代谢学人

Nature：线粒体内膜消失术

撰文 | 郭诗琪 李姿萱 刘梓棋 郭钰涵 周文豪 邱瑾

编辑 | 孟美瑶

校对 | 李姿萱

背景介绍

  机体主要通过协调一些质量控制途径来调控线粒体稳态，比如通过线粒体自噬和线粒体胞吐等过程清除整个细胞器；通过膜分选途径来选择性去除线粒体衍生的囊泡(Mitochondria-Derived Vesicles, MDVs)、线粒体衍生的携带受损蛋白质的区室(Mitochondria-Derived Compartments, MDCs)；在受到微生物感染时去除受损的线粒体外膜；以及去除MDV与溶酶体融合衍生的细胞器来维持线粒体的稳态。

  传统的线粒体观点认为，整个细胞器上的膜电位是相同的，膜去极化会导致线粒体自噬从而清除受损的线粒体。然而，近期有研究证明，线粒体的每个嵴都是一个独立的、高度动态的结构和功能单位，相邻的嵴有着各自不同的。线粒体内膜(Inner Mitochondrial Membrane, IMM)被进一步划分为与线粒体外膜(Outer Mitochondrial Membrane, OMM)平行的内界膜(Inner Boundary Membrane ,IBM)，以及由IMM内陷形成的嵴。嵴连接处将嵴与IBM分开，形成了专门的区室，这些区室中含有氧化磷酸化产生ATP所需的复合物。当线粒体受到损伤时，分区化可以防止损伤从一条嵴扩散到IMM的其余部分。然而，如果受损的IMM和健康的IMM在线粒体融合过程中混合，或者受损的嵴产生的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)损伤了线粒体DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)，那么这种局部损伤仍然可能导致线粒体功能障碍。因此，为了探究是否存在某种机制能够选择性地调控清除IMM的受损部分，而不损伤整个线粒体，研究人员通过超分辨率显微镜探究线粒体质检过程，发现在细胞质中含有被溶酶体包裹的衍生于IMM的囊泡(Vesicles Derived From the IMM, VDIM)。从机制上讲，这些囊泡是由IMM通过OMM上的电压门控阴离子通道(Voltage-gated Anion Channel, VDAC)向线粒体外突出而形成，经内体分选复合体(ESCRT)转运后，以类似微自噬的方式被溶酶体吞噬。本研究表明，IMM的区室化可以选择性清除受损的IMM，从而实现线粒体内的质量控制。

拓展阅读

线粒体稳态的质量控制

(1)最经典的线粒体稳态质量控制是通过线粒体自噬来完成的，当由于外界压力或者是线粒体Ros产生导致线粒体发生损伤，动力蛋白相关蛋白1(Dynamin-Related protein 1, Drp1)会与线粒体分裂因子(Mitochondrial Fission Factor, MFF)结合，直接促进线粒体受损部分分裂出去，通过线粒体自噬清除。当细胞暴露于轻度的应激源（比如使用低剂量的线粒体解偶联剂CCCP处理细胞时）时，细胞中的马达蛋白也可以通过驱动蛋白家族5B(Kinesin Family Member 5B, KIF5B)选择性地结合受损的线粒体，并将线粒体拉到质膜上来介导线粒体胞吐，在质膜上的肌球蛋白XIX(Myosin19)Myo19将线粒体拴在与质膜紧密相关的皮质肌动蛋白上。最后，与皮质肌动蛋白结合的管状线粒体尖端经历Drp1介导的分裂，然后被送出细胞外。

(2)线粒体呼吸依赖于电子传递，这是一个重要但危险的过程，因为它导致ROS的产生，当线粒体出现过量ROS时，线粒体可以通过产生MDVs来清除线粒体中氧化损伤的蛋白质和脂质，产生MDVs不依赖于Drp1，产生的MDVs可以直接靶向溶酶体，并且该过程独立于线粒体自噬途径。

(3)酵母细胞在复制衰老的过程中，线粒体会出现损伤，此时线粒体会择性地从线粒体内膜和外膜中去除一部分膜蛋白，同时保持细胞器的其余部分完好无损。通过分选到线粒体衍生的区室（MDC）中，该过程依赖于线粒体外膜蛋白TOM70，TOM71，不同于MDV的形成，MDC主要在衰老应激情况下产生，不会由氧化应激触发形成。

(4)当细胞受到弓形虫感染时，弓形虫上会通过其寄生虫效应蛋白(Toxoplasma gondii mitochondrial association factor 1,TgMAF1)会与线粒体上的线粒体外膜蛋白TOM70和线粒体分选与组装机制蛋白50(Sorting and Assembly Machinery 50, SAM50)相互作用，促使线粒体会脱落线粒体外膜(shed large structures positive for OMM, SPOTs), SPOT是由线粒体外膜组成的大的球形和椭圆形结构，SPOT结构中还富含线粒体融合相关蛋白MFN1和MFN2，线粒体上的MFN1和MFN2可以介导线粒体吸收脂肪酸来竞争营养成分，对抗弓形虫感染，而形成SPOT结构会减少线粒体对弓形虫的营养防御，也会导致细胞内线粒体耗竭。

(5)在肝细胞去分化的过程中，细胞中会形成一种线粒体-溶酶体相关的细胞器(Mitochondria-Lysosome-Related Organelle, MLRO)，MLRO的形成独立于线粒体自噬，并且也不依赖PARKIN、自噬相关蛋白5(Autophagy Related 5, ATG5)和Drp1等线粒体自噬相关分子，主要是由源自于线粒体的囊泡（MDV）与溶酶体融合形成的，该过程受转录因子EB（TFEB）负调控，并与线粒体蛋白降解和肝细胞去分化相关。

参考文献：

[1] Soubannier, V. et al. A vesicular transport pathway shuttles cargo from mitochondria to lysosomes. Curr. Biol. 22, 135–141 (2012).

[2] Li, X. et al. Mitochondria shed their outer membrane in response to infection-induced stress. Science 375, eabi4343 (2022).

[3] Jiao, H. et al. Mitocytosis, a migrasome-mediated mitochondrial quality-control process. Cell 184, 2896–2910 (2021).

[4] Ma X, Manley S, Qian H, et al. Mitochondria-lysosome-related organelles mediate mitochondrial clearance during cellular dedifferentiation. Cell Rep. 2023;42(10):113291.

敲黑板啦!

1. 细胞处于稳态时生成VDIM

2. VDIM可调节线粒体质量控制过程

3. 线粒体与溶酶体相互作用生成VDIM

4. ESCRT诱导微自噬导致VDIM形成

研究结果

1、细胞处于稳态时生成VDIM

为研究不同的线粒体区室，研究人员用线粒体染料壬基吖啶橙(Nonyl Acridine Orange, NAO)(小编注：该染料通常作为完整细胞线粒体内膜的荧光标志物)标记处于稳态的永生化小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblasts, MEFs)中的线粒体内膜，同时用线粒体蓝色荧光蛋白(mito-BFP)和mApple-TOM20分别标记线粒体基质和线粒体外膜，明显观察到胞质中存在一些NAO染色呈现阳性但线粒体外膜和基质呈现阴性的囊泡(图1b,c, 拓展数据图1a)。接下来，研究人员分别使用四甲基罗丹明乙酯(Tetramethylrhodamine Ethyl Ester, TMRE)(小编注：四甲基罗丹明乙酯染料是一种膜渗透性的阳离子荧光探针，可对线粒体膜电位进行特异性识别，此处用来染IMM)或MitoTracker CMXRos7各自与mito-BFP和NAO进行共染发现，TMRE和MitoTracker与NAO在缺乏线粒体外膜和基质的囊泡部分可以共定位 (拓展数据图1b-d)，进一步证明了这些囊泡是由IMM形成的。由于细胞被固定后MitoTracker的荧光染色仍然可以被保留，且这些囊泡的形成不受固定条件或MitoTracker探针浓度的影响(拓展数据图2a,b)，因此，研究人员接下来使用MitoTracker和TOM20进行共染 (图1c,拓展数据图1e)来表征VDIM，并进一步研究这些囊泡的形成。

在稳态条件下，超过90%的细胞含有MitoTracker染色呈现阳性但TOM20呈现阴性(以下称MitoTracker+/TOM20-)的囊泡，平均每个细胞含有7.9个这样的囊泡，囊泡的平均直径约为0.5μm(图1d-f)。研究人员对处于静息状态下AGS、NCI-H292、HeLa、COS-1四种细胞进行了检测，发现在所有细胞中均检测到了这种囊泡的存在(拓展数据图2c-g)。为了排除MitoTracker对膜进行非特异性标记的可能，研究人员用MitoTracker分别与内质网特异性标记物Calnexin和高尔基体特异性标记物GM130对细胞进行染色，发现MitoTracker与Calnexin和GM130不存在明显的共定位(拓展数据图2h,i)。接下来，研究人员从稳定表达Mito-dsRed和pEGFP-Parkin的HeLa细胞中去除线粒体，发现去除线粒体后几乎没有检测到MitoTracker的荧光(拓展数据图2j-l)，为了探究这些囊泡的来源，研究人员使用了OMM标志蛋白(OMP25)、IMM与OMM膜间隙标志蛋白(Cytc)、线粒体基质标志蛋白(SOD2，PDH)和IMM标志蛋白(UCQCRC)(小编注：这是泛醇-细胞色素c还原酶复合物核心蛋白2，为呼吸复合物三的关键亚基)分别与MitoTracker+/TOM20-进行共定位，结果发现，MitoTracker+/TOM20-囊泡只与IMM标志蛋白UCQCRC 共定位(图1g-k，拓展数据图3a-i)，说明这些囊泡来源于IMM，即VDIM(图1l)。研究人员用向细胞中转染携带mtDNA特异性转录因子A(specific transcrption factor A,TFAM)和线粒体DNA聚合酶γ-2亚基(DNA polymerase subunit gamma-2,POLG2)序列的质粒(小编注：TFAM和POLG2可与mtDNA紧密结合)，并对MEF细胞进行染色(图1m-r，拓展数据图3j-l)，发现部分VDIM含有mtDNA(小编注：TFAM和POLG2是可以与mtDNA特异性结合的蛋白，可以特异性结合mtDNA，从而发出荧光，猜测edu等核酸染料会与细胞核结合，产生杂信号，不利于在显微镜下对mtDNA的观察)。

研究人员推断，如果IMM的区室化有利于通过VDIM选择性清除IMM的受损部分，那么IMM结构的改变应该会抑制VIDM的生成。IMM的结构由线粒体接触位点和嵴组织系统复合体(mitochondrial contact site and cristae-organizing system, MICOS)调控，其中，MIC60对维持复合体的稳定、IMM的组织结构和线粒体功能至关重要。研究人员根据这一推断，发现在敲低了MIC60的细胞中，VDIM的形成受到显著抑制(图1s,t;拓展数据图3m,n)，表明IMM的区室化有助于VDIM的形成，进一步证实了VDIM来源于IMM。

研究人员用TOM20(绿色)或PDH(蓝色)来表征线粒体衍生的囊泡(MDVs)，发现MDVs的直径为60-150nm，而VDIM的直径显著大于MDVs(图1f;拓展数据图4a,b)。事实上，VDIM的形成不需要动力蛋白相关蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)或线粒体RHO GTP酶1(MIRO1)，其中MIRO1对于MDV的形成至关重要(拓展数据图4c-g)。此外，分拣连接蛋白9(SNX9)与部分MDV的产生和溶酶体递送有关，而SNX9的缺失并没有影响VDIM的形成(拓展数据图4h-j)。同样，与VDIM不同的是，MDC需要在氨基酸的刺激诱导下由DRP1参与形成，而VDIM在静息状态下即可检测到。最后，与VDIM不同的是，MDVs中都含有线粒体外膜组分，被定义为MitoTracker-/TOM20+。综上所述，VDIM是一种来自IMM的独立的新结构。

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嵴组织系统复合体(MICOS复合体)

MICOS复合体由MIC60和MIC10亚复合体组成，其中，MIC60亚复合物包括MIC60、MIC19和MIC25亚单位，维持嵴连接的完整性和线粒体内外膜之间的稳定性，而MIC10亚复合物包括MIC10、MIC26和MIC27亚单位，负责嵴的形状和稳定性，两个亚复合体通过MIC19连接。

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耗尽细胞线粒体的方法

在细胞中过表达Parkin，并通过加入CCCP引起线粒体膜去极化可以促进线粒体自噬，直到细胞中检测不到线粒体。培养耗尽线粒体的细胞需要用到特殊培养基，要在培养基中加入尿苷。这是因为线粒体的缺乏会影响线粒体中二氢乳清酸脱氢酶的功能，这个酶参与嘧啶合成，而嘧啶为尿苷从头合成的底物，因此直接添加尿苷可部分缓解嘧啶合成缺乏所带来的负面效应；实际上即使添加尿苷之后，细胞也只有5-30天的存活时间，且存活时间与细胞类型相关。

参考文献：

[1] Correia-Melo C, Ichim G, Tait SW, Passos JF. Depletion of mitochondria in mammalian cells through enforced mitophagy. Nat Protoc. 2017;12(1):183-194.

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线粒体不同染料的区分

(1):NAO可以与带负电的心磷脂特异性结合，而线粒体内膜上含有大量的心磷脂，因此NAO主要对线粒体内膜进行染色。

 (2):TRME可以与带负电的线粒体内膜结合，可以染活细胞的线粒体内膜，荧光会随着线粒体活性的改变而改变。

(3): MitoTracker可以与带负电的线粒体内膜结合，并形成共价键，染上之后荧光不会随着线粒体活性的改变而改变。

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上述MDV形成的机制

    (1):MIRO1对MDV形成的作用：MIRO与线粒体动态微管网络相互作用，促进线粒体膜定向突起。这些突起的膜会进一步形成MDV，而它们的方向性对于MDV的有效生成至关重要。MIRO的这种功能确保了MDVs能够沿着预定的路径从线粒体中分离出来。[1]

(2):分拣连接蛋白9(SNX9)对MDV形成的作用：SNX9 与动力蛋白紧密结合，并部分负责将这种动力蛋白募集到内吞作用部位，一旦动力蛋白在膜上组装，SNX9就能够刺激它的的GTPase活性，促进囊泡分裂。同时，SNX9还能够以膜依赖的方式激活肌动蛋白调节因子N-WASP，协调肌动蛋白聚合与囊泡释放。[2]

参考文献：

[1] König T, Nolte H, et al. MIROs and DRP1 drive mitochondrial-derived vesicle biogenesis and promote quality control. Nat Cell Biol. 2021 Dec;23(12):1271-1286.

[2] Lundmark R, Carlsson SR. SNX9-a prelude to vesicle release. J Cell Sci. 2009 Jan 1;122(Pt 1):5-11.

图1. IMM结构选择性分选形成VDIM

拓展数据图1. 细胞质中VIDM缺乏线粒体基质组分和OMM

拓展数据图2. IMM在VDIM中特异存在

拓展数据图3. VDIM来源于IMM

拓展数据图4. VDIM不同于MDV和MDC

2.VDIM可调节线粒体质量控制过程

由于VDIM缺乏线粒体基质和OMM蛋白，研究人员推测 VDIM由选择性清除的IMM片段所形成，作为线粒体质量控制机制的一部分。为了确定IMM是否会在线粒体应激期间通过VDIM进行选择性清除，研究人员使用线粒体应激物oligoA(小编注：oligomycin A，寡霉素，线粒体ATP合酶抑制剂；Rotenone，鱼藤酮，一种线粒体呼吸链复合物I抑制剂)处理细胞，发现会显著促进细胞中VDIM的形成，而用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine,NAC)或MitoTempo处理则会显著减少VDIM的形成(图2a-d;拓展数据图5)。为了探究VDIM中是否含有受损的IMM，研究人员用对过氧化物敏感的探针MitoCLox标记了IMM中的心磷脂，荧光绿色/红色强度增加代表脂质过氧化增强(拓展数据图5d-f)，实验结果表明，VDIM中存在氧化的心磷脂。

清除受损的mtDNA对维持线粒体稳态至关重要，从线粒体中清除损伤的DNA有如下几条途径：通过BAX/BAK孔、VDAC孔、线粒体衍生的囊泡(MDVs)和内体转运等。由于mtDNA缺乏保护性组蛋白(小编注：DNA与组蛋白之间通过带负电荷的磷酸基团和带正电荷的碱性氨基酸相互作用；拟核相关蛋白与DNA通过特定的结构域等与DNA结合，因此拟核相关蛋白与DNA的结合紧密程度远低于核小体蛋白与DNA的，因此拟核中的DNA更容易裸露在外，缺乏组蛋白的保护)，DNA修复能力较低，mtDNA对氧化应激非常敏感。因此，研究人员认为VDIM的形成可能是一种受损mtDNA清除的机制。尽管部分VDIM含有mtDNA(图1m-r)，并且用8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2deoxyguanosine，8-OHDG)(小编注：8-羟基脱氧鸟苷，DNA氧化损伤标志物)探针染色结果显示VDIM含有氧化DNA(拓展数据图5g,h)，但研究人员在143b rho0细胞中发现，VDIM的形成并未受损(拓展数据图5i,j)，这表明氧化的mtDNA并不是其形成的触发因素。

以上结果表明可以通过形成VDIM来进行IMM的质量控制，随后研究人员想要进一步探究VDIM是否会被溶酶体降解，实验发现VDIM位于用溶酶体标记物LAPM1标记的区域内(图3a,b;拓展数据图6a)，表明VDIM被运输到了溶酶体。接着，研究人员构建了荧光报告蛋白MCU-GFP-mCherry(小编注：Mitochondrial Calcium Uniporter, MCU, 线粒体钙离子单通道蛋白，是一种定位在IMM上的蛋白)，其中绿色荧光蛋白(GFP)对低pH的敏感性可用于监测目标蛋白在溶酶体中的定位(图3c) (小编注：对低pH的敏感性低是GFP的一个特性，mCherry荧光基团面对pH值的变化时稳定性比GFP高，GFP荧光信号在进入溶酶体后由于 pH 值的下降会出现淬灭，而mCherry荧光基团进入溶酶体后仍能发出荧光。若细胞内出现绿色和红色荧光共定位，即出现黄色荧光时，表明mCherry-GFP-目标蛋白并未与溶酶体发生融合, 当细胞内仅出现红色荧光而无绿色荧光时，代表mCherry-GFP-目标蛋白定位于溶酶体内)，染色结果显示，荧光标记的MCU蛋白与TOM20和MitoTracker一起定位于线粒体(图3d;拓展数据图6b)。然而，VDIM上GFP荧光淬灭，mCherry的荧光却保持阳性，表明该探针定位于酸性区室(图3c-e)。

为了证实VDIM能够向溶酶体递送，研究人员使用光电联用显微镜(CLEM)进行分析，结果显示，溶酶体内存在MitoTracker+/matrix-囊泡(图3f)。CLEM分析显示，这些囊泡在溶酶体中呈现膜状螺旋结构，值得注意的是，不含MitoTracker的溶酶体没有这种腔内膜结构(图3f;拓展数据图6c)。

多囊体(MVB)中也存在膜状螺旋结构，这种螺旋结构可以限制膜内陷和出芽。为了证实VDIM能够被递送至溶酶体而不是MVB，研究人员用MVB标志物CD63和溶血双磷脂酸(lysobisphosphatidic acid, LBPA)对MVB和VDIM的共定位情况进行了检测。结果显示，CD63和溶血双磷脂酸未能与VDIM共定位(拓展数据图7a-d)。Arlb8 GTPase可以促进溶酶体与MVB的融合，而VDIM的形成不依赖于Arlb8 GTPase (拓展数据图7e-i)，这进一步将含有VDIM的溶酶体与MVB区分开。

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光电联用显微镜

光电关联显微成像技术(correlative light and microscopy,CLEM)是结合研究目标提供的光学显微镜定位信息和电子显微镜超微结构信息进行成像的一种技术，能够实现在一张图像里既获得荧光信息，又能获得电镜的高分辨结构信息。根据获取荧光信号的顺序，光电关联显微成像技术分为包埋前的光电关联(pre-embedding)和包埋后的光电关联(post-embedding)。包埋前的光电关联是在电镜制样之前进行荧光数据的采集，采集完荧光信息后再进行电镜制样，这样就不用考虑在电镜制样后荧光信号保留的问题。包埋后的光电关联是在电镜制样之后进行超薄切片，然后拍摄荧光数据，对荧光探针的要求比较高。

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143b rho0细胞系

143b rho0细胞是一种特殊的细胞系，其特点是缺乏mtDNA，不能编码相应的线粒体呼吸链酶复合物亚单位、失去氧化磷酸化功能、主要由糖酵解途径提供能量而存活，且线粒体不进行增殖，是研究细胞核与线粒体关系、线粒体相关疾病、线粒体呼吸功能、mtDNA突变及药物、毒物作用机制的理想细胞模型。该细胞系可以通过用低浓度的溴化乙锭处理来构建形成，溴化乙锭对mtDNA的DNA聚合酶POLG的抑制作用强于DNA聚合酶α和β，因此可抑制mtDNA的复制和转录，而基本不影响核DNA，该细胞可以增殖，但需要用含有尿苷的特殊培养基来培养。

参考文献：

[1] Qian W, Van Houten B. Alterations in bioenergetics due to changes in mitochondrial DNA copy number. Methods. 2010;51(4):452-457.

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MitoTEMPO和MitoCLOX探针

MitoTEMPO是一种线粒体靶向抗氧化剂，一种线粒体超氧化物的特异清除剂。它是抗氧化剂哌啶硝基氧TEMPO与亲脂阳离子三苯基鏻的组合，使MitoTEMPO能够轻松通过脂质双层膜，并在线粒体中积累数百倍。线粒体功能障碍和氧化应激可导致多种疾病，包括心血管、肾脏、肝脏疾病、帕金森病和阿尔茨海默症。MitoTEMPO已被用作线粒体靶向抗氧化剂。MitoCLox被设计为一系列对心磷脂(CL)过氧化敏感的探针的起始化合物。其中BODIPY荧光团携带一个含有二烯的部分(如C11-BODIPY(581/591)探针)，并通过包含两个酰胺键的长柔性连接体与三苯基膦阳离子(TPP)相连。在含有CL的脂质体中，细胞色素c诱导了MitoCLox的氧化，该氧化过程与心磷脂的氧化并行发展，而带正电荷的MitoCLox对带负电荷的CL分子具有亲和力。MitoCLox可用于监测体内CL的氧化。

参考文献：

[1] Lyamzaev KG, Sumbatyan NV, et al. MitoCLox: A Novel Mitochondria-Targeted Fluorescent Probe for Tracing Lipid Peroxidation. Oxid Med Cell Longev. 2019 Nov 13;2019:9710208).

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多囊体(Multivesicular body, MVB)

MVB是由单层膜包被的、直径在200-1000nm之间、腔内包含多个微小囊泡(intralumenal vesicles, ILVs)的内吞体，在电镜下可观察到一个大的囊泡包含多个腔内囊泡的特殊形态，MVB的主要功能是负责将需要被内吞的分子与溶酶体或自噬体融合并被降解，也可以与细胞质膜融合释放ILV，以外泌体的形式发挥细胞间通讯作用。

推测膜螺旋结构可能有助于增强MVB膜的稳定性，防止过度的膜内陷和出芽，从而确保MVB的正常形态和功能。下图所示为内质网中螺旋结构的相关电镜图(如下图d)，在此图中，研究人员发现用毒胡萝卜素(thapsigargin,Tg）处理可以将ER转化为大的环状结构。这些ER环呈现细长的椭圆形，其尺寸可达5μm，在用Tg处理6小时的正常大鼠肾脏(NRK)细胞中，观察到多个同心ER环状膜结构，堆叠在一起，称为ER螺旋(ER whorls)。

参考文献：

[1] Colombo M, Raposo G, Théry C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 2014;30:255-289.

[2] Xu F, Du W, Zou Q, et al. COPII mitigates ER stress by promoting formation of ER whorls. Cell Res. 2021;31(2):141-156.

最后，研究人员用活细胞成像技术处理了表达mito-BFP的细胞，可直接观察到VDIM被递送到溶酶体的过程，其中线粒体用MitoTracker (红色)标记，溶酶体用荧光葡聚糖(绿色)标记。从线粒体分离出的MitoTracker+/matrix-囊泡直接被输送到靠近线粒体表面的葡聚糖标记的溶酶体中(图3g;拓展数据图6d)。溶酶体内MitoTracker强度的同步增加表明MitoTracker+囊泡发生了转移(图3h)。之前有研究表明与溶酶体接触的线粒体会优先进行外周分裂，而VDIM在线粒体中形成的位点并无选择性(图3i)。同样，如果VDIM代表线粒体部分蛋白水解后的残留物，那么溶酶体水解线粒体之后会产生更多VDIM，抑制溶酶体功能则会导致VDIM数量减少。然而，用巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1, BafA1)或氯喹抑制溶酶体酸化和功能后，VDIM的数量反而增加(图3j,k;拓展数据图6e,f)。为了进一步证明这些增加的MitoTracker+囊泡不含其他线粒体组分，研究人员通过免疫荧光实验发现OMM标志蛋白OMP25、线粒体基质标志蛋白PDH和SOD2与VDIM没有共定位(拓展数据图6g-l)。总的来说，这些数据证实了VDIM被运输到溶酶体进行降解，并表明VDIM的形成可能代表了一种新的线粒体内质量控制途径，从而响应线粒体内膜损伤。

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线粒体mtDNA质量控制

(1)BAX/BAK孔：BaX/BaK与细胞凋亡密切相关，其激活是凋亡发生的关键。正常情况下，BAK则位于线粒体上而BAX主要位于细胞质中(仅少量BaX/BaK在细胞质和线粒体外膜之间穿梭)，但在凋亡信号刺激后，BAX会迁移到线粒体上，BaX/BaK在线粒体外膜发生寡聚化并导致线粒体外膜透化，进而引起可溶性膜间蛋白(如细胞色素c)从膜间释放；随着时间延长，BAX/BAK介导的孔隙会进一步扩大为大孔，这使得线粒体内膜可通过外膜挤出并破裂，从而释放mtDNA。一旦mtDNA进入细胞质，就会通过DNA降解酶，或者被自噬体吞噬等方式被降解[1]。

(2)mPTP和VDAC：mPTP(Mitochondrial Permeability Transition Pores)位于线粒体内膜上，生理情况下呈现低通透性、可逆地开放(直径为0.2~0.3μm)，而在病理条件下，PTP呈高通透性开放状态(直径为1.6~2.8μm)。VDAC位于线粒体外膜上，在低电压(低于30mV)时，VDAC直径约为4nm，此时，VDAC处于高传导状态，为阴离子选择性，对小离子及大的阴离子如ATP、Glu等通透；而当跨膜电压高于30mV 时，VDAC直径减少为2nm，mPTP要大于VDAC。VDAC能在膜上形成亲水性电压门控通道。作为一种转运阴离子、阳离子、ATP 以及其他代谢物进出线粒体的通道蛋白，它通过与 Ca2+、ATP、谷氨酸(Glu)、NADH以及不同蛋白质相互作用，调节着线粒体外膜的通透性，从而控 制着线粒体的功能，在维持线粒体及细胞活性方面发挥重要功能。VDAC还参与调控内源性的细胞凋亡途径，通过释放细胞色素C调控细胞凋亡。 在细胞受到各种应激条件时，线粒体产生大量的活性氧(ROS)。这些ROS导致线粒体DNA(mtDNA)发生氧化，形成氧化线粒体DNA(Ox-mtDNA)。线粒体内的核酸内切酶FEN1识别并剪切Ox-mtDNA，将其切割成更小的片段。线粒体内膜通透性转换孔mPTP在应激条件下开放，允许小分子物质通过。mPTP的开放可能触发外膜VDAC的构象变化，形成较大的通道。此外，外源炎症小体激活剂也可能直接或通过MCU(线粒体钙离子单向转运体)间接激活VDAC，并促进线粒体形成mPTP。剪切后的Ox-mtDNA片段通过mPTP从线粒体基质释放到线粒体膜间隙，并最终进入细胞质被降解[2]。mPTP的开放程度会导致不同的结果，开放程度主要取决于线粒体中的钙浓度，Ca2+可以与线粒体内膜上的ATP合酶结合并穿梭于线粒体膜间隙和线粒体基质之间，形成电流，不同程度的电流可以调节mPTP的开放程度。不同的mPTP开放程度可能导致不同的结果，生理性的mPTP短暂性开放可以促进线粒体基质中的Ca2+外流，可以控制线粒体内Ca2+的量，进而控制Ca2+相关的代谢。此外，低电导mPTP开放允许内源性ROS和线粒体内产生的受损部分挤出到细胞质中，进而在细胞质被降解。

(3)线粒体衍生的囊泡(MDVs)：MDVs是从线粒体横向出芽的单层(外膜)或双层(内膜和外膜)线粒体膜包裹的小泡，它们携带线粒体内含物，包括mtDNA。线粒体损伤后，mtDNA会通过MDVs从线粒体中释放出来，经自噬体吞噬和与溶酶体结合降解。

(4):内体：当线粒体DNA复制受到应激时，会出现复制停止的拟核。在应激条件下，这些功能异常的拟核被转运离开线粒体，进入到内体中。

参考文献：

[1] McArthur K, Whitehead LW, et al. BAK/BAX macropores facilitate mitochondrial herniation and mtDNA efflux during apoptosis. Science. 2018 Feb 23;359(6378).

[2] Xian H, Watari K, et al. Oxidized DNA fragments exit mitochondria via mPTP- and VDAC-dependent channels to activate NLRP3 inflammasome and interferon signaling. Immunity. 2022 Aug 9;55(8):1370-1385.

[3] Newman LE, Weiser Novak S,et al. Mitochondrial DNA replication stress triggers a pro-inflammatory endosomal pathway of nucleoid disposal. Nat Cell Biol. 2024 Feb;26(2):194-206.

[4] Bonora M, Giorgi C, Pinton P. Molecular mechanisms and consequences of mitochondrial permeability transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 2022;23(4):266-285.

[5] 汤新慧, 高静, 徐强. 线粒体电压依赖性阴离子通道及其调控功能. 中国细胞生物学杂志.

图2. VDIM的形成是线粒体内的一种质量监控机制

图3. VDIM被运送到溶酶体里降解

拓展数据图5. VDIM在线粒体内质量监控中起作用

拓展数据图6. VDIM被运送到溶酶体里降解

拓展数据图7. VDIM不是多囊泡体(MVB)

3.线粒体与溶酶体相互作用生成VDIM

研究人员接下来研究了VDIM运输到溶酶体的途径。在线粒体损伤的情况下，VDIM的形成不会影响线粒体的其余部分，这表明VDIM的形成没有破坏OMM。有文章表明定位于线粒体外膜的电压门控阴离子通道(VDAC)可以通过寡聚化形成大的孔隙，从而释放mtDNA。这些孔隙在响应氧化应激和胞质钙(Ca2+)增加时形成，可由多达20个单体组成为了探究VDIM的形成是否需要VDAC1，研究人员进行了两组实验，使用VDAC抑制剂VBIT-12处理细胞或在细胞中直接沉默VDAC1的表达，结果发现VDIM的形成受到显著抑制(图4a,b;拓展数据图8a-c)，证明了VADC1是形成VDIM不可缺少的。有趣的是，有研究表明VDAC能够与溶酶体上的钙离子通道瞬时受体电位粘蛋白1( transient receptor potential mucolipin 1 ,TRPML1)相互作用，而TRPML1能够通过释放Ca2+来响应线粒体活性氧(ROS)(小编注：ROS可直接特异性激活溶酶体 TRPML1 通道活性，因此也把其作为ROS感受器)，进而调节线粒体功能。为了探究TRPML1–Ca2+–VDAC轴在VDIM形成中的作用(图4c)，研究人员使用膜渗透性Ca2+螯合剂BAPTA-AM对细胞进行处理，发现VDIM的形成显著减少(图4d;拓展数据图8d)。同样，研究人员使用TRPML1抑制剂apilimod34处理细胞，发现也能够显著减少VDIM的形成(图4d;拓展数据图8d)，而使用TRPML激动剂ML-SA1则会促进VDIM的形成(图4e,f;拓展数据图8e,f)。值得注意的是，抑制VDAC或TRPML1的活性并不会改变OMP25(线粒体外膜标志物)或PDH(线粒体机制标志物)与VDIM的定位情况(拓展数据图8g-j)。

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线粒体与钙

在正常生理条件下, 细胞内游离的钙浓度为10^-8~10^-7mol/L,细胞外的钙浓度为10^-3~10^-2mol/L。有文献提到，为了控制Ca2+细胞毒性和维持Ca2+信号传导，必须将静息时的胞质钙浓度维持在100nM(即10^-7mol/L)左右的低水平，超过就会有细胞毒性。

细胞受到外界刺激或应激时可引起Ca2+内流,并瞬时明显提高细胞内Ca2+浓度。线粒体钙单向转运蛋白(Mitochondrial Calcium Uniporter, MCU)包含四个核心成分：成孔MCU蛋白，看门人MICU1和MICU2，以及辅助亚基EMRE，当细胞处于静息状态、胞质内钙离子(Ca2+)浓度较低时，MICU1-MICU2抑制Ca2+通过MCU进入线粒体；而当细胞受到信号刺激、胞质内Ca2+浓度升高并超过一定阈值时(大于1μM)，MICU1-MICU2则允许Ca2+通过MCU进入线粒体。应激后的线粒体会导致线粒体外膜中的电压依赖性阴离子通道(Voltage-Dependent Anion Channel, VDAC)寡聚化，VDAC寡聚化会在线粒体外膜上形成大孔，从而释放mtDNA。并且有研究证明，mtDNA的异常释放会激活NLRP3 炎症小体、会引起病理性炎症，引起类风湿性关节炎、狼疮等自身免疫性疾病、心肌梗死等心血管疾病、神经退行性疾病的发生等，抑制VDAC的寡聚化能够减轻炎症反应。本文中并没有将重点放在VDAC寡聚化导致mtDNA释放的后果，但结合其他文献推测，抑制VDAC的寡聚化和mtDNA的释放对细胞与机体而言是有利的。

参考文献：

[1] Wang C, Tang RJ, Kou S, et al. Mechanisms of calcium homeostasis orchestrate plant growth and immunity. Nature. 2024;627(8003):382-388.

[2] Fan M, Zhang J, Tsai CW, et al. Structure and mechanism of the mitochondrial Ca2+ uniporter holocomplex. Nature. 2020;582(7810):129-133.

[3] Kim J, Kim HS, Chung JH. Molecular mechanisms of mitochondrial DNA release and activation of the cGAS-STING pathway. Exp Mol Med. 2023;55(3):510-519.

[4] Kim J, Gupta R, Blanco LP, et al. VDAC oligomers form mitochondrial pores to release mtDNA fragments and promote lupus-like disease. Science. 2019;366(6472):1531-1536

接下来，为了进一步证明TRPML1调控Ca2+释放可以参与VDIM的形成，研究人员构建了Trpml1-/-小鼠模型，并提取了Trpml1−/−胚胎成纤维细胞培养(MEFs)(拓展数据图8k)。结果发现，在细胞处于稳态时，Trpml1−/−MEFs中的VDIM形成受到抑制(图4g;拓展数据图8l)。此外，与WT细胞(图3j)相比，用BafA1处理Trpml1−/−细胞后无法进一步积累VDIM(图4h;拓展数据图8m)。研究人员用TRPML1-yfp质粒瞬时转染TRPML1−/−MEFs使其重新表达TRPML1后，能够使VDIM的含量显著回升(图4i;拓展数据图8n)。这些结果表明线粒体和溶酶体之间存在相互作用，促进VDIM的形成。

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TRPML1是溶酶体中调节自噬的 ROS 传感器

细胞应激能触发自噬以去除受损的大分子和细胞器。而溶酶体“宿主”的多种应激感应机制，触发自噬体和溶酶体的协调生物发生。线粒体 ROS 的增加(例如，通过羰基氰化物间氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone, CCCP, 一种线粒体呼吸抑制剂)介导的线粒体去极化)可能会激活溶酶体周边膜上的 TRPML1 通道，诱导溶酶体 Ca2+释放从而激活钙调磷酸酶。随后，Ca2 +与钙调磷酸酶结合使 TFEB(溶酶体生物发生调节因子) 去磷酸化，诱导 TFEB 核易位，促进自噬体生物发生和溶酶体生物发生。最终，清除受损线粒体和过量的ROS。因此，TRPML1可能作为溶酶体中的 ROS 传感器，调节细胞氧化还原稳态所必需的自噬依赖性负反馈机制。

参考文献：

[1] Zhang X, Cheng X, Yu L, et al. MCOLN1 is a ROS sensor in lysosomes that regulates autophagy. Nat Commun. 2016;7:12109. Published 2016 Jun 30.

图4. VDAC1和溶酶体钙离子通道TRPML1介导VDIM形成

拓展数据图8. VDAC1和TRPML1介导VDIM的形成

4.ESCRT诱导微自噬导致VDIM形成

研究人员构建了缺乏自噬体关键组分ATG5、ATG12、ATG14和ATG16L1的五种MEF KO细胞，发现VDIM的形成并未受到抑制(图5a-d;拓展数据图9a)，并且在ATG5−/−的细胞中，囊泡也通过上文所述的机制产生(拓展数据图9b-s)。此外，研究人员用自噬标志基因构建mcherry-LC3和p62-mcherry质粒并转染MEF细胞，发现自噬标志物p62和LC3B未能与VDIM共定位(图5e,f;拓展数据图9t,u.)，因此VIDM的形成与巨自噬无关。值得注意的是，巨自噬的缺乏导致了VDIM的增加，且40%的VDIM发生了泛素化修饰(图5e,f;拓展数据图9v)。对于溶酶体微自噬来说，识别泛素化修饰的货物是非常重要的，并且荧光共定位实验结果显示，溶酶体标志物LAMP1和溶酶体跨膜蛋白TRPML1均能与VDIM共定位，说明含有VDIM的溶酶体腔内存在溶酶体跨膜蛋白(图5g,h;拓展数据图10a,b)，与微自噬过程会发生膜内陷这个现象吻合。这些结果表明，微自噬促进了VDIM的形成。E3连接酶Parkin是研究最深入的线粒体泛素化和线粒体自噬的调节因子。然而，研究人员用mcherry-parkin质粒转染细胞发现，VDIM中Parkin的表达很低(图5i,j;拓展数据图10c)，并且过表达或敲除Parkin均未影响VDIM的形成(图5k,l;拓展数据图10d,e)，这表明VDIM的形成与Parkin无关。

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不同的降解途径特定的底物偏好和功能

有时泛素化底物没有被蛋白酶体降解，而是被溶酶体吞噬，这可能是因为不同的降解途径在细胞内有特定的底物偏好和功能。例如，蛋白酶体主要负责降解泛素化标记的单个蛋白质，而溶酶体则更倾向于处理大的蛋白质聚集体和受损的细胞器。此外，溶酶体微自噬途径可以作为蛋白酶体途径的补充，特别是在蛋白酶体功能受损或负荷过重时。

以丙酮酸脱氢酶(PDH)阳性线粒体衍生的囊泡(MDV)介导的微线粒体自噬为例(图b)。在氧化应激下，线粒体基质中的氧化蛋白(如PDH)聚集，触发PTEN诱导的激酶1(PINK1)在线粒体外膜积累，在那里它磷酸化泛素(Ub)并募集PRKN。PRKN可能产生更多的OMM蛋白泛素化，以促进线粒体衍生的囊泡(MDV)的形成和出芽。之后，MDV内化到溶酶体腔中进行降解。

参考文献：

[1] Wang L, et al. The emerging mechanisms and functions of microautophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 2023;24(3):186-203.

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细胞自噬

细胞自噬有以下几条途径：

①巨自噬(Macroautophagy)：通过自噬体与溶酶体的融合，可将需要降解的细胞内容物递送到溶酶体。

②分子伴侣介导的自噬 (Chaperone-mediated  autophagy, CMA)：热休克同源蛋白70(HSC70)作为分子伴侣，能够识别并结合带有KFERQ基序的蛋白质，然后将这些蛋白质转移到溶酶体膜上，通过与溶酶体相关膜蛋白2A(LAMP2A)的相互作用，溶酶体识别KFERQ样基序，将底物蛋白转运到溶酶体腔内进行降解。识别KFERQ基序是CMA底物被识别和选择性降解的关键。蛋白质上的KFERQ样基序可以是先天存在的，也可以在翻译后修饰过程中获得，例如通过磷酸化或乙酰化等修饰作用产生(如KFERK中的最后一个赖氨酸K发生乙酰化修饰后可替代谷氨酰胺Q发挥出KFERQ样基序类似的功能)。CMA降解是一种选择性的蛋白质降解途径，主要发生在错误折叠或未折叠的蛋白中。并不是所有带有KFERQ序列的蛋白质都需要被降解。蛋白质是否被CMA途径降解还取决于其他因素，如蛋白质的亚细胞定位、翻译后修饰、以及细胞内CMA途径的活性状态等。要成为 CMA 底物，蛋白质必须在其氨基酸序列中包含特定的靶向基序，引导目标进入溶酶体降解。例如，哺乳动物Ste20样激酶1(MST1;也称为STK4)在远离KFERQ样基序的残基中的乙酰化会阻止其被降解，并且只有在脱乙酰化时HSC70才能结合基序发挥作用。

③微自噬(Microautophagy) ：在这个过程中，溶酶体膜内陷将需要降解的物质包裹，将物质内化并形成含溶酶体膜蛋白的腔内囊泡。

参考文献：

[1] Kaushik, S., Cuervo, A.M. The coming of age of chaperone-mediated autophagy. Nat Rev Mol Cell Biol. 2018; 19, 365–381.

上述结果表明，存在一种受损的IMM递送至溶酶体和膜分裂的机制，为了探究微自噬过程中介导膜剪切的ESCRT机制与VDIM的形成相关，研究人员通过构建ESCRT复合体相关质粒并转染细胞，在VDIM的潜在生成位点能够检测到ESCRT复合体蛋白(图6a-e;拓展数据图10f-h)，在这些位点，“不成熟”的VDIM被溶酶体完全内化，转变为“成熟”的VDIM(小编注：①在形成过程上：不成熟的VDIM指的是在特定信号激活下，线粒体内膜嵴开始向外突出，但尚未被溶酶体完全内化的状态。而成熟的VDIM则是这些突出的内膜嵴被溶酶体完全内化后，形成了包含线粒体内膜组分的囊泡，这些囊泡最终会在溶酶体内被降解。②在组分上：不成熟的VDIM仅包含部分内膜嵴的组分，而成熟的VDIM则包含了完整的内膜嵴组分，包括线粒体DNA(mtDNA)和特定的蛋白质。③在功能上：不成熟的VDIM尚未发挥其在细胞内清除受损线粒体内膜的功能。成熟的VDIM则在溶酶体中被降解，有助于维持线粒体的健康和功能)。值得注意的是，与成熟的VDIM相比，未成熟的VDIM中ESCRT蛋白的水平更高，这表明ESCRT能够介导VDIM从未成熟到成熟这个过程的发生(图6e)。此外，研究人员用MitoTracker和荧光葡聚糖(标记溶酶体)标记表达TSG101-GFP的活细胞，并对其成像，结果显示，TSG101被募集到MitoTracker+囊泡断裂的位置并被溶酶体吞噬(图6f;拓展数据图10i)，从而进一步证明ESCRT参与VDIM的形成。凋亡相关基因2(ALG-2)通过感应钙离子浓度，在受损的细胞质膜和溶酶体部位募集ESCRT，从而触发膜分裂。为了探究ALG-2是否同样能够调节ESCRT的招募以促进VDIM的形成，研究人员对VDIM和ALG-2进行了免疫荧光染色，发现35.4%的VDIM呈ALG-2阳性(图6g,h;拓展数据图10j)，进一步验证了ALG-2能够调控ESCRT的募集。研究人员推断，如果ESCRT能够促进VDIM形成的最后一步——膜分裂，那么ESCRT的缺失应该会导致微自噬停滞，减少VDIM的形成。与此推断一致，在ESCRT蛋白TSG101表达缺失的细胞中，MitoTracker+/TOM20-囊泡被溶酶体内化，但依旧以很小的接触面附着于线粒体上，表明膜分裂受损(图6i;拓展数据图10l)。VDIM形成过程中未完成膜分裂，加上溶酶体无法及时将这些IMM片段降解，导致这些细胞中未成熟的VDIM数量增加(图6j,k)。研究人员对TSG101表达缺失的细胞进行CLEM分析，结果显示，IMM向外突出到溶酶体中，类似于不成熟的VDIM(图6l)。这些发现和VDIM总是存在于溶酶体内的发现(图3b)，共同表明溶酶体是VDIM形成所必需的。综上所述，这些数据表明，由ESCRT介导的微自噬样过程导致了VDIM的形成，这些VDIM是被溶酶体包裹的IMM部分，大小范围为0.1至5.6μm(图6m)。

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ESCRT复合体

ESCRT：内吞体运输必需分选复合物(endosomal sorting complex required for transport)，是一种保守的膜重塑复合物，在许多涉及膜重塑事件的过程中可以进行膜剪切。ESCRT包括4种主要核心复合物(ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ、ESCRT-Ⅲ)及辅助蛋白ALIX、AAA ATPase VPS4等，ESCRT的作用机制是招募并组装核心复合物，并与AAA ATPase VPS4共同作用介导膜断裂。ESCRT-Ⅰ是首先被发现的ESCRT复合物，其核心亚基为TSG101。ESCRT-I复合体负责将特定的蛋白质分选到多泡体(MVBs)中，这是外泌体形成的一个关键步骤。在MVBs与细胞膜融合并释放外泌体到细胞外的过程中，TSG101通过与这些蛋白质的相互作用，确保了正确的蛋白质被包含在最终分泌的外泌体中。所以TSG101也被作为外泌体的标志物。ESCRT-Ⅱ是一种Y形四聚体，ESCRT-Ⅱ被上游ESCRT-Ⅰ招募后，其亚基EP20进一步促进ESCRT-Ⅲ复合物形成，ESCRT-Ⅲ共有12种亚基，称为带电多泡体蛋白(CHMP)，有4个核心亚基CHMP2、CHMP3、CHMP4、CHMP6)。

参考文献：

[1] Henne WM, Buchkovich NJ, Emr SD. The ESCRT pathway. Dev Cell. 2011;21(1):77-91.

图5. 溶酶体吞噬IMM形成VDIM

图6. ESCRT复合体介导VDIM形成

拓展数据图9. VDIM的形成独立于巨自噬

拓展数据图10. VDIM通过ESCRT介导的微自噬样过程形成

总结

线粒体嵴的大小、形状和完整性的改变与多种癌症、神经退行性疾病相关。然而，IMM的动态变化对这些疾病的影响尚不清楚。本研究发现了一种新的线粒体质量控制机制：受损的嵴释放的ROS能够激活靠近线粒体的溶酶体上的TRPML1通道，导致VDAC1寡聚化。这种寡聚化会在OMM上形成一个孔，受损的IMM片段通过该孔游离出来，并被相邻的溶酶体直接吸收。之前有研究表明，IMM与线粒体拟核关系密切(小编注：之前有研究表明，MTFP1通过抑制线粒体融合，从线粒体网络中分离和清除受损的IMM子结构域。随后，通过外周分裂形成富含MTFP1的小线粒体(SMEM)，这些小线粒体最终以自噬依赖的方式降解，细胞利用这样一个质量控制过程来降解线粒体拟核，使mtDNA维持在正常生理水平)，因此研究人员推测mtDNA会与突出的线粒体内膜一起被吸收。随后，ESCRT介导的膜分裂导致二者被溶酶体内化并形成VDIM，从而逐渐将受损的线粒体内膜清除，并保留线粒体的其余部分(图6n)。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-024-07835-w#Sec6