撰文 | 李欣茜 张婷 仲银召 郑宇含 张彦康 李雨

编辑 | 孟美瑶

校对 | 张婷

研究背景

在生物体内，蛋白质分解代谢会产生氨（小编注：生物体内氨基酸的分解主要过程如下：氨基酸在转氨酶催化下，先将一个氨基转移到α-酮戊二酸上，生成谷氨酸，即：

谷氨酸在谷氨酸脱氢酶（Glutamate Dehydrogenase，GDH）的作用下产生氨，即：

），而为了保护机体免受过量氨的侵害，尿素循环应运而生。尿素循环也被称为鸟氨酸循环（小编注：鸟氨酸是非蛋白质氨基酸，是在尿素循环中由精氨酸转化生成的，即：

），主要功能是将有毒的氨转化为无毒的尿素。其中，肝脏和肾脏是尿素生成的主要场所，其底物来源于食物中的外源性蛋白质，以及禁食或高能量需求期间（如癌症增殖或运动期间）的内源性蛋白质的分解代谢。尿素循环主要由以下5种酶介导：氨甲酰磷酸合成酶1 （Carbamoyl Phosphate Synthetase I，CPS1）、鸟氨酸氨甲酰基转移酶（Ornithine Transcarbamylase，OTC）、精氨酸琥珀酸合成酶（Argininosuccinate Synthetase，ASS1）、精氨酸琥珀酸裂解酶（Argininosuccinate Lyase, ASL）和精氨酸酶1（Arginase 1，ARG1）。此外，N-乙酰谷氨酸合成酶（N-acetylglutamate synthase，NAGS）能催化产生N-乙酰谷氨酸（N-Acetylglutamate，NAG），NAG激活CPS1，从而控制底物进入尿素循环。

尿素循环中的遗传缺陷在人类中十分常见，并会进一步导致高氨血症和脑部疾病（小编注：高氨血症是一种临床综合症，会导致肝性脑病、阿尔兹海默症、肝损伤及肌肉萎缩等），威胁人类健康。近来有研究表明，肥胖并发症（包括代谢功能障碍相关的脂肪性肝病（MASLD）、脂肪性肝炎（MASH）和2型糖尿病）患者体内尿素循环相关酶表达受到抑制，提示尿素循环障碍可能与代谢性疾病相关联。然而，人们目前尚不清楚能量代谢与氮通量间的具体关联机制，并且对于尿素循环和其他循环间的相互关系还知之甚少。

在本篇文章中，研究人员通过在小鼠模型和人类中的研究发现，尿素循环的轻微缺陷，例如肝细胞中精氨酸酶2（Arg2）的缺失，会导致尿素循环障碍，进而影响三羧酸（TCA）循环和线粒体的氧化代谢，最终可能导致MASLD或MASH。此外，研究人员通过分析人类血清中的氮代谢及氧化代谢物水平，发现氮分解代谢和线粒体功能的紊乱可以在发病前近十年独立预测严重的MASLD或MASH。总之，本篇研究通过TCA循环的分级调控将尿素循环、线粒体氧化代谢和代谢性肝病联系起来，强调了尿素循环对于代谢健康的重要性，并提出了通过调节尿素循环来预防或治疗代谢性疾病的可能性。

敲黑板啦！

1.肝细胞Arg2缺失会损害肝脏尿素循环、TCA循环和线粒体功能

2.随着年龄的增长，肝细胞Arg2缺乏会引起肥胖、肝脂肪变性和胰岛素抵抗

3.补充NAD+可改善Arg2LKO小鼠肝脏线粒体功能和MASH

4.尿素循环-TCA循环调控受损可引起MASH发生

研究结果

1.肥胖小鼠和肥胖人群受试者肝细胞尿素生成和氧化相关基因表达下降

先前研究表明在代谢性肝病中尿素循环受损，但临床中提示肝脏代谢受损与尿素循环相关联的数据较少。因此研究人员在饮食限制或减肥手术前后接受肝脏活检的前瞻性队列NASH患者中，研究了治疗NASH后肝脏代谢、肝尿素循环和氧化相关基因表达之间的相互联系（图1A）。结果显示，通过饮食限制或减肥手术治疗NASH后，肝脏中尿素循环相关基因（如Nags、Otc和Ass1）、TCA循环相关基因以及线粒体复合物I-IV相关基因表达显著上调（图1B）。这些结果在干预措施和性别方面趋势均是一致的，具体来讲，饮食干预或减肥手术均改善了肥胖和胰岛素抵抗现象，并伴随着肝脏尿素循环、TCA循环和线粒体氧化磷酸化相关基因表达的上调。

接下来研究人员在饮食诱导的肥胖小鼠模型中探究了肝脏代谢、肝尿素循环和氧化代谢之间的相互联系。研究人员使用高脂肪西方饮食（WD）来模拟MASLD，使用高脂高果糖和高胆固醇饮食（HFFC）来模拟MASH。结果显示，与正常饮食小鼠相比，MASLD和MASH小鼠肝脏中尿素循环相关基因Cps1、Otc、Ass1、Asl和Arg1表达下调，而Arg2表达升高（图1C）。

肝脏主要由炎性细胞和实质细胞构成，炎性细胞可表达尿素循环酶如精氨酸酶（小编注：尿素循环主要发生在肝实质细胞中，因为肝实质细胞拥有完整的尿素循环酶）。为了研究肝细胞中尿素循环酶基因的特异性表达变化，研究人员从野生型（WT）小鼠中分离出肝原代细胞，并分别用果糖、蔗糖和WD（5mM果糖与500μM游离脂肪酸混合，这是西方饮食成分比例）处理，结果显示，果糖、蔗糖或WD处理显著降低了原代肝细胞中尿素循环酶相关基因表达，包括Arg2、Arg1、Otc和Asl（图1D）。这些数据表明，在饮食胁迫下，肝细胞尿素循环受损，且肝细胞中Arg2所发挥的功能可能与炎性细胞中Arg2功能不同。综上，减肥人群受试者和MASLD/MASH小鼠模型表明，肝脏和肝细胞中尿素循环抑制与TCA循环和线粒体氧化磷酸化损伤之间存在潜在的相互作用。

              图1.人类患者肝脏转录组学，以及MASLD小鼠模型肝脏损伤与尿素循环和TCA循环相关联

                        图S1.NAFLD小鼠肝脏中尿素循环、TCA循环和氧化磷酸化相关基因表达下降

2.年轻Arg2LKO小鼠机体代谢正常，而肝细胞尿素循环受损

精氨酸酶可介导精氨酸水解为鸟氨酸和尿素，在基础状态下，肝细胞中Arg1表达水平高于Arg2，而在禁食情况下，可显著诱导肝细胞Arg2表达。然而，肝细胞Arg2的生理功能目前尚不清楚。因此，研究人员利用CRISPR-Cas9技术构建Arg2Flox小鼠，并与Albumin-Cre小鼠杂交，得到Arg2LKO小鼠（肝细胞中特异性敲除Arg2基因）（图1E-F）。结果显示，在正常饮食下，与Arg2Flox小鼠相比，Arg2LKO小鼠体重、肝重、体成分、机体糖稳态和血脂水平均无差异（图S2A-S2H）。

随后，研究人员对Arg2LKO小鼠肝原代细胞进行靶向质谱分析，结果显示，与Arg2Flox小鼠相比，Arg2LKO小鼠肝细胞中精氨酸水平显著升高，而鸟氨酸和瓜氨酸水平显著下降（图1G）。然而，Arg2LKO小鼠的尿液、血清尿素和血清氨水平显著增加（图S2I-S2L），这提示Arg2LKO小鼠肝脏中非肝细胞的尿素循环水平代偿性上调（小编注：Arg2LKO后尿素循环受损，血氨水平理应上升；其他非肝细胞组织虽然没有完整的尿素循环酶，但也会发生尿素循环，而当肝细胞中尿素循环受损时，它们会代偿性的增加，从而导致尿液和血清中尿素水平升高）。此外，研究人员还观察到Arg2LKO小鼠肝原代细胞中谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸水平增加，谷氨酰胺水平下降（小编注：机体其他组织氨基酸代谢等产生的氨并不能直接入肝，而是先与谷氨酸合成谷氨酰胺入肝，随后谷氨酰胺在谷氨酰胺酶作用下分解成谷氨酸和氨，随后氨在氨甲酰磷酸合成酶1（CPS1）作用下与N-乙酰谷氨酸、HCO-3合成氨甲酰磷酸（CP），CP和鸟氨酸在鸟氨酸氨甲酰转移酶（OTC）作用下合成瓜氨酸，瓜氨酸和天冬氨酸在精氨酰琥珀酸合成酶（ASS1）作用下合成精氨琥珀酸，精氨琥珀酸在精氨琥珀酰裂解酶（ASL）作用下生成精氨酸和延胡索酸，精氨酸在精氨酸酶（ARG1/ARG2）作用下生成尿素和鸟氨酸。由此可知，当ARG2缺乏导致尿素循环受损时，上游分解代谢仍在进行，故而导致谷氨酸水平升高。谷氨酸可在ALT作用下生成α-酮戊二酸，进入三羧酸循环，产生草酰乙酸，草酰乙酸可进一步生成天冬氨酸和丙氨酸，进而致使丙氨酸和天冬氨酸累积（参见图S2I）。此外，下文阐述了当ARG2缺乏时，会致使谷氨酰胺分解代谢增强（图2H-2J），进而导致谷氨酰胺水平下降）（图1H）。总之，这些结果表明肝细胞Arg2缺失可促进尿素循环受损，氨基酸积累，而小鼠机体代谢表型无显著差异。

                                                     图S2.年轻Arg2LKO小鼠机体代谢正常

3.Arg2缺失促进肝细胞谷氨酰胺回补和还原性谷氨酰胺代谢

为了确定Arg2缺乏对肝细胞葡萄糖代谢的影响，研究人员对Arg2LKO小鼠肝原代细胞进行了[U-13C6]葡萄糖示踪，并进行质谱分析（图2A），结果显示Arg2缺失后肝细胞中M + 0、M + 3和M + 6葡萄糖-6-磷酸水平无显著变化，M + 0丙氨酸水平升高，而来自于葡萄糖的M + 3丙氨酸水平下降（图2B-2D），这提示Arg2缺失后肝细胞非葡萄糖产生的丙氨酸水平升高。

为了确定肝细胞Arg2缺乏是否会影响葡萄糖衍生的丙酮酸氧化，研究人员检测了TCA循环的中间代谢物中13C水平，结果显示，Arg2缺失后肝细胞中M + 2柠檬酸、M + 2苹果酸或M + 2天冬氨酸没有显著变化（图2E），表明Arg2缺失不会影响肝细胞中丙酮酸氧化过程。同时，研究人员观察到Arg2缺失后肝细胞中天冬氨酸和谷氨酸水平升高，且天冬氨酸与谷氨酸之比增加（小编注：葡萄糖可通过糖酵解途径生成丙酮酸，丙酮酸脱氢产生乙酰 CoA，乙酰 CoA 随后进入线粒体参与三羧酸循环，在三羧酸循环过程中，α-酮戊二酸和草酰乙酸作为中间产物可以脱离三羧酸循环，α-酮戊二酸通过转氨基作用接受氨基可生成谷氨酸，草酰乙酸可在谷氨酸-草酰乙酸转氨酶作用下生成天冬氨酸，此过程可逆。下文提及未标记13C的天冬氨酸和谷氨酸占比90%以上，这就表明Arg2缺失后肝细胞中天冬氨酸和谷氨酸积累并非来自葡萄糖。如果来自葡萄糖，其两者比例不至于出现差异）（图2F），其中未标记13C的天冬氨酸和谷氨酸占比90%以上（图2G），表明Arg2缺失后肝细胞中来自非葡萄糖衍生的天冬氨酸和谷氨酸积累。总之，这些结果显示Arg2缺失后肝细胞中来自非葡萄糖底物的代谢物水平增加。

接下来，研究人员探究肝细胞Arg2缺失是否促进谷氨酰胺回补过程，进而导致来自非葡萄糖底物的代谢物积累。研究人员对Arg2LKO小鼠肝原代细胞进行了[U-13C5]谷氨酰胺示踪，结果显示，Arg2缺失后肝细胞中M+0（未标记13C）谷氨酰胺和谷氨酸水平下降，M+5谷氨酰胺和谷氨酸水平升高，这提示Arg2缺失后肝细胞对谷氨酰胺的摄取和分解代谢增强（图2H-2J）（小编注：一方面肝细胞中M+0（未标记13C）谷氨酰胺和谷氨酸水平下降，说明谷氨酰胺的回补反应增强，因为谷氨酰胺通过一系列生化反应转化为α-酮戊二酸，进而进入三羧酸循环，被机体利用，故而其水平降低；另一方面，测肝细胞内M+5谷氨酰胺水平，则是为了检测Arg2缺失后肝细胞对谷氨酰胺的摄取能力，M+5谷氨酰胺水平升高则表明Arg2缺失后肝细胞对谷氨酰胺的摄取增加）。

谷氨酰胺分解为谷氨酸，并进入TCA循环中进一步氧化分解，谷氨酸首先氧化脱羧形成α-酮戊二酸，随后α-酮戊二酸去饱和生成延胡索酸，并经TCA循环产生苹果酸和天冬氨酸。结果显示，Arg2缺失后肝细胞中M + 5 a-酮戊二酸、M + 4延胡索酸、M + 4苹果酸和M + 4天冬氨酸水平显著升高（图2K），表明肝细胞Arg2缺失促进肝细胞中谷氨酰胺回补过程，进而促进TCA循环。用于脂肪酸生成的乙酰辅酶A主要由还原性谷氨酰胺代谢衍生的柠檬酸合成（图2L）。

研究人员推测，肝细胞Arg2缺失依赖于还原性谷氨酰胺代谢来产生乙酰辅酶A。结果显示，Arg2缺失的肝细胞中M + 5柠檬酸、M + 3天冬氨酸、M + 3苹果酸和M + 3延胡索酸水平显著升高（图2M），提示Arg2缺失后肝细胞中来自于谷氨酰胺的还原性碳水平升高，表明Arg2缺失后肝细胞通过还原性谷氨酰胺代谢合成乙酰辅酶A用于脂肪酸合成。随后，研究人员对Arg2Flox小鼠和Arg2LKO小鼠补充[U-13C5]谷氨酰胺，质谱检测肝脏和血清中13C标记的代谢物水平，结果显示，与Arg2Flox小鼠相比，Arg2LKO小鼠肝脏M+3天冬氨酸和M+3苹果酸水平没有被检测到，但M+5谷氨酰胺和M+5谷氨酸水平均呈升高趋势，且M+4天冬氨酸和M+4苹果酸水平也显著升高（图2O-N）。总之，体内和体外数据表明肝细胞Arg2缺失可促使肝细胞谷氨酰胺回补水平，并促进还原性谷氨酰胺代谢。

拓展阅读：回补反应‌

回补反应(anapleurotic reactions)是指某一代谢系统所必需，且继续为该代谢系统以外的系统消耗进行补充的物质反应，其是三羧酸循环正常进行所必需的。而谷氨酰胺回补反应是指谷氨酰胺通过一系列生化反应转化为α-酮戊二酸，进而进入三羧酸循环（TCA循环）的过程。三羧酸循环不仅为细胞提供 ATP，还为大分子合成提供前体物质，例如为糖异生提供苹果酸、为氧化磷酸化提供 NADH、为亚铁血红素合成提供琥珀酰CoA等。故而当谷氨酰胺增多的情况下，可促进三羧酸循环，提高三羧酸循环底物水平，进一步提高三羧酸循环下游代谢产物。正常情况下，谷氨酰胺增多走2H的谷氨酰胺氧化途径，当CO2浓度过高时，才会发生2L的谷氨酰胺还原途径，即反向TCA。

                         图2.稳定同位素示踪显示Arg2缺失的肝细胞中谷氨酰胺分解增强

4.Arg2缺失导致肝细胞中依赖TCA循环底物NAD+的线粒体氧化功能受损

由于在NASH患者和MASLD/MASH小鼠的肝脏中氧化磷酸化相关基因表达降低，且Arg2LKO小鼠肝细胞中TCA循环通量受损（小编注：肝细胞Arg2缺失后，谷氨酰胺代谢增强，促进TCA循环中间代谢物水平升高，且进一步检测发现还原性谷氨酰胺代谢产物水平升高，这条途径是逆于TCA循环的还原性反应（图2L-2M）。并且后续研究人员在Arg2缺失的AML12细胞中补充TCA循环底物NAD+，可恢复Arg2缺失的AML12细胞线粒体呼吸作用（图S3K和S3L），提示Arg2缺失可能损害了肝细胞TCA循环，进而抑制线粒体氧化代谢），这促使研究人员探究肝细胞Arg2对线粒体氧化功能的调控作用。在AML12 （小鼠肝细胞系）细胞系中，研究人员采用小干扰RNA （siRNA）、ASO靶向Arg2或非选择性精氨酸酶抑制剂ABH的方法抑制Arg2，结果显示，与对照组相比，抑制Arg2显著降低了AML12细胞的基础耗氧量、最大耗氧量，而线粒体DNA拷贝数水平无显著差异（图S3A-S3C）。随后，研究人员将Arg2 H160位点（Arg2的催化活性位点）突变为Arg2 H160F（抑制Arg2酶活性），结果显示，与过表达Arg2 WT的AML12细胞相比，过表达Arg2 H160F的AML12细胞显著抑制了基础耗氧量和最大耗氧量（图S3D和S3E）。这表明Arg2介导的尿素循环足以驱动线粒体氧化磷酸化。

在Arg2缺乏的肝细胞中TCA循环受损和谷氨酰胺回补增加（图2），研究人员推测肝细胞Arg2缺乏可能促进谷氨酰胺氧化。随后研究人员利用谷氨酰胺酶（GLS）抑制剂BPTES处理肝细胞，并检测肝细胞的线粒体功能。结果显示，BPTES处理显著降低了肝细胞的线粒体呼吸水平（图S3F和S3G）。此外，抑制Arg2后依赖于GLS介导的谷氨酰胺氧化的线粒体呼吸水平显著升高（图S3H）。这表明Arg2缺失的肝细胞更依赖谷氨酰胺来驱动线粒体氧化代谢。

接下来，研究人员探究了Arg2介导的尿素循环和线粒体氧化功能受损之间的关联机制。延胡索酸是尿素循环和三羧酸循环的共同底物，研究人员发现敲减Arg2显著降低AML12细胞的线粒体呼吸水平，而延胡索酸单甲基（MMF）或延胡索酸二甲基（DMF）处理以补充外源延胡索酸，并不能提高Arg2缺失的AML12细胞线粒体呼吸水平（图S3 I和S3G）。然而，烟酰胺单核苷酸（NMN） 处理以补充NAD+作为TCA循环代谢底物，可显著提高Arg2缺失的AML12细胞线粒体呼吸水平（图S3K和S3L）。这些数据表明，Arg2缺失介导的尿素循环受损，可通过抑制TCA循环代谢，降低线粒体呼吸水平。

拓展阅读：精氨酸酶（ARG）

精氨酸是精氨酸酶（ARG）的底物，是一种半必需氨基酸，可从饮食或内源合成途径中获得，是尿素、多胺、脯氨酸和谷氨酸等多种分子的前体。ARG负责催化精氨酸转化为尿素和鸟氨酸，此后鸟氨酸可通过尿素循环再转化为精氨酸，或在鸟氨酸脱羧酶（ODC）催化下转化为多胺，也可穿梭到线粒体中，在鸟氨酸转氨酶（OAT）的催化下合成脯氨酸和谷氨酸。ARG具有两个亚型：ARGⅠ和ARGⅡ。ARGⅠ主要定位于胞质，在肝脏中高表达，在少数其他组织如颌下腺也有少量表达；而ARGⅡ主要定位于线粒体中，在肾脏、脑、小肠、乳腺和巨噬细胞中表达，而在肝脏中表达量较低。ARGⅠ和ARGⅡ的亚定位不同与精氨酸代谢产物鸟氨酸的命运有关。胞质中ARGⅠ和ODC的共定位指导鸟氨酸作为多胺合成的底物；相反，线粒体中ARGⅡ与OAT的共定位使鸟氨酸作为脯氨酸合成的底物。

[1] Matos A, et al. Nutrients. 2021.

                                                      图S3.肝细胞Arg2调控线粒体呼吸

5.肝细胞ARG2缺失导致机体能量代谢与糖稳态受损

目前研究结果表明Arg2缺失介导的尿素循环受损会抑制TCA循环，进而导致线粒体功能障碍。因此，接下来研究人员探究尿素循环受损是否可诱发肝脂肪变性和胰岛素抵抗。研究人员将Arg2LKO小鼠与年龄匹配的同窝WT小鼠用正常饲料喂养长达22个月（图3A），结果显示，与WT小鼠相比，Arg2LKO小鼠体重体脂显著升高，而瘦肉质量无显著差异（图3B和3C）此外，Arg2LKO小鼠机体能量代谢水平显著下降，RER和活动量无显著差异（图3D-3F，S4A）；Arg2LKO小鼠机体糖稳态失衡，且胰岛素敏感性受损（图3G-3I）。

接下来，研究人员探究了Arg2LKO小鼠糖稳态受损是否可归因于Arg2LKO肝脏的谷氨酰胺回补水平升高。因此，研究人员利用靶向Arg2的siRNA或表达Cre重组酶的腺病毒处理Arg2Flox小鼠的原代肝细胞，葡萄糖饥饿3小时后用10 mM精氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸处理，并对细胞外葡萄糖进行量化。结果显示，谷氨酰胺或丙氨酸处理可显著提高Arg2缺失的原代肝细胞产生葡萄糖水平，而精氨酸处理不影响Arg2缺失的原代肝细胞产生葡萄糖水平（图3J）。总之，这些结果表明Arg2LKO小鼠的葡萄糖和胰岛素耐量受损，肝细胞葡萄糖输出水平增加（小编注：肝细胞Arg2缺失并不影响糖酵解以及丙酮酸氧化，而是通过促进谷氨酰胺回补促进丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸水平升高（Fig2A-G），其中丙氨酸可作为底物参与葡萄糖生成；此外肝细胞Arg2缺失还促进了还原性谷氨酰胺代谢（Fig2L），这一反应产生的乙酰辅酶A可被用于脂肪生成和葡萄糖生成。鉴于研究人员发现衰老Arg2LKO小鼠糖稳态受损，因此检测了Arg2对肝原代细胞的葡萄糖生成的调控作用）。

                                图3.老年Arg2LKO小鼠全身能量代谢和糖稳态受损，血脂异常

6.肝细胞Arg2缺乏促进小鼠肝脂肪变性

此前研究关于全身性Arg2 KO小鼠肝脏炎症和脂肪变性结果存在争议。因此，研究人员利用Arg2LKO小鼠模型来阐明Arg2在肝细胞中的特异性代谢功能。在衰老条件下，与WT小鼠相比，Arg2LKO小鼠肝脏重量显著升高，血甘油三酯水平升高，而血胆固醇、游离脂肪酸和低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）水平无显著差异（图4A-4C）；而Arg2LKO小鼠肝脏胆固醇水平显著升高，肝脏甘油三酯水平有升高趋势，游离脂肪酸水平无差异（图4D）；Arg2LKO小鼠肝脏脂质积累水平升高（图4E）。在衰老条件下，Arg2Flox小鼠血丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）或白蛋白水平与WT小鼠相比无显著差异（图S4B）。

衰老WT小鼠与Arg2LKO小鼠肝脏转录组学分析结果显示，WT小鼠相比，Arg2LKO小鼠肝脏共有188个显著上调的基因和252个显著下调的基因（图4F）。值得注意的是，Arg2LKO小鼠肝脏中与脂肪生成相关基因包括Fasn、Elovl6、Rgs16和Acly表达上调（图4F和4G）；且Arg2LKO小鼠肝脏中上调基因主要富集在脂肪酸代谢、脂肪酸链延伸、糖异生/糖酵解、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及TCA循环相关通路中（图4J）。RT-qPCR结果证实Arg2LKO小鼠肝脏中与糖异生、脂质转运、脂肪生成以及葡萄糖和谷氨酰胺代谢相关基因表达显著升高（图4K-4N）。总之，这些结果表明Arg2缺失可促进肝脏脂质积累和体重增加。

                                                          图4.Arg2LKO小鼠肝脏脂肪变性

                    图S4. 衰老Arg2LKO小鼠RER、活动量以及血清ALT、AST、白蛋白水平无差异

7.肝细胞Arg2缺乏促进小鼠发生饮食诱导的脂肪性肝炎

接下来，研究人员给8周龄WT小鼠和Arg2LKO小鼠饲喂HFFC饮食16周，构建NASH模型（图 5A），结果显示，与WT小鼠相比，Arg2LKO小鼠总体重没有显著变化，但Arg2LKO小鼠的体重增长率显著升高，总体脂量显著升高，而瘦肉质量无差异，肝重无显著差异（图5B-5D）。此外，在HFFC喂养下，与WT小鼠相比，Arg2LKO小鼠机体能量消耗下降，其中在光照期Arg2LKO小鼠机体能量消耗水平与WT小鼠的差异较黑暗期更大（图5E-5G）。与WT小鼠相比，Arg2LKO小鼠葡萄糖稳态和胰岛素敏感性受损（图5H和5I）；且Arg2LKO小鼠肝脏脂质积累水平升高，肝脏损伤加重（图5J-5L，S5A）；RT-qPCR结果表明Arg2LKO小鼠肝脏炎症水平升高，巨噬细胞浸润增加，肝纤维化水平升高，谷氨酰胺转运蛋白Slc1a5以及谷氨酰胺酶Gls1表达显著上调（图5M-5P）。由于HFFC饮食小鼠模型肝脏未发生纤维化，随后研究人员给WT小鼠和Arg2LKO小鼠饲喂西方饮食12周，并每周注射低剂量CCl4，以诱导WT和Arg2LKO小鼠发肝脏纤维化。纤维化评分结果显示，7只WT小鼠中有4只小鼠肝脏发生晚期纤维化，而9只Arg2LKO小鼠中有7只小鼠肝脏发生纤维化，评分为F2及以上（图S5B）。在西方饮食和CCl4处理下，与WT小鼠相比，Arg2LKO小鼠体重增加，摄食量无差异，肝重无差异，但肝脏胆固醇和LDL-C水平升高，血脂和血葡萄糖水平无明显差异，机体葡萄糖稳态和胰岛素敏感性受损，能量消耗显著下降，而机体RER、活动量无明显差异（图S5C-S5K）；Arg2LKO小鼠肝脏炎症水平升高。多胺生成和诱导型一氧化氮（iNOS）途径是潜在的精氨酸代谢途径，可能通过与精氨酸代谢酶竞争，调节肝脏炎症。然而，过表达Arg2小鼠和Arg2LKO小鼠肝脏的非靶向代谢组学结果显示，多胺水平并无明显差异（图S5M）。同样，在Arg2LKO小鼠肝原代细胞中，与对照组（siMock）相比，敲减Nos2抑制iNOS生成并不影响脂多糖和精氨酸刺激下肝原代细胞的炎症基因表达水平（图S5N）。这些数据表明，精氨酸代谢变化可能并不是引起Arg2LKO小鼠肝脏脂肪变性和纤维化的主要原因（小编注：iNOS可与ARG竞争性催化精氨酸代谢，iNOS/ARG比例升高可促进M1巨噬细胞激活和炎症发生。有研究表明Arg-/-小鼠肝脏中M1型巨噬细胞激活，并促进肝脏脂肪生成途径，促进肝脂质积累和纤维化的发生，而消耗Arg-/-小鼠肝脏巨噬细胞，可保护小鼠免受肝脂肪变性和纤维化（Navarro LA, et al. J Hepatol. 2015 ））。

拓展阅读：精氨酸代谢与多胺生成和iNOS途径

在肝脏中，精氨酸的合成与尿素循环紧密相连。尿素循环主要起始于线粒体，NH4+（铵离子）与HCO2-结合，在CPS1（磷酸氨甲酰合成酶1）催化下生成CP（磷酸氨甲酰），随后鸟氨酸在OTC（鸟氨酸转氨基甲酰基酶）催化下与CP反应生成瓜氨酸，瓜氨酸通过ORNT1（鸟氨酸转运蛋白1）转运到胞质中，在ASS1（精氨酸琥珀酸合成酶）的催化下，产生精氨酸。精氨酸分解代谢可产生多种代谢产物，如多胺和NO。一方面精氨酸在ARG的催化下转化为尿素和鸟氨酸，鸟氨酸可在鸟氨酸脱羧酶（ODC）催化下合成多胺；另一方面，精氨酸可在NOS（NO合酶）催化下转化回瓜氨酸，同时生成NO。催化NO合成的NOS有三种亚型：nNOS（神经元型）、iNOS（诱导型）和eNOS（内皮型），所有NOS亚型都可与ARG竞争性催化精氨酸产生NO和瓜氨酸。例如：在LPS刺激产生的炎症反应中，活化的M1巨噬细胞高表达iNOS，而在炎症消退过程中，巨噬细胞会高表达ARG1，从而争夺精氨酸，提高鸟氨酸及其下游代谢产物多胺的产生，减少NO的产生。

[1] Ghosh N,et al.Biochem Pharmacol. 2024. 

[2] Kashfi K, et al. Cells. 2021.

[3] Saluk-Bijak J, et al. Cells. 2021.

                                                   图5.肝细胞Arg2缺失促进肝纤维化发生

                                     图S5.HFFC饮食下，Arg2LKO小鼠肝脏脂质积累和纤维化

8.体内补充NAD+可改善Arg2LKO小鼠机体代谢稳态

前期研究结果发现补充NAD+可改善Arg2缺失后AML12细胞的线粒体功能，因此接下来研究人员探究补充NAD+是否可在体内改善Arg2LKO小鼠的肝脏损伤。首先，研究人员用NR（NAD+前体）处理AML12细胞（小编注：NAD+分子量大，很难通过细胞膜被细胞摄取，因此无法直接进行补充，通常通过补充NAD+前体，促进NAD+的合成转化来补充NAD+），结果显示NR处理可提高Arg2缺失后AML12细胞的线粒体呼吸水平（图6A和6B）。随后研究人员在饮水中添加浓度为3g/L的NR，给HFFC饮食的WT和Arg2LKO小鼠补充外源NAD+，结果显示，与WT小鼠相比，Arg2LKO小鼠肝脏线粒体呼吸水平下降，而补充NAD+可显著提高Arg2LKO小鼠肝脏的线粒体呼吸水平，并逆转Arg2LKO小鼠机体能量代谢下降和糖稳态受损表型（图6C-H）。

                                          图6.药理补充NAD+可改善Arg2LKO小鼠代谢稳态

9.前瞻性代谢组学预测人类受试者中的重度MASLD和MASH事件

为了探究人体组织中尿素循环调控对氧化代谢的预测能力，研究人员评估了人类肝活检来源的类器官培养物中带[U-13C5]谷氨酰胺标记的物质水平（图7A）。与健康供体来源的类器官相比，MASH衍生的类器官中每10^6个细胞中谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、苹果酸、柠檬酸和丙氨酸的总量增加，同时13C标记的谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、苹果酸和柠檬酸比例也显著升高（图7B和7C）。

接下来，研究人员进行了大规模队列研究，前瞻性地评估了UK Biobank中的118,461名参与者。这些参与者在发病前均通过核磁共振（NMR）定量检测了血清代谢物（图7D），并排除了已经患有肝病、酒精/药物相关疾病或数据记录不完整的参与者，最终共分析了106,606名参与者（图7E）。最终，按照国际疾病分类第十次修订（ICD-10）的标准，共有1,712名受试者确诊为严重的MASLD或MASH，从基线采血进行代谢组学分析到确诊为严重NAFLD的平均时间为 9.4 年。

在排除了年龄、性别、种族、社会经济地位、受教育程度、BMI、吸烟和酒精暴露等影响因素后，研究人员发现利用血糖、乳酸和丙氨酸浓度的五分位数能预测严重MASLD的发生（血糖HR五分位数= 1.54，95%置信区间[CI] 1.30-1.83,；乳酸HR五分位数 = 1.14，95% CI 0.95-1.37,；丙氨酸HR五分位数= 1.76，95% CI 1.46-2.13；图7F）。乳酸与丙酮酸比例的升高作为线粒体氧化功能受损的临床标志物，预示着受试者患严重MASLD的风险增加20%，以及患MASH的风险增加14%（MASLD HR五分位数= 1.20，95% CI 1.01-1.44；MASH HR五分位数= 1.14，95% CI 0.95-1.37；图7G，文中并未给出MASH相关图，仅有数据描述）。最后，研究人员发现与血浆天冬氨酸浓度位于最低五分位数的健康受试者相比，位于最高五分位数的受试者发生MASLD的风险升高了3.4倍（HR五分位数= 3.43，95% CI 2.82-4.18，图7H）。总之，这些发现表明，健康状况良好的受试者中氮代谢和氧化代谢受损的生物标志物，可以在疾病发生前近10年独立预测严重MASLD和MASH的发生。

                              图7.前瞻性代谢组学可预测人类中严重MASLD和MASH的发生

总结：  

本文中，研究人员首先通过人类受试者和小鼠模型发现肝细胞和肝脏中尿素循环与TCA循环、线粒体氧化磷酸化损伤之间可能存在关联。于是研究人员构建了肝细胞特异性精氨酸酶2缺失（Arg2LKO）的小鼠模型，发现Arg2LKO小鼠表现出轻度代偿性尿素循环缺陷。接下来，研究人员发现年轻Arg2LKO小鼠全身葡萄糖、脂质和能量代谢正常，但其尿素生成缺陷使得三羧酸循环（TCA）通量下降，进而损害线粒体氧化代谢，并诱发谷氨酰胺回补和天冬氨酸积累。然而老年Arg2LKO小鼠出现了体重增加、肝脏和外周脂肪积累、葡萄糖耐受不良、肝脏纤维炎症等不良代谢表现，补充NAD+前体烟酰胺核苷(NR)可以逆转这一代谢紊乱现象。此外，研究人员还发现在106606例人类患者中，血清中尿素循环、TCA循环和线粒体紊乱相关代谢物指标能够提前近10年独立预测严重的MASLD或MASH。综上，研究人员整合了体内外多组学模型和前瞻性人体代谢组学数据，通过TCA循环的分级调控将尿素循环、线粒体氧化代谢和代谢性肝病联系起来，可能为开发新的治疗策略提供了潜在的靶点。（小编注：作者首先用了13C标记的葡萄糖做代谢流检测来源于葡萄糖的TCA循环底物的变化，然而柠檬酸、苹果酸以及天冬氨酸等关键代谢产物均未显著变化。但却发现天冬氨酸和谷氨酸的含量却显著增加。而谷氨酸可通过产生α-酮戊二酸参与到TCA循环中，而谷氨酰胺可分解产生谷氨酸，因此作者使用标记的谷氨酰胺来做代谢流分析发现，Arg2LKO后，谷氨酰胺摄取及分解增强，且TCA循环关键代谢物的标记量显著增加，说明Arg2LKO后，TCA循环由谷氨酰胺参与的部分增强。进一步检测发现，谷氨酰胺参与TCA循环后导致了还原性谷氨酰胺代谢(即逆向于TCA的氧化反应)增强。这些结果说明，尿素循环受损后，TCA循环转变为主要由谷氨酰胺代谢供给，且还原性代谢增强。因此作者得出结论尿素循环受损后影响TCA通量）

链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S155041312400278X?via%3Dihub#sec4