博文
代谢学人——Cell Metabolism：米色脂肪新亚群，无效循环产热行
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撰文 | 李欣茜 郑宇含 张彦康 张婷 仲银召 李雨
编辑 | 孟美瑶
校对 | 张婷
研究背景
哺乳动物通过骨骼肌活动和其他代谢过程产生的热量来调控体温和机体能量消耗。然而当机体处于寒冷环境中，会诱发脂肪组织的额外产热机制，这些机制被称为“适应性产热”。
脂肪细胞主要存在两种形式：白色脂肪细胞和棕米色脂肪细胞，其中白色脂肪细胞通过合成代谢来储存脂质，而棕米色脂肪细胞通过分解代谢来消耗能量以产生热量。目前，棕米色脂肪细胞的特征是解偶联蛋白1（UCP1）的高表达，UCP1可通过消耗线粒体内膜上的质子梯度以产生热量，其活性受ATP或ADP的抑制。小鼠棕色脂肪组织是UCP1依赖性产热的主要组织，而在重复冷暴露(CE)条件下，可诱导小鼠腹股沟白色脂肪组织(ingWAT)转化为米色脂肪细胞，以发挥UCP1依赖性产热作用。然而，近年来研究发现，除了传统的UCP1依赖性产热机制外，棕米色脂肪细胞中还存在UCP1非依赖性产热机制。其中主要的 UCP1非依赖性产热机制是无效循环(FCs)，它利用各种底物(如肌酸和脂质)的循环导致ATP的净消耗。由此可见，UCP1依赖性产热途径和无效循环途径都需要依靠消耗线粒体膜电位中所包含的能量进行产热，这两个途径看似是一种竞争性的关系，而冷刺激不仅可激活棕米色脂肪细胞中UCP1产热途径，也可激活无效循环途径进行产热。那么，在棕米色脂肪细胞中UCP1依赖性产热和无效循环产热途径是如何共存的，目前尚不清楚。本研究利用snRNA-seq，确定了棕米色脂肪细胞中特定的细胞亚群P2，主要参与无效循环产热途径，阐明了UCP1依赖性和非依赖性产热细胞不同亚群特征之间的差异。
拓展阅读：UCP1抑制剂
UCP1可介导质子穿过线粒体内膜，将线粒体呼吸链与ATP产生解偶联，从而将质子的电化学梯度转化为热量。UCP1的活性可被嘌呤核苷酸（如ATP、ADP、GTP和GDP）抑制。2023年发表在Nature上的一项研究利用高分辨率冷冻电镜技术揭示了嘌呤核苷酸抑制UCP1活性的具体机制，结构显示UCP1具有6个跨膜螺旋结构（TM1-TM6），形成3个结构重复的序列，这些螺旋结构的协调运动驱使UCP1构象变化，从而介导质子的传递。而嘌呤核苷酸的结合诱导UCP1 TM2构象发生变化，使TM1/4/5/6构象向内弯曲，导致UCP1结构更加致密，从而抑制UCP1的质子传导活性。在寒冷刺激下，棕色脂肪细胞中GMPR（鸟苷酸还原酶）和AMPD（腺苷单磷酸脱氨酶）表达显著上调，促进嘌呤核苷酸降解，进而上调UCP1活性。UCP1活性除了受到核苷酸的抑制作用，还会受到其本身翻译后修饰的调控。有研究报道UCP1是Sirt5（去乙酰化酶5）的底物，BAT组织特异性敲除Sirt5后，UCP1的琥珀酰化水平显著升高，促使UCP1蛋白稳定性和活性显著下降。也有研究表明UCP1 C253（第253位半胱氨酸）是UCP1活性的关键调控位点，ROS可使UCP1 C253位点发生亚璜酰化修饰，从而激活了UCP1的产热能力；而UCP1 C253A突变可在不影响线粒体电子传递链功能的情况下特异性抑制UCP1的产热作用，促使小鼠系统性炎症的发生和代谢紊乱。[1] Kang Y, Chen L. Nature. 2023 Aug. [2] Fromme T, et al. Mol Metab. 2018 Feb. [3] Wang G, et al. Mol Cell. 2019 May. [4] Chouchani ET, et al. Nature. 2016 Apr. [5] Mills EL, et al. Cell Metab. 2022 Jan.
研究表明棕米色脂肪细胞对机体代谢有着积极的影响，包括全身葡萄糖耐量和胰岛素敏感性、抵抗肥胖、缓解WAT炎症和肝脂肪变性等方面，然而棕米色脂肪的适应性产热过程在人体中并没有被明确定义。有研究利用PET/CT证实人体中存在代谢活跃的棕米色脂肪细胞，然而在成人脂肪组织的活检（小编注：在Cell Rep, 2018研究中检测了年龄22-73岁之间的18例患者深颈部脂肪组织和颈部切口处的皮下脂肪组织样本；在Cell Metab, 2013研究中检测了年龄22-84岁之间的21名患者锁骨上的脂肪样本）中发现UCP1表达量只呈中等水平，这表明人类中存在独立于UCP1的产热脂肪细胞。
目前研究在表征棕色脂肪组织的脂肪细胞亚群，以及肥胖条件下腹股沟和内脏脂肪组织的脂肪细胞亚群方面取得了很大的进展，但对腹股沟脂肪细胞中产热细胞亚群的特征还不明确。因此，在本篇文章中研究人员利用snRNA-seq技术探究了脂肪细胞的异质性以表征产热脂肪细胞亚群。
敲黑板啦！
1.snRNA-seq揭示了小鼠响应RT和CE的不同脂肪细胞亚群
2.P2脂肪细胞是一个新的细胞亚群，具有产热功能
3.P2脂肪细胞可能利用无效循环进行UCP1非依赖性的产热
4.人类P2样脂肪细胞与能量消耗和代谢健康相关
研究结果
1.单核RNA测序揭示了ingWAT脂肪细胞的异质性
研究人员首先构建了表达带有Adipoq启动子的RFP蛋白（核红色荧光蛋白）的转基因小鼠模型，并对其腹股沟脂肪细胞进行了单核RNA测序（snRNA-seq）（图S1A）。利用RFP作标记，研究人员在室温（RT）饲喂的小鼠腹股沟脂肪组织（ingWAT）中捕获并分析了9159个高质量的脂肪细胞核（图S1A和S1B），并确定为5个脂肪细胞亚群，分别命名为RT0至RT4（图S1B）。经检测，所有脂肪细胞亚群都表达典型脂肪细胞标记物，如Adipoq和Lipe（图S1C）（小编注：本文使用能表达带有Adipoq启动子的RFP蛋白的小鼠进行单细胞测序，先利用RFP的红色信号分选并收集细胞，再进行后续的测序分析，这样可以降低来自非脂肪细胞数据的干扰，便于分析）。
此前的研究结果表明，长时间的冷暴露（CE）会增强脂肪组织的产热潜力，能改变ingWAT转录谱并诱导米色脂肪细胞出现。因此，研究人员对冷暴露（8℃）4天（CE4）和7天（CE7）的小鼠ingWAT进行了单细胞核测序。随后，对RT、CE4和CE7小鼠脂肪细胞细胞核进行分析，研究人员发现共有10个脂肪细胞亚群，并将其记为P0-P9（图1A）。这10个亚群均表达经典脂肪细胞标志物Adipoq和Lipe（图1B和S1D），其中P0、P3、P6亚群的Ucp1表达量非常低，P1、P4、P7、P8、P9亚群不表达Ucp1，说明它们代表白色脂肪细胞（图1B）。值得注意的是，通过CE鉴定出两个米色脂肪细胞亚群（P2和P5），这表明米色脂肪细胞可以进一步细分为不同的亚群（图1A和1B）。（小编注：文章中没有具体解释，为何S1B和1A里来自RT的降维图有差异，照理都是一样的样本。此前RT测出来5个亚群，这里的样本测出来10个亚群，但从图1A中也可以看出，RT组的P6、P7、P9亚群丰度都较低，而P0、P3比较接近，P2、P5比较接近，再加上P1、P3和P8也正好是5个亚群。可能由于单独用RT组的样本会由于某些亚群的数量较少，在分析中无法单独成群。而第二个图降维图增加了CE4和CE7的样本，3种模型联合分析的情况下，才足以降维出10个亚群。）
为了研究不同的脂肪细胞亚群，研究人员首先在不同细胞亚群间进行了差异表达基因（DEG）分析，以确定每个亚群的特定标记（图1C和S1E）。结果表明，在白色脂肪细胞亚群中，St3gal6和Trhde在P0中高表达，Alcam和Gulp1在P1中高表达，Sh3kbp1在P3中高表达，Nnat和Npr3在P4中高表达，Gria4在P6中高表达,Fam20a、Gsg1l、Gas6和Irs2在P7中高表达，Irs2和Gas6在P8中高表达。Pdgfra和Cd34仅在P9中表达（图1C和S1E）。在米色脂肪细胞亚群中，Atp5k、Atp5e、Cox7a1和Lgr6是P2的特异性标记（图1C、1E和S1F），而Ttc25、Adrb1、Hmgcs1和Pygl被鉴定为P5的标记（图1C和S1G）。
接下来，研究人员进行了更详细的基因表达分析以深入了解各种亚群的潜在功能。研究人员发现P0是CE下变化最突出的白色脂肪细胞亚群（图1D），它富含甘油三酯和脂肪酸代谢途径相关基因（图S1J），表明这些脂肪细胞可能响应CE并参与调控脂质代谢。P1是最丰富的白色脂肪细胞亚群之一，对寒冷刺激无响应（图1D）。而对P1中前50个DEGs的GO分析表明，P1是胰岛素和激素应答的脂肪细胞亚群（图S1I），可能维持白色脂肪组织对营养状况的响应能力。P3亚群显示出许多与P0相同的标记，但P3亚群在RT组中丰度较高而P0亚群在RT组中丰度较低，在CE4或CE7组中P3亚群和P0亚群丰度又与RT组刚好相反，表明P3亚群虽然保留了P0脂肪细胞的固有特性，但在RT时表现出其特有的状态。在P4亚群中Nnat和Car3高表达，而Acly表达较低（图S1H），表明P4与先前报道的脂质清除脂肪细胞（LSAs）亚群相似。P6是一个较小的脂肪细胞簇，其富集途径与P0相似（图S1K）， 还伴随着Gria4的差异表达（图1C）。P7和P8有许多相同的标记物（图 S1L），表明这两个亚群可能代表同一脂肪细胞亚群在不同温度条件下的两种功能状态。
随后，为了研究米色脂肪细胞亚群的独特特征，研究人员对P2和P5进行了DEG分析，发现P2亚群表达了与偶联呼吸相关的基因（如Atp5k、Atp5e、Atp5j2、Uqcrq、Uqcr10、Uqcr11、Cox7a1、Cox8b和Ndufa3）（图1E和S2A）。此外，P2还表达了Gk、Pck1和Pdk4等参与甘油生成的基因（图S2A）。最后， GO分析显示，P2亚群主要与氧化磷酸化（OXPHOS）、ATP生成和甘油三酯生物合成过程有关（图1F）。综上所述，研究人员发现P2是一种新的分解代谢脂肪细胞亚群，富含编码呼吸链、ATP代谢过程和甘油三酯代谢途径的基因。
图1.snRNA-seq分析揭示了小鼠ingWAT响应CE的不同脂肪细胞亚群
图S1.通过snRNA-seq表征小鼠腹部脂肪细胞亚群
2.P2脂肪细胞的表征
为了研究P2脂肪细胞是否能区别于其他脂肪细胞，接下来研究人员在小鼠模型中分析了P2最主要的标记基因Atp5k（Atp5k是一个核基因编码的ATP合成相关亚基）的表达。首先，研究人员构建了脂肪细胞特异性敲除Atp5k小鼠模型（Atp5k AKO）（图S2D），并通过检测基因表达和ingWAT免疫荧光染色证实了Atp5k的敲除情况（图S2E-F）。免疫染色结果显示，在表达Atp5k的CE4小鼠ingWAT中，Atp5k与TOMM20标记的线粒体存在共定位现象（图S2H）。随后，研究人员发现与SVF细胞相比，CE4小鼠ingWAT的成熟脂肪细胞中Atp5k表达显著升高（图S2G）。此外，免疫染色结果显示，Atp5k与内皮细胞标志物CD31不共定位（图S2I）。这些结果表明Atp5k是P2脂肪细胞的特异性标志物。为了准确定位P2脂肪细胞，研究人员构建了Ucp1-Dtr-eGfp小鼠（在UCP1启动子的调控下表达Dtr-eGfp融合蛋白）（图S2J），通过在CE4小鼠ingWAT中进行免疫荧光染色，研究人员观察到明显的Atp5k+（P2）脂肪细胞群（图1G），并且P2脂肪细胞在整个ingWAT上分布并不均匀（图1G-1I），主要分布在淋巴结附近及背部区域（图1I）。值得注意的是，研究人员观察到P2脂肪细胞主要由Ucp1_脂肪细胞组成，这表明Ucp1的表达并非P2脂肪细胞的特征（图1G-1J）。虽然有报道称Ucp1 mRNA可用于评估组织对冷刺激的反应性，但细胞的产热能力实际取决于UCP1蛋白的含量。有研究表明，Cpeb2可以激活Ucp1 mRNA 3’UTR区域翻译，从而促进蛋白产生，而在小鼠中缺失Cpeb2会导致UCP1蛋白水平降低和产热功能受损，这表明Ucp1 mRNA水平和蛋白水平之间的差异可能是3’UTR区域翻译效率改变造成的。值得注意的是，研究人员发现P2脂肪细胞中Cpeb2的表达水平明显更低（图S2K和S2L）。此外，Atp5k+和Cpeb2+脂肪细胞不属于同一细胞亚群（图S2M），这表明大多数P2脂肪细胞可能是由于缺乏Cpeb2从而不表达UCP1。接下来，通过免疫荧光共染色，研究人员发现CE4小鼠ingWAT中Atp5k和酪氨酸羟化酶（TH）的定位存在联系，表明P2脂肪细胞的激活可能类似于经典米色脂肪细胞激活方式（图S2N）。由于P2脂肪细胞的标记基因主要富集于OXPHOS相关通路，研究人员对OXPHOS和Atp5k进行了共染色，发现二者明显共定位，这表明P2脂肪细胞可能具有依赖于OXPHOS的分解代谢功能，而不依赖于解偶联能量耗散（图2A）。总之，研究人员证明除了经典的米色脂肪细胞外，ingWAT还含有一群异质的分解代谢性脂肪细胞（即P2）。
拓展阅读：UCP1翻译调控机制
目前报道的文献还较少，根据已有报道， UCP1翻译调控主要有以下几种机制：（一）IMP2是一种RNA结合蛋白（RBP），IMP2能结合多种基因的mRNA并调控其翻译，如以结合Igf2 mRNA 5’-UTR区域上IRES元件的方式稳定Igf2 mRNA与核糖体的结合，从而促进Igf2（胰岛素样生长因子2）翻译。此外，IMP2也能抑制Ucp1 mRNA的翻译。有文献报道，SIRT7可以促进IMP2去乙酰化，增强其活性，促进IMP2结合到UCP1的UTR区域并抑制其翻译，但目前IMP2具体通过什么机制调控Ucp1翻译仍不明确。
（二）小鼠Ucp1 mRNA具有不同翻译效率的3’-UTR，分为长3’-UTR（Ucp1L）和短3’-UTR（Ucp1S），人类Ucp1仅存在Ucp1L的形式。Ucp1L相比于Ucp1S主要是具有较长的3’-UTR序列，因此通常含有更多的调控元件，从而影响Ucp1 mRNA的稳定性、翻译效率等。比如人和小鼠的Ucp1L中存在2-3个细胞质多聚腺苷酸化元件（CPE），它们可被胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白（CPEB）家族识别并结合。CPEB蛋白为RNA结合蛋白，其中CPEB2可以与Ucp1L上的CPE结合，增强其多聚腺苷酸化，即增长PolyA尾，延长的PolyA尾可以促进mRNA与翻译起始因子的结合，从而提高翻译效率。除促进UCP1翻译外，CPEB2还可通过此机制促进一些其他具有该元件mRNA的翻译如Hif1α、Pdgfrα等。此外，也有研究发现CPEB2可结合CPE元件抑制翻译，如结合到SSTR3 mRNA的3’UTR区域上的CPE元件，并减少PolyA尾长度，从而抑制其翻译，但尚不清楚为什么CPEB2结合到不同mRNA的CPE元件上会发挥相反的作用。
拓展阅读：经典米色脂肪细胞激活方式
米色脂肪细胞是一类具有可塑性的脂肪细胞，在基础状态下通常表现出白色脂肪细胞的特征，线粒体和UCP1较少，而在受到刺激时可被激活，产生较多的UCP1和线粒体，产热能力显著加强。米色脂肪细胞的经典激活方式是在寒冷刺激下，温度感受器将信号传递到下丘脑，激活交感神经，交感神经末端释放去甲肾上腺素（NE）。NE与米色脂肪细胞上的β3-肾上腺素能受体（β3-AR）结合，促甘油三酯水解并激活cAMP信号通路。cAMP激活下游效应分子蛋白激酶A（PKA），活化的PKA通过磷酸化CREB（cAMP 反应元件结合蛋白）招募PGC-1α，然后PGC-1α与PPAR和RXR 等受体相互作用，促进UCP1基因转录。最终，在激活的米色脂肪细胞中，线粒体中UCP1表达显著上调，促进机体产热。
图S2.P2亚群的整合分析：snRNA-seq标记物识别及小鼠ingWAT的空间分布
3.P2脂肪细胞利用无效循环
据报道，缺乏UCP1会诱导ATP代谢过程和无效循环（FCs）。同时，有研究表明在缺乏UCP1的情况下进行CE，可以观察到多房脂肪细胞数量显著增加。为了探究敲除UCP1是否影响小鼠P2脂肪细胞数量，研究人员通过转录组学分析，发现与野生型（WT）小鼠相比，CE显著促进了UCP1敲除（UCP1 KO）小鼠中Atp5k, Atp5e和Cox7a1的表达（图2B）。为了进一步验证RNA-seq的结果，研究人员对UCP1 KO小鼠逐步CE处理，并对其ingWAT进行snRNA-seq，最后将数据与CE4 WT小鼠的ingWAT的snRNA-seq数据联合分析（图2C）。snRNA-seq结果表明与CE4 WT小鼠相比，CE后UCP1 KO小鼠ingWAT中P2脂肪细胞数量增加（图2D），提示P2脂肪细胞的形成可能是为了补偿UCP1的缺失。考虑到P2脂肪细胞中富集了ATP代谢过程（图1F），以及UCP1 KO小鼠中P2脂肪细胞数量增加，研究人员试图探究P2脂肪细胞是否利用ATP依赖的呼吸机制。因此，研究人员将UCP1 KO小鼠和WT小鼠ingWAT的血管基质组分（SVF）分离培养并分化为原代脂肪细胞，其由Atp5k+和Atp5k_脂肪细胞组成（图S3A），并用siRNA敲低Atp5k的表达（图S3B和S3C）。qPCR检测结果表明，敲低Atp5k不影响脂肪细胞的分化（图S3E）。然而，与对照组相比，在UCP1 KO原代脂肪细胞中，敲低Atp5k抑制了异丙肾上腺素（iso）处理后的耗氧率（OCR）水平，而基础OCR水平没有明显变化（图2E）。与此一致，UCP1 KO原代脂肪细胞中，Atp5k敲低也显著抑制了iso处理后的ATP水平（图2F），这表明iso处理的情况下，P2脂肪细胞的呼吸作用主要用于合成ATP。有趣的是，敲低Atp5k并没有改变WT原代脂肪细胞的OCR水平（图S3D），这可能是由于UCP1的补偿作用（图S3E）。为了进一步探究P2脂肪细胞中富集的ATP依赖性FCs，研究人员首先对P2 snRNA-seq中FCs相关基因进行了热图富集分析（图S3F），观察到甘油三酯合成相关的FCs基因（如Gk、Gpat3、Pck1、Gpd1、Gpd2、Pdk4）在P2脂肪细胞中富集。随后，为了区分P2与Ucp1+细胞，研究人员利用了Ucp1-Dtr-eGfp小鼠，在其ingWAT中进行Atp5k或OXPHOS的免疫荧光染色，并同时与FCs标记基因（CKMT2和GK）共染色，结果表明CKMT2和GK与P2或OXPHOS明显共定位（小编注：CKMT2是线粒体肌酸激酶（CK） 的主要同工酶，参与了依赖肌酸的底物循环，是肌酸FC的标志物；甘油激酶（GK）催化甘油生成3-磷酸甘油，是脂质FC的标志物。）（图2G, 2H和S3G）。接下来，为了探究P2脂肪细胞是否利用FCs，研究人员使用药物抑制关键FCs组分，并检测UCP1 KO小鼠原代脂肪细胞的OCR水平。当使用肌酸类似物（B-GPA）或组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP）抑制剂抑制肌酸FCs时，UCP1 KO原代脂肪细胞中OCR水平明显下降（图2I-2K）。有趣的是，敲低Atp5k后，B-GPA或TNAP抑制剂处理并没有进一步抑制OCR（图2L和2M），这表明Atp5k是肌酸FC所必需的。此外，脂肪分解产生的脂肪酸除了用于产生ATP外，还可用于驱动另一种FC——脂质FC。研究人员观察到抑制脂肪细胞甘油三酯脂肪酶（ATGL）或激素敏感性脂肪酶（HSL）可显著减少UCP1 KO脂肪细胞OCR水平（图S3H和S3I）。同样的，在敲减ATP5K后，抑制ATGL或HSL并没有进一步抑制OCR（图S3H-S3J）。随后，研究人员给CE小鼠注射BODIPY FL C16 （Fluo-Alb-FS，带有绿色荧光的脂肪酸），发现大部分Atp5k阳性的脂肪细胞都呈现出Fluo-Alb-FS阳性（图S3K），说明P2脂肪细胞可能需要脂肪酸参与脂质FC。综上所述，P2脂肪细胞中富集了肌酸FCs和脂质FCs，而Atp5k是驱动这些FCs循环的必要条件。
图2.P2脂肪细胞利用无效循环
图S3.P2脂肪细胞的无效循环
4.P2脂肪细胞数量减少或敲除Atp5k会抑制产热
接下来，研究人员进一步探究了小鼠对CE的生理反应中P2脂肪细胞潜在的产热功能。首先，研究人员构建了AAV8-Atp5k_loxP_3xstop_loxp-Dtr （AAV-DTR）和AAV8-Atp5k-loxp_3xstop_loxp-eGfp （AAV-GFP）系统，该系统能够在ATP5k启动子和Cre的驱动下启动，从而在P2脂肪细胞中特异性过表达DTR或eGFP（小编注：这两种病毒的构建都是在Atp5K启动子和目的基因（DTR或eGFP）间加上了“终止盒”——loxp_3xstop_loxp，然后在adipo-cre表达的情况下，在脂肪细胞中特异性切除终止盒，从而促进DTR或eGFP表达，但由于带有Atp5k启动子，因此目的基因只能在P2脂肪细胞中表达）（图S4A）。研究人员分别在Adipo-Cre小鼠的ingWAT中注射AAV-DTR或AAV-GFP，并利用白喉毒素（DT）诱导，在AAV-DTR小鼠中特异性敲除P2脂肪细胞（图3A）。，并在注射4周后，进行4天CE处理，并在第5天起连续两天给小鼠注射DT（图3A）。qPCR结果显示AAV在小鼠脂肪细胞中特异性表达（图3B）。值得注意的是，在AAV-GFP小鼠中，eGFP的表达完全与ATP5K共定位（图3C），与其他白色脂肪细胞亚群没有重叠（图S4B和S4C）。免疫荧光染色显示，AAV-DTR小鼠ingWAT中P2脂肪细胞亚群数量减少（图3C-D和S4D）。此外，在缺乏P2细胞的前部区域，脂肪细胞的数量没有改变，再次验证了AAV-DTR系统的特异性（图3D）。
接下来，研究人员分析黑暗周期DT给药前后AAV-GFP小鼠组的耗氧量，以及两组AAV小鼠在注射DT前的耗氧量，发现注射DT和不同AAV系统均不影响小鼠耗氧量（图3E）。此外，研究人员还观察到在黑暗周期，与AAV-GFP小鼠相比，注射DT后AAV-DTR小鼠的耗氧量明显降低。同样的，与注射DT前相比，注射DT也显著抑制了AAV-DTR小鼠的耗氧量（图 3E）。随后，研究人员测量了小鼠在不同时间点的核心体温，发现缺少P2脂肪细胞的AAV-DTR小鼠在至少8小时内无法维持核心体温（图3F）。AAV-DTR小鼠核心体温恢复到基线的现象，可能是由于棕色脂肪组织中UCP1水平增加，补偿了Atp5k敲除后P2脂肪细胞介导的产热功能的丧失（图S4E）。
接下来，研究人员进一步探究ATP5K本身是否有助于能量代谢。研究人员发现，与对照组相比，在CE 3天时，Atp5k AKO小鼠的耗氧量和体温降低，表明其产热功能受损（图3G和3H）。然而，CE 4天时，Atp5k AKO小鼠耗氧量与对照组无明显差异（图S4F）。因此，研究人员的数据表明，缺少P2脂肪细胞会导致CE后的产热反应受损。为了进一步研究P2脂肪细胞的功能，研究人员构建了类似于上述AAV系统的Atp5k启动子驱动的Dtr-eGfp慢病毒系统，用于在体外消融P2脂肪细胞（图S4G）。研究人员培养并分化了SVF细胞，在分化第4天时转入pLenti-Atp5k-Dtr-eGfp，在病毒转入5天后，用iso刺激脂肪细胞以模拟冷刺激，并用DT处理以消融P2脂肪细胞，并进一步检测OCR水平（图S4H和S4I）。结果表明，缺失P2脂肪细胞显著抑制了OCR水平（图S4J），因此体外实验结果进一步证实了研究人员先前在体内的发现，表明P2脂肪细胞在刺激下参与产热。
图3.缺失P2脂肪细胞抑制CE期间的产热
图S4.P2脂肪细胞参与产热
5.P2脂肪细胞对UCP1的依赖性
此前的研究表明，缺失Ucp1+米色脂肪细胞不影响全身能量代谢，并且UCP1 KO小鼠能够适应逐步CE，表明Ucp1+脂肪细胞在产热中不是必要的。在人类中，UCP1 mRNA的表达水平的个体差异很大，并且与PET/CT葡萄糖摄取数据无关，但大多数人在轻度CE时都具有代谢活跃的脂肪组织，特别是在寒冷季节，这表明人类可能利用不依赖UCP1的方式产热。有研究表明UCP1 KO小鼠的ingWAT脂肪细胞可能与人类类似（小编注：研究人员为了模拟人类脂肪细胞，将小鼠置于接近人类的热中性及营养条件下培养至中年，构建生理性人源化小鼠。经 WB 实验证明，无论是在生理性人源化小鼠，还是冷适应后的生理性人源化小鼠的ingWAT中都没有检测到 UCP1。因此作者认为UCPI KO小鼠的ingWAT脂肪细胞可能与人类类似），并且UCP1 KO小鼠的ingWAT富含Atp5k和OXPHOS相关基因（图2B和S4k），因此研究人员继续探究了P2脂肪细胞是否在UCP1 KO小鼠的产热过程中发挥作用。研究人员再次利用上述AAVs系统（图S4A），向UCP1 KO小鼠ingWAT中注射AVVs 4周后，将小鼠逐步CE 12天，随后连续注射DT 2天（图S4L），以特异性消除UCP1 KO小鼠ingWAT中的P2脂肪细胞（图3I）。值得注意的是，研究人员发现在黑暗周期中，与AAV-GFP小鼠相比，注射DT后的AAV-DTR小鼠耗氧量显著降低（图3J），并且AAV-DTR小鼠核心体温降低超过24小时（图3K），这表明没有P2脂肪细胞的UCP1 KO小鼠无法维持正常的核心体温。为了进一步研究缺失Ucp1时Atp5k的功能，研究人员构建了同时缺失Atp5k和Ucp1的小鼠（图S4M），并发现缺失Atp5k显著抑制了UCP1 KO小鼠的耗氧量和核心温度（图3L-M），这表明在UCP1缺失的情况下，缺失Atp5k的小鼠无法维持正常体温。总之，这些结果证实了P2脂肪细胞的能量耗散能力，并提示在缺乏Ucp1的情况下，P2脂肪细胞在产热中具有重要作用，并且表明了P2脂肪细胞是在CE反应中形成的分解代谢性脂肪细胞亚群。
6.人颈部深层脂肪组织中P2样脂肪细胞的数量与寒冷诱导的产热密切相关
由于UCP1 mRNA表达水平在人类中个体差异较大，研究人员对CE诱导的P2脂肪细胞在人类脂肪库中是否存在及其产热重要性存疑。据报道，人类颈部深层脂肪组织中OXPHOS相关基因高表达，可以利用解偶联和偶联呼吸。此外，体外分化的米色人类多能脂肪来源干细胞（hMADSCs）能通过UCP1和ATP依赖性机制产热。这些证据提示人体中可能也存在P2脂肪细胞，为了探明这一点，研究人员将hMADSCs分化为米色或白色脂肪细胞，发现其均由Atp5k+和Atp5k_脂肪细胞组成（图4A）。接下来，研究人员用siRNA敲低米色和白色脂肪细胞中的Atp5k（图S5A和S5B），发现敲低Atp5k显著抑制了米色脂肪细胞的OCR水平（图4B），同时还抑制了米色脂肪细胞中ATP依赖性氧消耗（图S5C）。这些结果表明，人类米色脂肪细胞中存在功能保守的P2脂肪细胞亚群，能在体外促进细胞代谢活性。
为了进一步研究人类脂肪细胞的异质性并表征P2脂肪细胞，研究人员对颈部手术中收集的人类颈部皮下脂肪组织（小编注：作者没有具体讲是颈部哪里的皮下以及皮下多深的脂肪组织，但结合与“深层脂肪”的对比，我们认为本文中颈部皮下脂肪组织应该是指浅层的、更靠近皮肤的脂肪组织）进行了snRNA-seq（图4C），并结合此前的人类颈部深层脂肪组织（小编注：深层脂肪组织是来自椎旁或甲状腺外侧的脂肪组织，文中说是从甲状腺手术中获得的）的snRNA-seq数据进行分析（图4D）。聚类分析在人类颈部皮下脂肪组织中识别出13个由SingleR（对snRNA-seq数据进行细胞类型自动注释）注释的聚类（图4C和S5E），在人类颈部深层脂肪组织中识别出12个聚类（图4D）。为了进一步分析脂肪细胞亚群，研究人员对来自人类颈部皮下的3293个脂肪细胞进行了一轮聚类分析，鉴定出 7个亚群（HP0-6）（图4E、S5F和S5G）。同样，研究人员从来自人类颈部深层脂肪组织的3607脂肪细胞中鉴定出8个亚群（H-Ad-1-8）（图4F）。值得注意的是，在人类颈部深层和皮下脂肪细胞中几乎均未检测到UCP1+脂肪细胞（图4G和S5H）。有趣的是，Atp5k+人类脂肪细胞构成了一个单独的聚类（H-Ad-3），并且H-Ad-3与小鼠P2脂肪细胞相似，高度保守地表达ATP5K, ATP5E, COX7A1, TPT1和SLC26A3等基因（图4H-I和S1F）。接下来，为了探究H-Ad-3激活的途径，研究人员对H-Ad-3亚群中所有富集的基因进行通路富集分析，发现与P2脂肪细胞相似，H-Ad-3亚群中的基因与OXPHOS和ATP生成通路密切相关（图4J）。这些数据表明，Atp5k+脂肪细胞在小鼠和人类产热脂肪组织中潜在的功能保守的细胞类型。为了探究在人类其他脂肪库中是否也有H-Ad-3，研究人员利用人类颈部深层脂肪细胞的标记基因分析了颈部皮下脂肪组织库的细胞分布，特征图显示H-Ad-3脂肪细胞也存在于颈部皮下脂肪库中（图4K），颈部皮下脂肪库中的HP6亚群可能包含了H-Ad-3亚群。H-Ad-1亚群中富集了Adrb1、Hmgcs1和Pygl基因（图S1G和4L），提示这些细胞可能与小鼠P5脂肪细胞有关。免疫荧光染色结果表明，在人类颈部深层脂肪组织中有大量的Atp5k+脂肪细胞，而在颈部皮下脂肪组织中则较少（图5A）。
由于H-Ad-3细胞可能是人类脂肪组织中的一种分解代谢脂肪细胞亚群，研究人员想探究H-Ad-3细胞是否可能促进人类颈部深层脂肪组织中寒冷诱导的能量消耗和产热。因此，研究人员进行了一项前瞻性临床试验，分析了15名健康志愿者在轻度CE前后的产热参数（产热、能量消耗、耗氧量和二氧化碳产生），并通过PET/CT检测了CE后进入锁骨上棕色脂肪组织的18-氟脱氧葡萄糖（18FDG）与细胞群或UCP1表达之间的相关性。此外，研究人员还分析了人类颈部深层脂肪组织的RNA-seq数据，并利用CIBERSORTx算法，通过人类颈部深层脂肪组织中所有snRNA-seq细胞群对RNA-seq矩阵进行去卷积（TPM）（小编注：由于我们通常的转录组测序是混合细胞群的RNA测序，即bulk RNA-seq，提供的是不同细胞群的整体表达谱，而去卷积的目的是以单细胞/单细胞核测序为基础，在bulk RNA-seq数据中分离识别和量化不同细胞群的相对丰度，可以理解为利用已有的少量单细胞数据中不同细胞marker对bulk RNA-seq数据进行分析，从中分出不同细胞亚群。适用于无法进行单细胞测序，但又需要进行细胞组成分析的情况。该去卷积算法可以通过显示出bulk RNA-seq数据中不同细胞群的比例/评分来分析bulk RNA-seq的细胞群组成）。去卷积估算了每个人体样本中所有细胞群的比例/评分，结果显示在人类颈部深层脂肪组织中有8个脂肪细胞亚群（图5B）。此外，这15名参与者均有H-Ad-3脂肪细胞，表明H-Ad-3亚群在不同个体间是稳定存在的。接下来，研究人员评估了细胞比例/评分或UCP1表达与上述产热参数之间的相关性（图5C），发现H-Ad-3细胞的丰度与寒冷条件下的能量消耗和耗氧量均呈正相关（图5C和5D）。尽管寒冷诱导的UCP1 mRNA表达与能量消耗和耗氧量也有正相关趋势（图5C和5E），但只有30%的参与者具有可检测到的UCP1表达水平（TPM > 20）。综上所述，这些结果表明人体中寒冷诱导的产热作用部分依赖于H-Ad-3脂肪细胞。（小编注：这里的15人和下面的1099人的脂肪做的都是RNA-seq。以已有snRNA-seq数据中不同细胞marker为基础，通过CIBERSORTx算法对这15人和下面1099人的脂肪RNA-seq进行去卷积，就能从RNA-seq中分析出不同细胞亚群组成的丰度）
图4.P2脂肪细胞在人类颈深部脂肪组织中是保守的
图5.H-Ad-3脂肪细胞与冷诱导生热倾向和系统代谢健康相关
图S5.人体内的H-Ad-3脂肪细胞类似于P2脂肪细胞
7.H-Ad-3脂肪细胞与人体全身代谢有关
据报道，ATP依赖的产热途径可能调节全身葡萄糖稳态和抵抗肥胖。本文研究结果表明，P2脂肪细胞可能作为分解代谢脂肪细胞参与人体代谢健康，研究人员旨在确定H-Ad-3脂肪细胞的丰度是否与人体代谢健康参数(如年龄、糖化血红蛋白百分比[%HbA1c]、BMI、空腹血糖[FBG]、甘油三酯、瘦素和体重)相关。因此，研究人员收集了1099名参与者/患者的皮下脂肪组织并进行RNA测序。如上所述，研究人员对RNA-seq数据进行去卷积，并估计了男性和女性参与者每个脂肪细胞亚群的比例/得分。在分析皮下脂肪内H-Ad-3脂肪细胞比例与代谢参数的相关性时，研究人员发现H-Ad-3细胞数量与%HbA1c、BMI、FBG、甘油三酯、体重呈负相关，与瘦素水平呈正相关(图5F)。H-Ad-1的丰度与这些临床参数无关，而其他一些脂肪细胞亚群与人类代谢健康的标志物部分相关。综上所述，这些数据表明，皮下脂肪中H-Ad-3脂肪细胞比例的减少是人类代谢健康的一个指标。
总结 ：
本文中，研究人员利用snRNA-seq对小鼠和人类皮下脂肪组织的异质性进行去卷积，确定了至少两个不同的米色脂肪细胞亚群:FC-脂肪细胞和UCP1-米色脂肪细胞。在确定标记基因Atp5k后，研究人员在小鼠中准确定位并表征P2脂肪细胞亚群，逐步证明其具有高度代谢活性，能利用FCs耗散能量，从而独立于Ucp1促进产热。这一发现合理解释了为什么UCP1缺失的小鼠和UCP1表达低的人类仍能进行有效的产热。此外，研究人员还在人类颈部皮下脂肪组织中定位到P2样脂肪细胞，即H-Ad-3脂肪细胞，证明其是全身能量稳态的重要驱动因素，与人类的葡萄糖代谢和肥胖抵抗有关，这一发现为开发针对肥胖和代谢疾病的新疗法提供了潜在的靶点。
链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1550413124002766?via%3Dihub
https://blog.sciencenet.cn/blog-3483272-1456422.html
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