF1+细胞本身脂肪生成能力较低,但可以观察到,当这些细胞受到IGFBP2处理时,其分化能力会受损(图7M7N)。与PRSC细胞相反,OM细胞对IGF-IIGF-II处理更为敏感,但不同批次之间的变异性很大(图7M7N)。然而,当与IGFIGFBP2共同处理时,OM TM4SF1+细胞的分化能力再次显著低于未处理细胞(图7M7N)。IGF处理不影响IGFBP2的作用这一事实再次证实了IGFBP2以不依赖IGF的方式起作用的假设。

此外,IGFBP2也可以结合识别RGD结构域的整合素受体,尤其是α5β1整合素受体,其信号可以阻止脂肪细胞分化(小编注:整合素信号通过激活FAK和Src,可以抑制PI3K的活性,从而抑制Akt的激活,减少脂肪细胞分化;整合素信号通过FAK和Src激活Rho家族GTP酶(如RhoA、Rac1和Cdc42),RhoA/ROCK信号通路可以通过抑制PPARγ来抑制脂肪细胞分化;C/EBPα:协同PPARγ促进脂肪细胞分化,整合素信号可以间接抑制C/EBPα的表达;整合素信号可以通过上调Wnt信号通路,增强β-catenin的稳定性和活性,抑制脂肪细胞分化为了测试整合素受体信号在IGFBP2抗成脂作用中的影响,研究人员使用了已知的RGD结合整合素受体拮抗剂echistatin处理细胞,结果表明,共同处理IGFBP2和echistatin的细胞的脂肪生成潜力与对照组细胞相似(图7K和7O)。细胞外信号调节激酶1和2(ERK1/2)在响应RGD结合整合素受体时被激活,研究人员通过分析ERK1/2的磷酸化来证明IGFBP2参与了整合素信号转导。IGFBP2增加了SC AT的SVF细胞中ERK1/2的磷酸化,而这种作用被echistatin处理所消除(图S7H)。相比之下,echistatin对胰岛素激活的ERK1/2没有影响,证明其对IGFBP2信号的特异性作用(图S7H)。有趣的是,IGFBP2也在PR AT中触发了ERK1/2信号,但程度较小(图S7I),这可能解释了为什么在这个浓度下IGFBP2处理并没有显著抑制脂肪生成。此外,echistatin处理显著增强了SC SVF贴壁细胞的分化(图7K和7O),而与SC细胞相比,在PR细胞中,echistatin处理后总体成脂能力较小但显著增加(图S7J和S7L)。这表明IGFBP2/整合素信号轴在SC AT中更为显著。最引人注目的是,当用echistatin处理OM TM4SF1+细胞时,这些本质上不成脂的细胞积累脂滴的能力显著增加(图7M和7P)。此外,与未处理细胞相比,echistatin和IGFBP2共同处理显著增加了分化,但效果不如仅使用echistatin处理显著(图7M和7P)。综上所述,这些结果强调了整合素受体信号在调节hASPC脂肪生成中的作用。

接下来,研究人员测试了在本身不表达IGFBP2的细胞中(如SC hASPC)过表达IGFBP2是否可以削弱其脂肪生成能力。为此,他们使用编码Myc-DDK-IGFBP2Myc-DDK(作为对照)的慢病毒载体转染SC hASPC。转染了IGFBP2的细胞有效地将IGFBP2分泌到细胞培养液中,而通过在培养液中加入含有brefeldin A monensin的蛋白转运抑制剂组合(PTIC),可以完全阻断这种分泌作用(图S7MS7N)。相应地,当使用PTIC处理转染了Myc-DDK-IGFBP2的细胞时,在裂解物中观察到大量积累的IGFBP2(图S7N)。这些结果表明, 转染后的SC hASPC有效地表达和分泌了IGFBP2。当诱导分化时,对照组细胞明显积累了脂滴。相比之下,表达IGFBP2的细胞大部分保持梭形,仅显示少量小脂滴(图S7O)。综上所述,这些观察表明,SC hASPC中过表达IGFBP2会削弱其脂肪生成分化(小编注:在本文中,研究人员将hASPC分为两个细胞亚群,hASCPreAs,其中hASC共表达DPP4CD55PI16,以及参与增殖、胶原合成和干性的基因,PreAs差异性地表达已分化脂肪细胞的标记物,如PPARGFABP4PDGFRAAPOCAPOE,并显示出与分化、定型和脂质转运相关的基因富集。本文中主要研究IGFBP2PreAs细胞亚群成脂能力的抑制。

总结 

肪组织的可塑性是由SVF中分子和功能多样的细胞共同调节的。尽管目前已经鉴定出多种小鼠和人类的脂肪SVF细胞亚群,但我们仍缺乏对人类脂肪组织中ASPC亚群和功能异质性的理解。为了解决这个问题,研究人员对四个不同人类脂肪组织的SVF/Lin-样本进行了单细胞和整体RNA测序(RNA-seq)分析,揭示了两种普遍存在的hASPC亚群,它们具有不同的增殖和脂肪生成特性,但其比例也与脂肪组织和体重指数有关。此外,研究人员还鉴定出一种网膜特异性高表达IGFBP2的基质细胞群,并通过分泌IGFBP2来抑制hASPC的脂肪生成。该研究强调了不同脂肪生态位之间的分子和细胞独特性,该研究团队所发现的具有显著抗脂肪生成功能的IGFBP2+网膜特异性细胞群,为解释生物医学领域内观察到的网膜hASPC有限的脂肪生成能力提供了新的见解和理论支持。

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原文链接:https://www.cell.com/cell-metabolism/fulltext/S1550-4131(24)00137-2



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