撰文 | 夏志蕊 王颖雯 朱丽君 刘爽 曹玉香

编辑 | 孟美瑶

校对 | 朱丽君

背景介绍

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是全球范围内最普遍的慢性肝脏疾病，由于肥胖的流行，其发病率预计在未来数十年内将进一步上升。NAFLD被认为是代谢综合征的肝脏病征，并能够向非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化等更严重的形式发展，同时伴有多种并发症和合并症。更重要的是，一部分NASH患者可能发展为致命的肝细胞癌（HCC），它是美国和欧洲增长最快的癌症，并在中国和印度也呈现相似的增长趋势。像中国等处于快速发展阶段的国家中，肥胖和相关疾病（包括NASH）患病率的迅速上升，部分原因是由于生活方式的改变，在饮食上从更传统和均衡的食物转变为超加工、高热量的食物和含糖饮料，即西方饮食（WD）。因此，NASH/HCC不仅在宏观经济层面造成了当前和未来巨大的社会经济负担，而且在个体层面也降低了生活质量。目前没有获批的能够专门针对NAFLD、NASH或其向HCC转变的药物（小编注：2024年3月14日Resmetirom是由Madrigal Pharmaceuticals开发的甲状腺激素受体-β（THR-β）激动剂，被FDA批准用于治疗伴有肝纤维化的成人NASH患者，可谓是首款NASH 新药，弥补了NASH治疗药物长期处于空白的状态，但文章中介绍说没有相关药物，推测是文稿发表时，该药并未上市），因此是否可以使用非侵入性的、基于饮食限制（DR）的方法来治疗这种慢性疾病，并且能够明确产生积极作用的基本分子机制还有待进一步研究。 

在此背景下，时间限制性饮食（TRF）或模拟禁食饮食（FMD）等间歇性禁食（IF），或其他形式的饮食干预（小编注：模拟禁食饮食是通过限制热量和蛋白质摄入来触发自身修复和再生机制。通常以一个月为周期，进行5天的限制饮食，然后再进行25天正常饮食。），作为肥胖和代谢性疾病的可行性措施越来越受欢迎。此外有研究表明，适度的热量限制可以改善人类的代谢健康并延长健康寿命。有研究表明基于DR的治疗方法可以降低代谢综合征患者的体重、血压和动脉粥样硬化，并调节肠道微生物群以促进肠道再生，减少炎症性肠病并缓解糖尿病引起的认知障碍。但是在一些临床前模型中，TRF被证明对动脉粥样硬化缺少保护作用，而IF则表现出对抗血脂异常和动脉粥样硬化的积极作用。 

最近有越来越多的研究报道强调了基于禁食的治疗方法的好处，这逐渐影响到了大众的认知并被接受。例如，IF（5:2）方案，是2020年最受欢迎的饮食干预方案，即个人每周非连续2天自愿禁止摄入食物和高热量饮料（或显著限制食物热量）。此前有越来越多的研究强调了基于DR的干预措施对肥胖和非肝脏相关疾病的益处，但禁食治疗方法在NASH和随后的HCC发展中的潜在作用以及相关的细胞和分子机制仍然未知。 

近期，发表于Cell Metabolism的一篇文章“A 5:2 intermittent fasting regimen ameliorates NASH and fibrosis and blunts HCC development via hepatic PPARα and PCK1”中利用不同的肥胖饮食诱导的NASH模型，探究了IF方案在NASH和NASH向HCC转变过程中的治疗潜力。

间歇性禁食（IF）与新陈代谢

参考文献：[1] De Cabo, R., et al. N Engl J Med. 2019 Dec 26;381(26):2541-2551.

敲黑板啦！ 

1.IF（间歇性禁食）对肥胖和NASH的发展具有保护作用；2.PPAR通路和脂肪酸氧化在NASH禁食反应中至关重要；3.PPARα和GR-PCK1联合参与肝脏禁食反应；4.IF延缓NASH向HCC的转变进程。

背景介绍

1. IF对饮食诱导的肥胖和NASH的发展具有保护作用

为了探究IF是否可以预防NASH的发展，研究人员总结最近的初步临床前证据发现禁食可以影响肝脏脂质代谢以促进代谢健康。研究人员使用了基于WD（富含非反式脂肪酸和糖（果糖和蔗糖）的饮食）的临床前NASH模型，给予8周龄雄性C57BL/6J小鼠正常饮食或给予WD喂养32周以诱导NASH（图1A）。对照组（Chow和WD组）能够自由进食和饮水。实验组相对应的喂养WD的一组小鼠接受IF（5:2）方案，即每周非连续2天的禁食（禁止摄食，但可以自由饮水），每个禁食周期持续24小时（图1A）。由于小鼠主要在夜间活动，因此禁食周期在活跃期开始时（7p.m.）开始，接受IF（5:2）方案的小鼠在所有非禁食日都可以自由获取食物（图1A）。并且所有小鼠都将在喂食状态下被解剖（即所有小鼠都将在最后一个禁食周期结束后48h被处死），这保证了禁食小鼠在被处死时也处于进食状态。血清学（如谷丙转氨酶（ALT）），组织学（如纤维化、炎症）和生理学（如体重）在内的最终评估指标检测都是在小鼠处于喂养状态时进行的（图S1A）。这一方式能够确保所有实验组的营养和喂养状态保持一致。

与正常饮食小鼠相比，自由摄入WD的小鼠体重显著增加，核磁共振测量的脂肪量增加，附睾和腹股沟白色脂肪组织（eWAT/iWAT）也增加；而与自由摄入WD的小鼠相比，接受IF（5:2）方案的小鼠对WD诱导的肥胖具有抵抗作用（图1B-C，图S1B-G）。重要的是，禁食小鼠的瘦肉/体重百分比明显高于自由摄入WD的对照组，这表明IF（5:2）方案不会导致肌肉萎缩（图S1D-E）。此外，禁食小鼠的血清胆固醇和空腹血糖水平明显低于自由摄入WD的对照组，这表明禁食小鼠的脂质水平和葡萄糖稳态得到改善（图1D-E）。接受IF（5:2）方案的小鼠也表现出肝脏病理状况的改善，血清肝损伤标志物（ALT/ALP）(小编注：ALP，即碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase），是一种广泛分布于人体各脏器器官中的酶，其中以肝脏为最多，其次为肾脏、骨骼、肠、和胎盘等组织。血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼。ALP在临床上通常作为肝胆疾病和骨骼疾病的诊断指标之一，类似于AST/ALT；它主要功能是催化核酸分子脱掉5'磷酸基团，促进DNA或RNA片段的5'-P末端转换成5'-OH末端。当发生阻塞性黄疸、原发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等疾病时，由于肝细胞过度制造ALP，同时胆汁排泄障碍引起血清中ALP升高。另外，血清中的ALP有约一半来自骨组织，因此若身患骨软化症、佝偻病、骨细胞癌、恶性肿瘤骨转移、骨质疏松时，会向血液中释放过量的ALP，血清ALP亦可升高，是骨代谢标志物之一，因此血清ALP水平可以用来诊断肝胆疾病和骨骼疾病。)水平显著降低，肝脏重量（g）和肝体重比（%）显著降低，表明间歇性禁食对WD诱导的肝脏肥大有所缓解（图1F-I，图S1H-I）。此外，与自由摄入WD的对照组相比，禁食小鼠在肝脏脂肪变性、退行性气球样变和炎症方面均有所改善，表现为肝脏甘油三酯含量、苏丹红染色和NAFLD活性评分（NAS）显著降低（图1J-K）。苏丹红染色和肝脏甘油三酯之间表现出强烈的正相关（图S1J））。与自由摄入WD的对照组相比，间歇性禁食小鼠的肝纤维化和炎症也明显缓解，特别是髓系聚集体（F4/80⁺细胞，MHCII⁺细胞），血小板（CD42b⁺细胞），以及自身侵袭性细胞毒性CD8⁺/PD1⁺ T细胞的浸润减少（小编注：髓系聚集体（F4/80⁺细胞，MHCII⁺细胞）通常指的是在肿瘤微环境中的免疫细胞，如巨噬细胞，它们表达F4/80和MHCII分子，参与抗原呈递和免疫调节过程。血小板（CD42b⁺细胞）在肿瘤微环境中可能通过释放生长因子和细胞因子参与肿瘤血管生成和转移。自身侵袭性细胞毒性CD8⁺/PD1⁺ T细胞是抗肿瘤免疫反应中的关键角色，它们能够识别并杀死肿瘤细胞。）（图1K-P，图S1K-M）。总之，以上结果表明IF（5:2）方案不仅可以减轻饮食诱导的肥胖和代谢功能障碍，而且可以缓解NASH的发展。

2. 禁食诱导的改善作用与总热量摄入无关

研究人员继续探究IF（5:2）方案是否影响WD小鼠的总热量摄入和全身代谢（图2A）。通过统计发现接受IF（5:2）方案的小鼠在一周内的平均每日食物摄入量（kcal /只/天）与普通饮食或WD自由饮食的小鼠相比没有显著差异（图2B）。这是因为禁食小鼠表现出过度摄食的反应，在摄食日显著提高摄食量来弥补禁食日的食物缺乏（图2C-D，图S2A）。与先前报道一致，这表明某些饮食方案如TRF在不影响总热量摄入的情况下，仍可以改善肥胖和代谢功能障碍。此外，WD自由进食和间歇性禁食小鼠之间的平均每日饮水量没有显著差异（图S2B）。研究人员又进一步评估禁食对全身代谢的影响，与自由饮食的对照组相比，在禁食的2天中，间歇性禁食小鼠的呼吸交换比率（RER）显著降低，表明脂肪酸氧化增加（图2E-F、图S2C-D）。重要的是，在禁食24h后小鼠体内脂肪酸氧化的副产物β-羟基丁酸（酮体）和生酮作用显著增加（图2G）。相比于自由摄入WD的对照组，接受IF（5:2）方案的小鼠在2个禁食日中的耗氧量（VO2）和活动量也显著降低（图S2E-J）。总之，接受IF（5:2）方案的小鼠在总热量摄取方面和对照组没有表现出任何显著差异，但是在禁食周期中小鼠的VO2和活动量降低，全身代谢发生了变化，脂肪酸氧化和生酮作用增加。

3. 禁食周期的长度、数量和时间以及NASH饮食的类型决定了禁食作用的有效性

随后，研究人员系统地研究了哪些因素在间歇性禁食方案减缓NASH发展中的扮演至关重要的角色。研究人员首先探究了每周禁食总时长或禁食周期的长度在调控禁食效果中的重要作用。研究人员利用可以充分表征NASH特点的胆碱不足的高脂饮食（CD-HFD）喂养8周龄雄性C57BL/6J小鼠32周以建立NASH模型（图2H）。之所以采用CD-HFD模型，是因为它是一种较温和的NASH饮食，与WD模型相比只表现出轻微的纤维化，能够让研究人员更好地解析禁食方案的复杂性。对照组为“自由摄入CD-HFD”，能够自由进食和饮水，并且设置两组接受不同IF方案的小鼠，同时都给予CD-HFD喂养32周（图2H）。第一组为IF（5:2-12h）方案，CD-HFD喂养的小鼠每周非连续禁食2天，每次禁食周期仅持续12h，每个禁食周期开始于活跃期开始时（7p.m.），结束于次日早晨（7a.m.）。第二组为IF（6:1-24h）方案，喂食CD-HFD的小鼠每周只禁食1天，但每个禁食周期持续24小时，每个禁食周期开始于活跃期活动时（7p.m.），结束于次日晚上（7p.m.）。即两个IF组每周禁食24h，IF（5:2-12h）组每周禁食2次，每次持续12h，IF（6:1-24h）组每周禁食1次，持续24h（图2H）。同样在喂食状态下进行小鼠解剖，既在最后一个禁食周期结束后48小时完成小鼠处死（图S2K）。        与自由摄入CD-HFD的对照组相比，接受IF（6:1-24h）方案而不是IF（5:2-12h）方案的小鼠体重、体脂量、血清胆固醇和空腹血糖显著降低（图S2L-Q）。与CD-HFD对照组相比，IF（6:1-24h）和IF（5:2-12h）组均表现出更低的肝脏重量（g）和肝体重比（%）以及更低的血清ALT和ALP水平，但IF（6:1-24h）组的下降效果更明显（图S2R-U）。同时接受IF（6:1-24h）方案的小鼠与自由摄入CD-HFD的对照组相比，肝脏甘油三酯、肝脏脂肪变性、纤维化和免疫浸润（髓系：F4/80⁺, MHCⅡ⁺细胞）显著降低，NAS评分总计更低（图2I-O）。蛋白质组学分析证实，与自由饮食对照组相比，接受IF（6:1-24h）方案的小鼠的胶原沉积/纤维化和免疫浸润减少（图2P-Q）。然而，与自由摄入CD-HFD的对照相比，接受IF（5:2-12h）方案的小鼠肝脏甘油三酯、纤维化、炎症或NAS没有显著降低（图2I -O）。并且和前面结论保持一致，IF（6:1-24h）和IF（5:2-12h）方案均不显著影响总热量摄入，但在禁食期间显示RER降低，表明与自由饮食相比，脂肪酸氧化增加（图S3，图S4）。因此，这些数据表明，与CD-HFD喂养的IF（5:2-12h）方案小鼠相比，接受IF（6:1-24h）方案的小鼠不仅在全身性肥胖和代谢参数方面，而且在肝脏病理方面都产生了更好的结果。这表明在保持组间每周禁食总时长（24 h）相同的情况下，禁食周期（连续24h>12h进行2次）的长度更长发挥着更显著的积极作用。        为了更为详细地研究禁食周期的复杂性，研究人员进一步探究每周禁食周期的次数和禁食开始的时间（活跃期vs非活跃期）是否也在NASH的发展中发挥重要的调节作用。通过喂养8周龄雄性C57BL/6J小鼠WD 32周以诱导NASH（图3A）。同样对照组（Chow和WD组）能够自由摄取食物和水。一组小鼠接受IF（6:1）方案，在活跃期（晚上7点至次日晚上7点-连续24h）每周禁食一次，禁食方式与CD-HFD模型相似。由此来确定每周一次的禁食周期是否同样能够在WD诱导的NASH模型中产生作用。与CD-HFD所造成的轻度纤维化相比，WD则是一种更具侵袭性的饮食诱导方式。因此，根据饮食诱导疾病的严重程度，可能需要更长的禁食周期才能获得禁食方案的作用。此外，喂食WD的小鼠还接受了两种额外的禁食方案：IF（6:1）或IF（5:2）开始于非活跃期（上午7点至次日上午7点-连续24h）（图3A）。因为小鼠都是夜行性动物，类似人类在傍晚启动禁食周期（开始处于睡眠状态），这与小鼠在活跃期（晚上7点至次日晚上7点-连续24小时）启动IF（5:2）方案这一最初的实验相反（图1）。与自由饮食对照保持一致，所有小鼠将均在进食状态下进行解剖，确保禁食小鼠在处死时也处于进食状态（图S5A）。        与自由进食WD的对照组相比，所有这些禁食方案（IF6:1；7p.m.-7p.m. 或IF6:1/IF5:2；7a.m.-7a.m.）的小鼠均未显示出体重或空腹血糖水平的显著变化（图3B-C，图S5B-G）。此外，与WD自由饮食对照组相比，禁食组小鼠的血清肝损伤标志物（ALT/ALP）、肝脏甘油三酯和肝脏重量也无显著变化（图3D-G，图S5H-I）。以上数据表明，这些特定的禁食方式并没有减轻WD诱导的代谢功能障碍、肝肿大或肝脏脂肪变性。与自由摄入WD的对照组相比，在非活跃期开始的IF（5:2）方案显示出更少纤维化和炎症的趋势，但不论在活跃期还是非活跃期开始的IF（6:1）均未显示出任何明显的改善（图3H-K）。并且非活跃期（(7 a.m.-7 a.m.）开始的IF（5:2）方案与在活跃期（7 p.m.-7 p.m.）开始的IF（5:2）方案相比，在代谢参数和肝脏病理方面都没有显示出显著下降。以上数据表明有四个关键参数影响禁食方案在NASH中的疗效（图S5J）。不仅禁食开始时间（活跃期>非活跃期）和禁食周期长度（24h>12h*2）发挥重要作用，并且禁食周期数（每周2个周期>1个周期）和饮食成分（更激进的WD和较温和的CD-HFD）在调控禁食效应在NASH治疗中发挥重要作用。

MCD\CD-HFD\WD饮食特点

4. 蛋白质组学揭示了PPARα和脂肪酸氧化是NASH禁食期间的关键机制

为了确定IF在NASH中发挥作用的基本机制，研究人员用普通食物或NASH饮食喂养C57BL/6J小鼠5周，以诱导脂肪变性和炎症环境（图4A）。在5周结束时，自由喂养的小鼠在喂食状态下被处死，而IF（5:2）方案的小鼠在禁食24小时（禁食状态）或禁食24小时后再喂食4小时（喂食状态）后被处死（图4A）。通过这种方式来阐明参与禁食反应和随后的恢复喂食后反应中的关键信号分子途径。 

研究人员首先评估了参与NASH发病和HCC发展的几个关键的促有丝分裂和炎症信号通路。通过免疫印迹发现，相较于自由喂养WD的对照组，AKT、mTOR-S6K/4EBP1、MAPK和NF-kB通路在禁食24小时后显著下调，在重新喂食4小时后再次上调（图S6A-B）。由于所有被评估的潜在促有丝分裂和炎症通路在禁食反应期间均受到抑制，这表明禁食广泛地影响多种促生长和炎症通路。以上结果能够部分解释NASH禁食治疗过程中表现出的积极作用，特别是因为在长期（32周）NASH实验过程中，每个禁食周期都会以重复的方式抑制这些途径。 

为了更好地阐明高热量喂养过程中调控禁食反应的关键信号网络，研究人员对自由进食、IF（5:2）禁食和IF（5:2）禁食后重新喂食的小鼠的肝脏匀浆后进行蛋白质组学研究（图4B）。主成分分析显示，IF（5:2）禁食组和IF（5:2）重新喂食组分别与自由进食组明显区分开（图S6C）。无监督的层次聚类也证实了这一点，在自由进食、IF（5:2）禁食或IF（5:2）恢复进食状态下各自调节了不同的蛋白质组（图4C）。对禁食状态下处死的IF（5:2）小鼠和自由进食状态下处死的IF（5:2）小鼠之间的差异表达蛋白进行分析，发现若干个已知的禁食反应蛋白在两组之间发生了显著变化（图4D）。糖异生关键酶（PCK1和VNN1）、参与脂肪酸氧化的酶（CYP4A10、CYP4A14、ACOT2、CROT）和酮体生成的限速酶（HMGCS2）在禁食期间均显著上调，而参与脂肪从头合成的关键酶（FASN和SCD1）在禁食期间显著下调（图4D）。这与先前在正常饮食条件下进行的观察结果一致，也与我们通过间接测热法进行的全身代谢分析一致，表明在禁食反应期间脂肪酸氧化和酮体生成增加，血清酮体β-羟丁酸升高（图2E-G）。 

为了确定这种禁食表型是否仅限于蛋白质组的一个子集还是更普遍地适用于不同的通路，研究人员进行了基因集富集分析（GSEA），将禁食状态下的IF（5:2）小鼠与自由进食状态下的小鼠进行比较。与自由饮食的对照组相比，GSEA显示KEGG脂肪酸代谢和KEGG PPAR信号通路在禁食小鼠中显著富集，HALLMARK MTORC1信号和HALLMARK糖酵解信号通路下调（图4E、图S6D）。IPA分析证实脂肪酸氧化，酮体生成和PPARα/视黄醇X受体α（RXRα）活化发生富集（图4F）（小编注：Ingenuity Pathway Analysis（IPA）是一种基于云计算的生物信息学工具，它利用Ingenuity Knowledge Base数据库进行基因表达、miRNA、SNP微阵列、代谢组学、蛋白质组学和RNA-seq等实验数据的分析和整合。IPA的功能十分广泛，包括典型通路分析、疾病与功能分析、上游调控因子分析、调控效应分析和分子网络分析等。该工具能够对每个通路赋予一个Z值，用以表示通路的激活或抑制状态，Z值大于2表示显著激活的通路，小于-2则表示显著抑制的通路）。此外通过IPA寻找上游调节因子，发现PPARα是高热量喂养期间禁食反应的中心调节因子（图4G）。（小编注：IPA提供了因果网络分析（Causal Network Analysis），能够综合鉴定控制基因表达的上游分子，以及与数据组靶点相关联的调节因子网络。Comparison Analysis功能可以快速显示经典信号通路分值随不同条件变化的趋势，因此可以通过IPA进行上游调控因子分析，预测可能引起基因表达变化的上游分子，包括miRNA和转录因子），这与之前在正常饮食条件下的报道一致（小编注：PPARα在禁食反应中扮演着重要角色，特别是在调节脂肪酸氧化和适应性禁食反应中起着关键作用。研究表明，当机体处于营养缺乏状态时，PPARα能够促进脂肪酸氧化相关基因的表达，从而促进脂肪酸氧化以满足机体的能量需求并维持肝脏脂代谢稳态.）当PPARα与禁食诱导的脂肪组织脂解分泌到血液中的游离脂肪酸结合后，PPARα与RXRα结合发生异二聚体化并与靶基因启动子中的PPAR反应元件（PPREs）结合，PPARα/RXRα异二聚体招募共激活因子并诱导转录程序，包括脂肪酸氧化。研究人员进一步分析喂食、禁食和再喂食状态下血清非酯化脂肪酸（NEFA）水平，发现IF（5:2）小鼠在禁食状态下NEFA水平显著升高，而在再喂食状态下水平迅速下降，说明NEFA在禁食和再喂食过程中是动态变化的（图4H）。然而，禁食反应不仅仅是由PPARα调控的，而是涉及多种转录因子和激素的复杂相互作用，如糖皮质激素（GCs）和糖皮质激素受体（GR）信号传导，都在禁食反应中至关重要。近期相关研究表明，在正常的稳态条件下，需要GR轴和PPARα信号协同作用（小编注：在禁食状态下，巨噬细胞的GR抑制肿瘤坏死因子(TNF)的表达，促进肝细胞GR的核易位，激活肝细胞中由GR和过氧化物增殖因子激活受体α(PPARα)共同诱导的脂肪氧化/生酮相关基因程序）才能在禁食期间充分激活转录程序。因此研究人员进一步评估了在禁食期间除了血清NEFAs增加外血清GCs是否增加。与自由进食的小鼠相比，禁食的IF（5:2）小鼠血清皮质酮水平升高（图4I）。皮质酮是肝细胞中GRs的天然配体，与皮质酮结合后，GR转位到细胞核，激活涉及脂肪酸氧化、线粒体生物合成和糖异生的转录程序。研究人员试图探究在禁食反应过程中，PPARα和GR的靶基因是否被激活。研究发现包括Pdk4，Fkbp5和Mt2a在内的经典PPARα和GR靶基因在禁食期间显著增加，并在恢复摄食后迅速下降（图4J-K）。并且与自由进食小鼠相比，在禁食状态下IF（5:2）小鼠中参与脂肪酸氧化、糖异生和线粒体生物发生的基因表达显著增加（图4L-M）。此外在禁食期间，脂肪生成基因如Acaca和Fasn的表达显著降低，在重新喂食后，这种现象则被逆转（图4N）。 

由于PPARα作用靶点和PCK1在禁食期间显著上调，需进一步确定它们的表达是否在NASH期间受到抑制。免疫印迹显示小鼠NASH样本中PPARα靶基因PDK4和PCK1水平与正常饮食条件下的对照相比显著降低（图4O）。根据肥胖患者的NAS（肝损害严重程度）对其肝脏样本进行分析，在人样本上进一步印证。与无肝脏病变的肥胖患者（NAS=0）相比，NASH患者（NAS≥5）的PDK4和PCK1蛋白表达显著降低（图4P），这在NASH小鼠和人肝组织的mRNA表达水平保持一致（图S6E-F）。这突出了在不同物种中，禁食和NASH条件下，PPARα靶点和PCK1的对比性调控。

5. 代谢组学证实在NASH中脂肪酸氧化和酮体生成在禁食期间被高度激活

异常的代谢环境在NASH发病机制中起着重要作用。为了确定IF是否也影响慢性高热量喂养小鼠中的代谢组，研究人员对WD喂养下的自由饮食、IF（5:2）禁食和IF（5:2）恢复进食的小鼠的肝脏匀浆后进行了代谢组学分析（图S7A）。主成分分析显示三组之间有明显的聚类，其中IF（5:2）禁食组显示出最大的分离（图S7B）（小编注：极性代谢物和非极性代谢物在生物体内具有不同的功能和作用。极性代谢物通常指那些具有极性基团，如羟基、羧基或氨基等，它们在生物体内的溶解性和溶解度较高，容易在水相中移动和反应。这类代谢物通常参与细胞内的多种生化反应，如能量代谢、信号转导等，因此，发挥代谢功能的大多数极性代谢物。而非极性代谢物则通常指那些分子中电荷分布均匀，分子里正负电荷中心重合的分子，如烷烃类分子、CO2、CH4等 。它们在生物体内也参与细胞膜的构建、作为信号分子或在细胞间通讯中发挥作用）。无监督层次聚类在57个化合物中确定了20个极性代谢物在不同营养状态下显著变化（图S7C）。禁食诱导了肝脏酮体3-羟基丁酸的显著增加和葡萄糖及乳酸的减少，而在重新进食过程中则大多被逆转，表明禁食状态下生酮作用增强，糖酵解则被抑制（图S7D-E）。禁食期间AMP和鸟苷酸（GMP）水平升高表明机体处于低能量状态（图S7E）。而抗氧化相关化合物，如牛磺酸（小编注：牛磺酸是一种含硫的β氨基酸，它在动物机体组织中含量丰富，具有抗氧化和抗炎等特性，对于维持机体稳态具有重要作用。研究表明，牛磺酸可以帮助缓解由氧化应激引起的组织损伤，恢复抗氧化关键基因的表达，有效抑制氧化应激并显著缓解肠道屏障的损伤。此外，牛磺酸在各种毒理学模型中显示出保护作用，例如通过维持线粒体的最佳状态来控制自由基的产生，以及通过影响线粒体形态和减少线粒体超氧化物的产生来减轻肌肉损伤。牛磺酸还被认为是一种细胞保护分子，因为它能够维持正常的电子传递链、维持谷胱甘肽储存、上调抗氧化反应、增加膜稳定性、消除炎症和防止钙积累。丙氨酸是一种非必需氨基酸，有研究表明β-丙氨酸可能通过影响牛磺酸的细胞水平而影响线粒体功能，导致线粒体超氧化物蓄积和呼吸功能降低。这表明牛磺酸和丙氨酸可能在细胞代谢具有抗氧化功能。）、谷胱甘肽、NADP⁺和β-丙氨酸，在禁食与再进食期间增加，表明抗氧化机制在饥饿和恢复进食循环期间启动（小编注：禁食期间，细胞增加对氨基酸的利用效率，包括合成谷胱甘肽所需的氨基酸。而在进食后，氨基酸的可用性增加，促进了谷胱甘肽的合成。所以禁食后谷胱甘肽降低，恢复进食后谷胱甘肽增加。同时在禁食期间，牛磺酸合成过程中的关键酶半胱氨酸双加氧酶（CDO，CDO将半胱氨酸转化为亚牛磺酸，亚牛磺酸在半胱氨酸亚磺酸脱羧酶（CSAD）催化下转化为牛磺酸）表达量显著增加，促进牛磺酸的合成。而在refed后半胱氨酸双加氧酶回复正常水平，因此牛磺酸水平也随之降低，所以fast期间牛磺酸增加抗氧化能力增强，refed期间谷胱甘肽增加抗氧化能力增强，所以表明抗氧化机制在饥饿和恢复进食循环期间启动。）（图S7F），但是只有在恢复饮食组中谷胱甘肽显著增加。恢复饮食组动物的葡萄糖水平没有达到与正常饮食方案相同的水平，这可能是由β-丙氨酸诱导的细胞中葡萄糖摄取增加的结果（小编注：图S7E中与fed条件下的葡萄糖的水平相比refed条件下葡萄糖含量降低，可能是refed期间β-丙氨酸含量增加，使得葡萄糖的摄取和利用增加，所以检测到的葡糖糖水平低于fed）。通路分析显示，在禁食期间，糖酵解，Warburg效应和丙酮酸代谢受阻，而脂肪酸代谢，胆汁酸稳态，牛磺酸/亚牛磺酸代谢显著富集（小编注：牛磺酸是一种含硫氨基酸，在人体内发挥着多种生物学功能，包括抗氧化、调节细胞信号传导等。然而，牛磺酸通路与禁食或进食的直接关联文献中并没有明确的描述。间歇性禁食作为一种饮食模式，已被研究其对健康、衰老和疾病的影响。禁食和进食周期与细胞的代谢活动紧密相关，影响着生物能量传感器的水平波动，进而激活下游蛋白，调节细胞功能和应激抵抗。例如，禁食期间AMP与ATP的比例增加，激活AMPK，触发系统修复和合成代谢受阻。此外，禁食还可能影响酮体的水平，酮体不仅是能量来源，还是重要的信号分子，影响细胞和器官功能。尽管牛磺酸通路与禁食/进食的直接文献的报道尚未明确，但考虑到牛磺酸在细胞信号传导中的作用，以及禁食/进食对细胞代谢和信号通路的影响，我们可以推测牛磺酸可能在禁食或进食期间通过影响相关信号通路参与细胞的代谢调节和应激反应。）（图S7G）。相反，这些通路许多都在再进食过程中被逆转（图S7H）（小编注：在S7G和S7H中标识的蓝色通路表示是被抑制的通路，而红色标识的通路则是被富集的通路；以fatty acid metabolism通路为例，S7G中展示的是正常饮食和禁食两个条件下存在显著差异的通路，表明在禁食条件下fatty acid metabolism通路显著富集，而在S7H中展示的是禁食和禁食后再进食两个条件下存在显著差异的通路，表明在再进食条件下fatty acid metabolism通路又被抑制；说明在正常饮食到禁食再到再进食的过程中，fatty acid metabolism先被富集后又被抑制即发生了逆转)。将以上结果在晚期NASH中也进行了验证，研究人员在WD喂养5个月后实施IF（5:2）方案，随后在9个月时对喂养、禁食和再喂养状态下的肝脏匀浆进行代谢组学分析（图S7I），验证了禁食和再进食反应具有高度保守性，在5周和9个月的WD喂养期之间表现出相似的反应模式（图S7J-K），包括脂肪酸诱导的酮体生成的激活（3-羟基丁酸的增加）和糖酵解的下调（乳酸的减少），而抗氧化相关的代谢物在禁食或恢复进食期间上调（小编注：本文发现抗氧化相关的代谢物在禁食与再进食期间都会增加，但是不呈现完全一致的趋势，牛磺酸、NADP⁺主要在禁食期间增加，谷胱甘肽、丙氨酸主要在再进食期间增加）（图S7J-K）。以上结果强调了禁食及恢复进食循环诱导的代谢转变，促进IF对抗NASH的有益机制的进一步阐明。

6. 体内动态氟脱氧葡萄糖（[¹⁸F] FDG）-PET揭示禁食诱导的糖代谢适应性

为了评估禁食对体内肝脏糖代谢的影响，对自由进食、IF（5:2）禁食和IF（5:2）恢复进食的WD喂养32周的小鼠进行（[¹⁸F] FDG）-PET动态扫描（小编注：18F-FDG是氟代脱氧葡萄糖（18F-flurodeoxyglucose）的简写，是一种放射性核素标记的葡萄糖类似物，因其可准确反映体内器官/组织的葡萄糖代谢水平，目前作为PET-CT和PET-MR显像的主要显像剂，被誉为“世纪分子”），其中最后12周实施IF（5:2）方案。最后将[¹⁸F] FDG注射到自由进食的小鼠或禁食24h或禁食24h后再进食4h的小鼠体内。

        时间-活性曲线显示，禁食24h后，肝脏[¹⁸F] FDG摄取显著增强，脑[¹⁸F] FDG摄取也显著增强（图S8A-D）。这符合禁食期间酮体被利用后葡萄糖作为大脑燃料来源的要求。相反，肌肉中[18F] FDG的摄取量在恢复进食后显著升高（图S8E-F）。重要的是，[¹⁸F] FDG在恢复进食状态下的摄取增强并不是简单地由血糖水平的差异产生的影响，因为在注射[¹⁸F] FDG之前，WD自由喂养和IF（5:2）恢复进食小鼠的血糖水平相当（图S8G）。表明在IF（5:2）方案中，骨骼肌中胰岛素诱导的葡萄糖摄取增强；同时也表明在人类中，IF可以改善葡萄糖稳态和胰岛素敏感性，这与先前报道一致。

        （[¹⁸F] FDG）-PET对肝脏葡萄糖代谢的定量比其他组织更为复杂，因为肝细胞可以通过葡萄糖-6磷酸酶活性对[¹⁸F] FDG/葡萄糖进行磷酸化和去磷酸化修饰。此外，示踪剂能够通过肝动脉和肝门静脉的双重血供分布到肝脏。因此，研究人员简化了加尔巴里诺等开发的利用肠道示踪剂浓度来计算门静脉输入效率的分室建模方法（S8H）。与自由喂养的对照组相比，禁食24小时后，IF（5:2）小鼠的交换速率常数kfm（代表肝脏中[¹⁸F] FDG从代谢/磷酸化区室（Cm）到自由区室（Cf）更低（小编注：Cm代表肝脏中的磷酸化FDG池。在这个模型中，CM指的是FDG被肝细胞摄取后，被磷酸化为FDG-6-磷酸（FDG-6P），这是一种代谢化形式的FDG。这种形式的FDG通常被认为是在组织中“捕获”或“困住”的，因为它已经参与到了组织的代谢中，不容易从细胞中释放出来。CF代表肝脏中的自由或非代谢化FDG池。CF指的是还没有被磷酸化的FDG，它可以在血液中自由流动，并且可以被肝细胞摄取或释放。）（图S8I）。逆速率常数kmf（Cf~Cm）在各组间无显著变化（图S8J）。

       以上数据表明24小时禁食期影响肝脏葡萄糖代谢，特别是通过抑制磷酸化[¹⁸F] FDG从肝细胞外流。在蛋白质组学分析中，发现葡萄糖-6-磷酸酶表达没有下调，这与禁食诱导的PPARα或PCK-1介导的糖异生激活保持一致（图4）。IF组的血糖水平显著降低，因此较高的胰岛素水平也可以作为影响葡萄糖-6-磷酸酶的表达和kfm降低的无关因素排除（图S8G）。[¹⁸F] FDG需要与糖异生产生的葡萄糖量竞争葡萄糖-6-磷酸酶的磷酸酶活性，最有可能导致[¹⁸F] FDG从肝细胞向游离腔室的外排率（kfm）低于未禁食组。因此，对（[¹⁸F] FDG）-PET数据进行分室建模可能是一种通过禁食方案诱导肝脏糖异生的非侵入性评估方法。

7. 只有在活跃期（7p.m.-7p.m.）开始的禁食才能强烈地诱导糖皮质激素信号和PCK1的表达

为了深入探究禁食在活跃期（7p.m.-7p.m.）或非活跃期（7a.m.-7a.m.）不同阶段开始的分子差异以及NEFA诱导的PPARα活化和糖皮质激素信号的作用，C57BL/6J小鼠在自由进食或IF（5:2）方案下喂养5周（图5A）。将IF（5:2）小鼠分为非活跃期（7a.m.-7a.m.）禁食和活跃期（7p.m.-7p.m.）禁食。5周后，在进食状态下处死自由进食小鼠，IF（5:2）小鼠禁食24小时后处死（图5A）。在非活跃期开始禁食的IF（5:2）小鼠在7a.m.被处死，而在活跃期开始禁食的小鼠则在7p.m.处死。同样，由于已知的昼夜节律对肝脏基因表达模式的影响，将在7a.m.或7p.m.处死自由摄食的小鼠。

与各自的自由饮食组相比，无论禁食的时间如何，禁食小鼠都具有显著降低的血糖水平（图S9A）。与各自的自由进食组相比，两个禁食组的血清酮体β-羟丁酸水平均明显高于各自的自由进食组，但在活跃期开始禁食的小鼠血清酮体β-羟基丁酸水平升高更为明显（图5B）。与非活跃期相比，在活跃期开始禁食的小鼠，β-羟基丁酸的绝对水平相对于各自自由进食组的倍数变化明显更高（图5B）。并且两个禁食组的血清NEFA水平与各自的自由进食组相比都有类似的增加，但在活跃期开始禁食的小鼠血清皮质酮水平明显更高（图5C-D），这表明活跃期开始禁食时糖皮质激素信号反应更明显。

随后研究人员评估了这些禁食方案在转录水平上对肝脏禁食反应的影响。考虑到有不同的解剖时间，研究人员首先探究了解剖时间如何影响WD喂养时肝脏中关键昼夜节律基因的表达。有研究表明慢性时差（小编注：慢性时差，也称为慢性昼夜节律失调，是指当个体的生物钟与外部环境的光照周期不同步时所产生的一种状态。）或关键昼夜节律基因的缺失，包括Bmal1、周期或隐花色素，被证明会加速小鼠肝癌的发生。CLOCK和BMAL1（小编注：CLOCK，全称为Circadian Locomoter Output Kaput，是一种基本螺旋-环-螺旋（bHLH）结构域转录因子，BMAL1，全称为Brain and Muscle Arnt-like 1，也称为Arntl或Mop3，同样是一种bHLH/PAS结构域转录因子。CLOCK蛋白可以与BMAL1形成异二聚体，进而激活下游基因的转录，这些基因参与调控睡眠-觉醒周期、代谢、免疫等多种生理过程 。BMAL1与CLOCK形成异二聚体后，能够结合并激活带有E-box元件的基因的转录。这种异源二聚体是生物钟转录/翻译反馈回路的核心，通过激活Per和Cry基因的表达，形成负向反馈环路，从而调节昼夜节律 ）作为异源二聚体，其下游靶基因包括Per1/Per2和Cry1/Cry2，能够作为CLOCK/BMAL1的抑制因子。研究表明Clock和Bmal1的表达水平与肝脏中Per1和Per2以及Cry1和Cry2的水平呈反比。此外，Clock和Bmal1的表达在ZT=0时开灯时最高，在ZT=12时关灯时最低。因为高脂喂养可能会破坏小鼠的昼夜节律，使得研究进一步复杂化。研究人员首先评估Clock和Bmal1的表达情况。无论是否处于进食或禁食状态，与下午7时（ZT=12）处死的小鼠相比，Clock和Bmal1的表达水平在上午7点（ZT=0）处死的小鼠中最高（图5E，图S9B）。相反，无论它们是否处于摄食或禁食状态，与上午7时（ZT = 0）处死的小鼠相比，在下午7点（ZT=12）处死的小鼠中，Per1和Cry2的表达量最高（图S9B）。以上数据表明，解剖时间而不是喂养方式影响了关键节律基因的表达。 

研究人员继续研究了脂肪酸氧化或糖皮质激素信号传导中的关键基因是否在不同的禁食方案之间存在差异调节。两种禁食方案对脂肪酸氧化基因（Cyp4a10和Cyp4a14）的诱导作用相似（图5F）。与上午7时（ZT = 0）相比，脂肪合成关键基因（Acaca和Fasn）在下午7时（ZT = 12）表达量降低；然而，无论何种禁食治疗方案都引起了Acaca和表达的显著抑制，这与禁食的方式无关（图S9C）。在活跃期开始的禁食中，糖皮质激素靶基因（Fkbp5和Mt2a）的表达显著升高（图5G），与皮质酮升高水平相一致。因为AMPK激活对NASH发病具有保护作用（小编注：在NASH肝损伤的过程中，首先启动子caspase与促凋亡信号紧密结合，通过外源性和内源性通路剪切并激活下游效应器caspase-3,7，进一步激活caspase-6，活性 caspase-6 反过来切割 Bid 以增加前馈环中线粒体细胞色素 c 的释放，形成半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶促凋亡的级联反应；在代谢健康的肝脏中，AMPK活性得以维持，以允许procaspase-6磷酸化，从而抑制其激活，从而阻止这种前馈回路；当 AMPK 活性因营养过剩、高血糖、高胰岛素血症以及肥胖、糖尿病和 NAFL的炎症而降低时，caspase-6被抑制，导致前馈环激活，为半胱天冬酶介导的细胞凋亡启动肝细胞凋亡），所以在蛋白水平上，活跃期开始的禁食诱导了更高的PCK1表达和pAMPKT172/AMPK比值（图5H-I）。pAktS473/Akt比值的降低在两种禁食方案之间没有显著差异（图5H-I）。与之前的报道一致，在PPARα表达中观察到昼夜节律调节，无论进食/禁食状态如何，PPARα表达在下午7时（ZT = 12）达到峰值（图5H-I）。在活跃期开始禁食的小鼠中，PDK4的表达也显著升高，表明活跃期开始禁食诱导了更显著的肝脏反应，包括糖皮质激素信号增强和AMPK的激活（小编注：在活跃期PPARα的表达显著提高，从而影响PDK4的表达变化，并且PDK4也会受到糖皮质激素和胰岛素等调控。PDK4（丙酮酸脱氢酶激酶4）主要在骨骼肌、肝脏、肾脏等具有高度的脂肪酸氧化能力和高表达脂质氧化转录因子PPARα或者PPARγ的组织中高丰度表达，该蛋白位于线粒体基质中,通过磷酸化其亚基来抑制PDC活性,从而调节由葡萄糖和氨基酸氧化产生的丙酮酸转化为乙酰辅酶A,使糖酵解与三羧酸循环 (TCA)保持动态平衡,有助于调节葡萄糖代谢及ATP的生成。）（图5H-I）。

8. 肝细胞特异性敲除GR并不能完全消除肝脏的禁食反应

不同研究人员观察到禁食期间血清GC和肝脏中GR信号传导靶标的显著增加，并探究了GC-GR信号传导在肝脏禁食反应中的作用（图S10A）。研究人员在自由进食或IF（5：2）条件下用WD饲喂肝细胞特异性GR敲除小鼠（Alb-cre x GR^fl/fl-GR^HEP）和对照同窝出生小鼠（GR^fl/fl）5周，并分别在进食或禁食状态下评估它们的指标（图S10B）。研究人员证实了GR^HEP小鼠中GR和PCK1的蛋白表达降低（图S10C和S10D）。剩余的GR表达可能是由于在非实质细胞中的表达，例如肝星状细胞和Kupffer细胞。然而，在GRHEP小鼠中，禁食诱导的典型GR靶基因（Fkbp5和Mt2a）显著降低（图S10E）。禁食小鼠显示出较低的血糖水平和升高的血清酮体β-羟基丁酸（图S10F）。相比于GR^fl/fl，禁食诱导的肝脏脂肪酸氧化基因（如Cyp4a10）的表达显著降低，但在GR^HEP小鼠中并没有完全消除相关基因表达（图S10G）。相反，在GR^HEP小鼠中，禁食诱导的关键线粒体生物发生基因（Ppargc1α）和线粒体生物发生中的限速酶（Pck1）的表达被完全抑制（图S10H和S10I）。GR^HEP小鼠未显示脂肪生成基因的任何改变（图S10J）。GR和PPARα之间存在复杂的互作关系，因此研究人员设计有关实验：GR的缺失是否会影响PPARα或11β-羟基类固醇脱氢酶（Hsd11b1）的表达（小编注：（11β-羟基类固醇脱氢酶是可催化细胞内非活性糖皮质激素转化为生理活性糖皮质激素）。无论进食与禁食状态如何，GR^HEP小鼠中Ppara或Hsd11b1的表达均无显著差异（图S10K）。组织学分析显示，尽管禁食小鼠显示出较低的肝脏甘油三酯和苏丹红染色，与GR状态无关，但禁食GR^HEP小鼠显示出增加的CD8T细胞和F4/80⁺细胞的浸润（图S10L-S10P）。 

总体而言，这些结果表明，肝细胞GR-GC信号调节肝脏禁食反应，但其不是肝脏禁食反应的关键参与者，特别是在禁食诱导的脂肪酸氧化的调节。这与蛋白质组学分析一致，表明PPARα是肝脏禁食反应的关键分子。（小编注：从S10G上来看，关注mRNA的相对表达倍数，尽管在GR敲除后脂肪酸氧化基因表达显著下降，但不论是禁食还是非禁食条件下，与基线相比仍然保持着很高的表达水平，说明GR敲除并不能很好地抑制相关基因的表达。）

9. Ppara和Pck1联合敲降显著抑制了禁食反应

基础（普通饮食）状态下的肝脏禁食反应涉及复杂的激素和转录网络。研究人员发现在NASH禁食小鼠中血清NEFAs和GCs升高，随后激活肝脏PPARα和GR信号（图4、图6A）。为了确定它们的因果作用，研究人员使用腺相关病毒载体（AAV8）单独或共同敲降Ppara或Pck1，然后在自由饮食或以IF（5:2）方案喂养WD小鼠5周。小鼠在禁食状态处死（图6B-C）。 

研究人员在mRNA和蛋白水平证实Ppara或Pck1被敲降（图S11A-C）。并且只有在禁食状态下，Pck1降低后，Ppara的表达才下调，而Ppara的敲降对Pck1的表达没有影响（图S11A-C）。然而，当敲降Ppara和Pck1时，全身性的禁食反应（血糖及血清NEFA）保持不变（图6D、图S11D），而禁食诱导的血清酮体β-羟丁酸升高在Ppara或Pck1缺失时显著降低（图6D）。此外，与脂肪酸氧化和酮体生成相关的基因的表达显著抑制，特别是两个基因联合敲降的情况下变化更显著（图6E-F、图S11E），这也支持了先前的研究结果，即肝细胞特异性敲降Ppara消除了禁食诱导的关键脂肪酸合成（如Cyp4a14）和生酮基因（如Hmgcs2）的上调。单独敲降Pck1阻止了禁食诱导的线粒体生物合成关键酶Ppargc1a的表达，表明PPARα和PCK1的基因调控存在差异（图6F）。相反，禁食诱导的肝脏糖异生关键激活剂Vnn1的上调只在Ppara缺失的情况下被抑制（图S11F），而禁食诱导的脂肪从头合成相关基因（如Fasn）的抑制则不受影响Ppara和Pck1敲降的影响。 

随后研究人员对肝脏进行RNA测序，研究Ppara或Pck1的敲降对禁食反应更广泛的影响。研究人员首先关注Ppara/Pck1联合敲降对禁食反应的影响（图6G）。PCA显示明显的组群分离（图S11），GSEA显示相比自由饮食Scr组，IF（5:2）方案组PPAR信号和脂肪酸代谢信号通路显著富集。与Scr相比，在IF（5:2）小鼠禁食的情况下进行联合敲降消除了这种富集（图S11I），同时显示出与炎症和纤维化相关的通路的显著富集（图6H，图S11J）。在禁食状态下单独敲降Ppara或Pck1显示出相似的转录组谱，伴随着脂肪酸代谢通路的下调以及炎症和纤维化特征的富集（图S11K-M）。 

此外，研究人员还研究了Ppara或Pck1敲降对调控肝脏糖皮质激素产生的GR和Hsd11b1表达的影响。转录组学分析显示，Ppara敲降不影响禁食后肝脏GR的表达，但Hsd11b1的表达增加（图S11N），这与之前PPARα能够抑制Hsd11b1表达的报道一致。在禁食状态下敲降Pck1显著降低了Ppara、Nr3c1和Hsd11b1的表达（图S11N），表明其影响范围更广。以上结果表明，Ppara或Pck1的缺失不仅消除了转录方面的禁食反应，而且加剧了肝脏病变，更能突出它们在介导肝脏禁食反应和维持肝脏稳态中的重要作用。因此，特别是在NASH的情况下，缺乏这些蛋白时禁食可能是有害的。 

为了证实这些发现，研究人员评估了Ppara和Pck1敲降对全身性肥胖和肝脏病变的影响。不论何种基因型，禁食小鼠的体重均降低（图6I、图S12A-B），表明对全身肥胖或代谢没有影响（图6I）。相反，在自由饮食条件下，Pck1单独敲降或与Ppara共同敲降时，作为肝脏损伤标志物的血清ALT急剧增加，并且这种损伤的加剧在接受IF（5:2）方案的小鼠中更显著（图6J）。在禁食的情况下敲降Ppara或Pck1加剧了WD诱导的肝肿大（图S12C-D），这表明敲降肝脏禁食反应的关键分子消除了禁食在NASH中的积极作用。组织病理学分析显示，在禁食的情况下，Pck1和Ppara敲降在一定程度上显著加重了WD诱导的炎症浸润和纤维化，证实了转录组学的结果（图6K-M、图S12E-F）。随后研究人员探究了在禁食期间敲降Pck1导致肝脏损伤增加的潜在机制。最近的研究表明，在自由饮食条件下，肝细胞特异性Pck1缺失通过上调Rho-GTP酶和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt/血小板衍生生长因子（PDGF）轴导致肝星状细胞活化，从而加剧WD诱导的炎症和纤维化。因此研究人员探究该转录轴是否也与禁食有关。在PCK1被激活的条件下（如禁食时），PCK1利用鸟苷三磷酸（GTP）将草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸（图S12G）。GTP的减少阻止了Rho-GTP酶和随后的Akt/PDGF轴的激活（图S12G）。对喂养WD 5周和9月的小鼠的代谢组学分析表明，禁食诱导GMP水平显著增加（图S7K），从而导致反应性Rho-GTP酶效应物的下调（图6N）。反应性Rho-GTP酶效应物在禁食期间Pck1敲降后显著富集（图6N）。重要的是，接受IF（5:2）方案小鼠敲降Pck1，pAkt^S473/Akt比值显著增加，PDGFRβ和Desmin染色（小编注：在静止的肝星状细胞中主要表达PDGFRα，活化的肝星状细胞表面PDGFRβ表达水平上升，而desmin可以标记肝星状细胞）显著增强，表明肝星状细胞被激活（图6O-U）。以上数据表明，在IF（5:2）方案的背景下敲降Pck1也会导致Rho-GTP酶信号增加，随后激活Akt/PDGF轴和肝星状细胞（图S12G）。总之，敲降禁食反应的肝脏执行者Ppara和Pck1，不仅消除了禁食诱导的肝脏转录轴，而且加剧肝脏病变，但不影响全身性肥胖或代谢参数。

RHO-GTP酶-cAkt/PDGF轴        RHO-GTP酶-AKT/PDGF轴中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1（PCK1）是糖异生途径第一步限速酶，催化草酰乙酸（Oxaloacetate, OAA）生成磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate, PEP）。已有研究发现PCK1参与调控磷酸戊糖途径、己糖胺生物合成和甘油合成等重要的代谢过程。PCK1缺乏通过增强己糖胺生物合成途径促进肝细胞癌进展。然而，PCK1 不仅通过激活甾醇调节元件结合蛋白调节葡萄糖稳态来调节脂肪生成缺乏 PCK1 功能的患者表现为弥漫性肝大脂肪变性，伴有低血糖和高乳酸血症。同样，Pck1表达降低的小鼠会出现胰岛素抵抗，低血糖和肝脂肪变性，表明PCK1在调节葡萄糖稳态和脂质代谢中的重要作用。 磷酸肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B （PI3K/ATK） 通路在调节细胞生长和代谢中起着关键作用。该途径在胰岛素、生长因子、能量和细胞因子的作用下被激活，进而调节关键代谢过程，如葡萄糖和脂质代谢以及蛋白质合成。AKT主要通过激活甾醇调节元件结合蛋白来促进从头脂肪生成。PI3K/AKT 失调会导致多种病理性代谢疾病，包括肥胖和 2 型糖尿病。 大多数 Rho GTP 酶在活性 GTP 结合型和非活性 GDP 结合型之间循环，这一过程受鸟嘌呤核苷酸交换因子、GTP 酶激活蛋白和鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂的调节。当细胞内GTP浓度高时，鸟嘌呤核苷酸交换因子可以通过催化GDP与GTP的交换来激活Rho GTP酶。Rho-GTPase 家族的几个成员，如 Rac1、RhoA 和 RhoC，可以通过增加细胞内 GTP 浓度来激活，PCK1 缺陷通过增加细胞内 GTP 水平来激活 RhoA，从而激活下游 PI3K/AKT 通路。

参考文献：[1]Ye Q, Liu Y, Zhang G, et al. Nat Commun. 2023;14(1):1402.

10. PPARα激动剂培马贝特可部分模拟肝脏禁食反应

蛋白质组学和转录组学分析强调了PPARα的激活是肝脏禁食反应的中心环节。因此，研究人员研究了PPARα激动剂培马贝特是否可以模拟禁食诱导的肝脏分子通路（图S13A），而目前还没有可用于激活PCK1的药物。我们用PPARα或对照溶剂处理8周龄C57BL/6J小鼠24 h，并与禁食24 h的小鼠进行比较（图S13B）。虽然禁食降低了体重和血糖水平，但培马贝特并不影响这些机体系统参数（图S13C）。相比之下，培马贝特诱导PPARα靶基因Pdk4的表达程度比禁食更大（图S13D）。尽管与禁食反应的诱导程度不同，培马贝特还诱导了参与脂肪酸氧化的基因（如Cyp4a10）增加（图S13E）。重要的是，培马贝特诱导关键生酮酶Hmgcs2和糖异生酶Vnn1表达的程度与禁食相似（图S13F）。虽然禁食显著抑制脂肪合成代谢，但培马贝特并不影响这些酶的表达（图S13G）。总之以上数据表明，虽然PPARα激动剂部分模拟了肝脏禁食反应，但不足以完全再现这一过程，特别是在诱导脂肪酸分解代谢的同时抑制脂肪酸合成代谢的过程。但以上结果也表明PPARα和GR-PCK1的共同作用介导了肝脏的禁食反应。

11. Pck1单独或联合Ppara过表达可降低WD诱导的小鼠体重增加、肝肿大和肝脂肪变性

单独的培马贝特不足以完全模拟肝脏的禁食反应（图S13 ），而糖皮质激素信号对于介导活跃期禁食的益处至关重要（图5）。因此，研究人员研究了Pck1单独或联合Ppara过表达是否可以保护WD诱导的体重增加和肝脏损伤。研究人员特别关注的是Pck1过表达的影响，因为在禁食期间Pck1敲低表现出明显加重的肝脏损伤（图6）。利用AAV8载体单独或共同过表达Ppara或Pck1（图S14A），同时过表达Gfp作为对照（图S14C-D）。然后在自由喂养这些小鼠5周，并在喂养状态下处死小鼠（图S14B）。Pck1过表达显著降低了WD诱导的体重增加和eWAT质量，Pck1和Ppara的联合过表达表现出相似的表型，但程度较轻（图S14E-G）。Pck1单独过表达或与Ppara共同过表达均表现出更低的肝脏重量和甘油三酯（图S14H-I），各组间血清ALT水平无明显差异（图S14J）。考虑到PCK1在肝脏糖异生中的作用（小编注：磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1（PCK1）在肝脏糖异生过程中扮演着关键角色。PCK1是一种细胞质酶，作为糖异生的限速酶，负责将草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸），研究人员观察到Pck1过表达小鼠的血糖水平显著升高，而血清酮体在不同组之间没有显著差异（图S14K）。同时Pck1过表达也降低了血清NEFA水平，这可能是血糖水平升高和血清皮质酮增加的结果（小编注：当血糖水平提高时，机体会增加对葡萄糖的利用，并减少对中性脂质的利用从而减少中性脂质分解代谢物NEFA的产生）（图S14L）。苏丹红染色结果显示，Pck1过表达显著降低了小鼠肝脏脂肪变性，且苏丹红阳性与肝脏甘油三酯呈显著正相关（图S14M-O）。然而，免疫细胞标记物F4/80和MHCⅡ在不同条件下没有显著差异（图S14M，图S14P-Q）。在分子水平上，Pck1过表达促进PCK1表达和pAMPK^T172增加，p - p65^S536水平显著降低（图S14R-S）。总之，以上数据表明，单独过表达Pck1可以减弱小鼠NAFL的发展。并且与使用培马贝特不同，单独过表达Ppara可能不能激活PPARα。（小编注：禁食的初始阶段，机体靠消耗糖原来维持能量代谢。当糖原耗竭后，糖异生作用逐渐加强，保持血糖水平相对稳定。PCK1通过催化磷酸烯醇丙酮酸（PEP）转化为草酰乙酸（OAA）进而参与到糖异生过程中。因此这里过表达PCK1其实也是在模拟肝脏禁食，探索是否可以通过调控禁食相关下游通路来改善NAFL。） 

12. 在两种不同的NASH-HCC致癌模型中，治疗性间歇性禁食改善了已建立的NASH，并减缓随后的肝癌进展

最后，研究人员研究了IF（5:2）方案在已形成的NASH中的治疗潜力。首先用WD喂养8周龄雄性C57BL/6J小鼠5个月以诱导NASH（图7A）。此时，小鼠被分为体重相匹配的两组（图S15A）。一组给予自由饮食和水，另一组在活跃期（7 p.m.-7 p.m.）开始进行IF（5:2）方案（图7A）。小鼠继续用WD饲养4个月（共9个月）。普通饲料喂养小鼠将作为对照（图7A）。并且所有小鼠都在进食状态下解剖，确保在解剖时禁食的小鼠也处于进食状态与自由对照组保持一致。

结果表明IF（5:2）方案不仅使体重和脂肪重量显著降低，而且与WD喂养的自由对照相比，血清ALT、ALP和胆固醇水平也显著降低（图7B-C，图S15B-E）。此外，一部分（36%）WD喂养的自由饮食小鼠显示出肿瘤病变，而禁食的小鼠没有显示出病变（图7D）。与自由饮食对照组相比，WD自由饮食对照组表现出明显的肝肿大，肝脂肪变性，纤维化和炎症浸润（图7E-7I，图S15F）。并且肝脏重量，纤维化和髓样（MHCⅡ）和淋巴样（CD8）细胞浸润也显著降低（图7E-I，图S15F）。

研究人员进一步在相同实验条件下的CD-HFD模型中检测了IF（5:2）方案是否可以改善NASH（图S15G）。如前所述，经过5个月的CD-HFD喂养诱导NASH后，小鼠被分为体重匹配的两组（图S15H）。然后对其中一组小鼠进行IF（5:2）方案治疗4个月（共9个月）（图S15G）。研究人员发现IF（5:2）方案处理的小鼠体重、血清肝损伤标志物（ALT和ALP）和血清胆固醇与自由饮食CD-HFD对照组相比显著降低（图S15I-N）。此外，接受IF（5:2）方案的小鼠还表现出肝脏重量、肝脏甘油三酯、肝脏脂肪变性和纤维化以及髓样（MHCⅡ）和淋巴样（CD8）细胞浸润的显著降低（图S15O-T）。以上明确表明，IF（5:2）方案改善了在多种NASH肥胖模型中建立的NASH，并强调这可能是对于NASH患者的一种可行的干预措施。 

在明确IF（5:2）方案可以改善已建立的NASH后，研究人员继续研究当以治疗方式实行禁食方案时，该方案是否也可以抑制NASH向HCC转变。为了综合解决这个问题，研究人员再次使用NASH和NASH-HCC的WD和CD-HFD模型（图7J-K）。因此，C57BL/6J小鼠首先被喂养WD（5个月）或CD-HFD（8个月）以诱导NASH（图7J-K）。此时，将小鼠分为体重和血清ALT值相匹配的两组（图S16A-D）。然后小鼠继续自由摄取食物和水或在活跃期（7 p.m.-7 p.m.）进行IF（5:2）方案（图7J-K）。小鼠喂养WD或CD-HFD共15个月，并以普通饲料喂养的小鼠作为对照（图7J-K）。并且所有小鼠都在进食状态下解剖，确保在解剖时禁食的小鼠也处于进食状态与自由对照组保持一致。研究人员的目的是研究真正的自发性NASH-HCC，单独喂养紧密模仿人类病理生理学，而不是使用致癌物（如DEN）或肝脏毒素（CCL4）来加速这一过程，因此实验长达15个月。 

在NASH-HCC的WD和CD-HFD模型中，接受治疗性IF（5:2）方案的小鼠与自由饮食的对照组相比，体重、脂肪重量、血清ALT和胆固醇值显著降低（图7L、7N，图S16E-L）。此外，禁食组小鼠的肝脏重量（WD和CD-HFD饮食组）和肝脏甘油三酯（仅CD -HFD饮食组）也显著低于自由饮食对照组（图S16M-P）。重要的是，在NASH-HCC的WD和CD-HFD模型中，禁食组小鼠不仅显示出较低的肝脏肿瘤发生率，而且肿瘤数量显著低于自由饮食对照组（图7M、7O、7P-U）。在自由饮食的对照组和禁食的小鼠之间没有检测到肿瘤重量的显著差异（图S17）。但禁食小鼠还是显示出显著降低的纤维化和炎症细胞浸润（图7T、7U，图S16Q-Z）。此外研究人员对肝匀浆进行了蛋白质组学分析，以明确在晚期NASH-HCC中，肝脏禁食反应是否保守（图S18A-B）。无监督的层次聚类揭示了在自由进食或禁食条件下，普通饮食和NASH饮食调节了不同蛋白质组（图S18C）。GSEA显示，禁食小鼠显示出脂肪酸代谢和PPARA信号通路富集，以及与纤维化和细胞因子信号传导有关的通路的下调（图S18D）。此外，接受IF（5:2）方案的小鼠与自由进食NASH饮食的对照组相比，Pck1 mRNA表达显著升高（图S18E）。这与禁食小鼠中Rho-GTP酶效应物显著下调相吻合（图S18F）。这表明肝脏的禁食反应在早期NASH甚至晚期NASH-HCC之间是保守的。总之，IF（5:2）方案不仅在治疗性应用时改善了NASH，而且在两种不同的饮食诱导的NASH-HCC模型中，也显著抑制了随后的HCC发展。因此，IF（5:2）方案作为一种有效的NASH干预措施具有重要的治疗价值。

总结

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是一种无过量饮酒史，以肝实质细胞脂肪变性和脂肪堆积为特征的临床病理综合征，并能够向非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化等更严重的形式发展，同时伴有多种并发症和合并症。在NAFLD患者发展到NASH阶段后，一部分NASH患者可以发展为致命的肝细胞癌（HCC）。2024年3月14日，全球首个获批的NASH治疗药物resmetirom上市，是现在市面上唯一一款针对NASH的药物，但目前没有获批药物能够专门针对NAFLD、NASH发展恶化或针对其向HCC转变。最近有研究表明间歇性禁食（IF）或其他形式的饮食干预，如时间限制性饮食（TRF）或模拟禁食饮食（FMD）可以作为肥胖和代谢性疾病治疗的可行性措施。然而是否可以通过基于饮食限制（DR）的方法来治疗NASH相关疾病尚未可知，并且其对NASH产生积极作用的基本细胞分子机制还有待进一步研究。本研究发现IF（5:2）方案可以在不影响总热量摄入的情况下，阻止NASH的发展，并改善已建立的NASH和纤维化。同时也能够抑制NASH-HCC的转变。禁食周期的时间、长度和数量以及NASH饮食类型是决定禁食反应作用的关键参数。并且进一步确定PPARα和糖皮质激素信号诱导的PCK1共同作为禁食反应的肝脏执行者。小鼠活跃期开始的禁食强烈地诱导了糖皮质激素信号和游离脂肪酸诱导的PPARα信号。并进一步验证Pparα和Pck1的联合表达对于NSAH治疗有积极作用。总之，本研究表明IF（5:2）方案对NASH和随后的肝癌是一种有前途的干预措施。