代谢学人

Cell Metabolism：铁死亡终结者防治脂肪肝

撰文 | 王蕊  夏志蕊  王颖雯  朱丽君  刘爽  曹玉香

编辑 | 孟美瑶

校对 | 朱丽君

背景介绍

代谢功能障碍相关性脂肪肝病(MAFLD)的发病率，以前称为非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，在全球范围内显著增加，并呈现持续上升的趋势。代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎(MASH) ，以前称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，属于MAFLD的一种病理亚型，其主要特征是肝脂肪变性、炎症和纤维化，最终可进展为肝硬化甚至肝癌，对公共卫生构成了重大威胁。在过去的几十年中，随着对MASH发病机制理解的深入，也提高了人们对MASH有效治疗的期望；然而，迄今为止只有一种药物被临床批准用于治疗 MASH (小编注：该药物于2024年3月15日上市，名为Resmetirom，是由Madrigal Pharmaceuticals开发的甲状腺激素受体β(THR-β)激动剂。THR-β在肝脏中高度表达，且THR-β激动剂被证实在人体中具有降低LDL、TG和肝脏脂肪变性的功能)。由于MAFLD发病机制和进展的复杂性，以及对疾病进展的关键潜在机制的理解存在局限性，阻碍了确定其效治疗靶点的进展缓慢。因此，凸显了对新型治疗策略的迫切需求。

必要微量元素铁在许多生物过程中起着至关重要的作用，包括氧气转运，DNA合成，细胞能量代谢，电子传递和各种酶促反应。然而，铁的过量积累可导致铁诱导的芬顿反应（小编注：芬顿反应（Fenton reaction）是一种无机化学反应，由化学家Fenton HJ在1893年发现。这个反应主要是过氧化氢（H₂O₂）与二价铁离子（Fe²⁺）混合后发生强氧化反应，能够将许多已知的有机化合物如羧酸、醇、酯类氧化为无机态，氧化效果十分显著。在铁死亡过程中，血液循环中的Fe³⁺与转铁蛋白结合并运输，并通过转铁蛋白受体1进入细胞后被还原为Fe²⁺并释放到胞质的不稳定铁池中，细胞质中的Fe²⁺与活性氧发生芬顿反应，最终引发细胞死亡。血液循环中的Fe³⁺与转铁蛋白结合并运输，通过转铁蛋白受体1进入细胞后被还原并释放到胞质的不稳定铁池中，而多余的铁储存在铁蛋白中），导致有毒的ROS积累和脂质过氧化——即铁死亡的标志性特征。目前，越来越多的临床研究报道了肝脏铁沉积与MASH密切相关。然而肝铁超载在 MASH 中的作用尚未得到阐明。此外，目前利用铁螯合治疗MASH的疗法仍处于早期阶段，因此，针对以上情况急需开发新型铁螯合疗法。近期，一篇发表在Cell Metabolism上名为“Integrative clinical and preclinical studies identify FerroTerminator1 as a potent therapeutic drug for MASH”的文章研究了肝脏铁沉积与MAFLD发展之间的关系，以及铁螯合剂对 MASH进展的影响及其潜在的机制。

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敲黑板啦！

    1.      MAFLD 的患病率和进展与肝脏铁沉积有关；

    2.      铁主要通过 c-MYC-ACSL4 诱导的铁死亡加速 MASH 的发展；

    3.      FOT1 通过同时阻断铁积累和铁死亡来减轻 MASH；

    4.      血清铁蛋白可能是铁螯合剂靶向 MASH 治疗的预测性生物标志物。

​研究结果

1 .人和小鼠MASH肝脏中的铁沉积

为了研究铁在MASH临床病例进展中的作用，研究人员检测了MAFLD患者(MAFL、临界MASH[ B-MASH ]和MASH [ n = 494])肝脏中的铁含量。在队列1中，研究人员通过活检发现在亚洲的MASH患者中，无论男性还是女性，丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平的增加所表征的肝功能下降与MAFLD严重程度呈正相关(辅图1A、B)。其中，患有MAFLD的男性肝脏铁沉积患病率(76.49%)显著高于女性(36.88%) (辅表1)，表明男性发生MAFLD相关的肝脏铁沉积的风险更高。其次, B-MASH或MASH男性患者肝脏铁沉积的发生率显著高于MAFL，但女性患者则不存在该现象(图1A-A’’)。通过增强型DAB铁染色检测的肝脏铁沉积程度与肝脏切片H&E染色检测的MAFLD的严重程度是一致的(图1B，辅图1C)。此外，在蛋氨酸-胆碱缺乏饮食(MCD)、高脂肪高胆固醇饮食(HFHC)和西方饮食与低剂量四氯化碳联合造模(WD+CCI4)诱导的MASH模型中，研究人员观察到了明显的肝铁沉积 (图1C-D’)和炎症加重，通过F4/80和CD11b(两种促炎因子标志物)的免疫组化染色阳性区域在MASH 模型中明显增多，以及包括肿瘤坏死因子α (TNF-α)、白细胞介素1b (IL-1b)和IL-6在内的炎症细胞因子水平在MASH 模型中也明显增加 (图1E-E’’，辅图1D-G)。

随后，为了探究肝脏铁在MASH发展中的潜在作用，研究人员探究接受高铁饮食(HID)的小鼠的肝功能和病理情况（小编注：本文所用的高铁饮食为Research Diets，D08080405，经AIN-76A标准饲料改良，每1kg饲料中包含8.24g羰基铁）。结果显示，经HID喂养的小鼠肝脏在普鲁士蓝染色后阳性区域显著增加，非血红素铁含量显着升高(图1F、G，辅图1H)（小编注：非血红素铁是指不与血红蛋白结合的铁，它在细胞中以游离态或不稳定铁池的形式存在，更容易参与芬顿反应生成活性氧（ROS），是导致铁死亡的关键；而血红素铁是与血红蛋白结合的铁，它在总铁含量测定中可能会影响非血红素铁的测量数值。通常非血红素铁检测试剂盒通过酸和热处理，将非血红素铁释放到上清液中，而含血红素铁的蛋白则留在沉淀中，这样可以更准确地测定非血红素铁的含量，避免血红素铁的干扰）。其次，肝组织切片H&E、油红O和天狼星红染色显示小鼠的NAS (MAFLD 活性评分)和纤维化评分随着HID喂养时间推移而显著增加(图1F、G)。与喂食正常食物(ND)的小鼠相比，HID喂养4周和8周的小鼠的血清ALT、AST、乳酸脱氢酶(LDH，肝损伤标志物)以及肝脏中甘油三酯(TGs)含量显著升高(图1I、1J)；并且，HID小鼠的炎症因子水平以及促炎、促纤维化基因的mRNA表达水平均显著上升(图1L，辅图1I)。总之，以上结果展现了肝铁沉积与MASH进展之间的因果关系，从而提示了铁螯合疗法可以作为一种治疗MASH的潜在方法。

拓展阅读

MAFLD病理诊断

在MAFLD的病理诊断中，根据美国肝病协会提出的NAS评分系统(2005年)对MAFLD进行亚型分类，NAS评分系统是一种半定量评分系统，可判断治疗应答或疾病进展，NAS系统涵盖了NAFLD疾病谱，并且同时适用于成人和儿童。在该评分系统中，肝脏细胞脂肪变0-3分，气球样变0-2分，小叶内炎症0-3分，总分为8分。

(1)肝细胞脂肪变：0分(<5%)；1分(5%～33%)；2分(34%～66%)；3分(>66%)。

(2)小叶内炎症(计数坏死灶)：0分（无）；1分(<2个)；2分(2～4个)；3分(>4个)。

(3)肝细胞气球样变：0分（无）；1分（少见）；2分（多见）。

将上述肝细胞脂肪变、肝细胞气球样变和肝小叶内炎症这三项评分相加，即得出NAS评分。NAS≥5分可诊断为NASH，NAS 3～4分为临界NASH(B-NASH)，NAS 1～2分可确认为MAFL。

参考文献：

[1] Valenti L, et al. Nat Rev Endocrinol. 2023 May;19(5):299-310.

图1 MASH人群和小鼠中发生肝铁沉积

辅图1 MASH人群和小鼠中发生肝铁沉积

2 .相比FDA批准的铁螯合剂，铁螯合剂FOT1对MASH更有效

研究人员鉴定了新型铁螯合剂FerroTerminator1(FOT1)（小编注：铁螯合剂主要螯合的是三价铁离子），以前称为CN128(辅图2A)。该螯合剂具有强大的铁清除能力，并且在各种毒性评估中展现了良好的安全性。为了探索FOT1和两种美国FDA批准的药物(去铁胺(DFO)和去铁酮(DFX))的作用(小编注：DFO和DFX是两种常见的铁螯合剂，其中DFO是三价铁螯合剂，能与三价铁离子结合成铁胺复合物，其药物代谢半衰期约为20~30min，通常需要将其配置成10%溶液皮下或静脉注射；而DFX是一种口服铁螯合剂，螯合三价铁，给药后经于上消化道快速吸收，药物代谢半衰期为3~4h，经葡萄糖醛酸化代谢失活。DFO和DFX均在临床使用，去铁胺（DFO）用于治疗所有铁过载患者，特别是那些由于长期输血导致的铁过载患者，如地中海贫血患者。通过持续高剂量输注可以显著减轻由铁过载引起的心脏毒性，改善心室功能，减少铁过载相关并发症，提高患者总体存活率和生活质量。去铁酮（DFX）是第一个口服的铁螯合剂，用于治疗铁过载患者，特别是那些需要口服铁螯合剂的患者，适用于6岁以上的患儿；同时对心脏铁过载有较强的治疗作用)，研究人员在MASH小鼠模型中进行了探究。首先，研究人员初步探讨了饲喂MCD的小鼠在以50mg/kg/d的剂量灌胃给药时是否会对这些铁螯合剂产生反应。与对照小鼠相比，FOT1处理显著降低了NAS评分和肝脏非血红素铁水平，改善了肝功能，降低了肝脏TG水平(图2A-E，辅图2B-D)。尽管DFX处理的小鼠也显示出NAS评分、血清ALT水平、非血红素铁和肝脏TG水平的降低(图2A-2E)，但它对纤维化评分和血清AST水平的影响有限(图2C、C’、E’)。相比之下，与FOT1或DFX相比，DFO对MASH小鼠的肝脏铁含量、NAS、纤维化评分、肝脏TG和AST均没有影响(图2C、D、E’)。这些数据表明，铁螯合剂对肝脏铁的螯合作用是可以有效治疗MASH的关键。

为了进一步研究FOT1与DFX对HFHC诱导的MASH小鼠模型的治疗作用，研究人员给予C57BL/6J野生型(WT)小鼠HFHC饮食10周，以诱导其出现MASH表型，随后再用FOT1或DFX治疗6周(图2F)。给予HFHC饮食共16周后，研究人员观察到FOT1或DFX治疗的HFHC-MASH小鼠肝脏铁含量降低(图2G)。经过组织学分析，发现FOT1处理组小鼠的NAS和纤维化评分明显低于对照组，但DFX处理组小鼠的纤维化评分没有下降(图2H、H’)。在溶剂处理的HFHC小鼠中，血清ALT、AST和肝脏TG含量均升高，但经FOT1或DFX治疗的HFHC小鼠中，以上三个参数均显著降低(图2I、J)。通过葡萄糖耐量试验(GTT)和胰岛素敏感性试验(ITT)检测显示，溶剂处理的HFHC-MASH小鼠表现出葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗(IR)，而FOT1或DFX治疗均改善了葡萄糖耐量，但只有FOT1明显提高了胰岛素敏感性(图2K、K’)。此外，与溶剂组或DFX治疗组相比，FOT1治疗的HFHC小鼠肝脏巨噬细胞明显减少，F4/80和CD11b染色阳性率较低(图2H)，肝脏浸润的炎性细胞因子水平降低，包括TNF-a、IL-1b和IL-6(图2L-L’’)，以及炎症和纤维化相关基因的表达水平均显著降低(图2M，辅图2F)。这些结果表明，与FOT1相比，DFX抑制肝脏炎症和纤维化效果较弱。

接下来研究人员比较了FOT1和DFX在生理正常条件下对组织铁含量的影响。研究人员给予ND喂养的WT小鼠FOT1或DFX处理4周，结果发现FOT1不影响ND喂养的小鼠肝脏和脾中的铁稳态(辅图2B、B’)，而DFX处理的小鼠肝脏和脾脏铁水平显著降低(辅图2B、B’)，以及红细胞(RBC)和血红蛋白(HGB)显著减少(辅图 2E、E’)，这表明DFX相比于FOT1毒性更强。总之，研究人员证明FOT1在治疗MASH方面具有调节优越的安全性以及更有效的治疗效果，可能是通过在MASH 进展过程中微调肝铁沉积。(小编注：MCD和HFHC诱导的MASH模型中FOT1在治疗显著降低小鼠肝脏铁含量（2B,2G），而作者在这里证明FOT1不影响ND喂养条件下的肝脏铁稳态是为了说明FOT1安全性高）

为了在更具生理相关性的小鼠MASH模型中评估FOT1的治疗效果，研究人员给予小鼠HFHC饮食16周，以建立MASH模型，随后在保持HFHC饮食的同时，通过灌胃给予FOT1 8周(图2N)。结果显示，FOT1处理的HFHC-MASH小鼠肝脏铁含量，NAS和纤维化评分显著降低，肝功能和脂质代谢紊乱显著改善(图2O-R，辅图2G-K)。其次，用FOT1或溶剂处理的HFHC-MASH小鼠的体重、eWAT/体重的比率没有明显差异(辅图2L-M’)。FOT1处理的HFHC小鼠表现出IR改善(辅图2S、S’)，以及炎性巨噬细胞的肝浸润减少(图2P、T-T’’)。以上结果力地支持 FOT1 治疗 MASH 的潜力。

目前，批准用于MASH的治疗方法有限，主要是由于难以开发有效的药物来逆转NAS或纤维化。为了研究MASH进展，研究人员让WT小鼠接受WD+CCl4方案，从而建立具有高纤维化评分的晚期MASH模型，据报道该模型能够概括人类MASH的发展。随后，研究人员研究了FOT1治疗是否会抑制该MASH模型的发展。WD+CCl₄处理6周后，研究人员通过组织学病理切片和NAS评分证实了重度MASH模型的建立(辅图2S、S)，并将所有的MASH小鼠被随机分为口服FOT1组或对照组，且同步进行6周WD+CCl4处理(图2U)。12周后，重度MASH小鼠表现出肝脏铁水平升高(图1D’’)和明显的肝损伤，NAS评分、纤维化程度较高，血清ALT和LDH水平升高，肝脏TG含量升高(图2W-Y)。在重度MASH小鼠中，FOT1处理明显抑制肝铁沉积以及脂肪变性、气球样病变、小叶炎症和纤维化(图2V-W’)。肝损伤评估显示，与溶剂组相比，FOT1处理的MASH小鼠ALT、LDH和肝脏TG水平均显著降低(图2X、Y)。

为了评估FOT1的潜在毒性，研究人员探究了其对体重、肝功能、常规血液和组织学评价的影响。结果显示，无论是短期(4周)还是长期(16周)，与溶剂组相比，相同剂量FOT1处理的ND-WT小鼠体重没有任何显著影响(辅图2N、N’)，肝功能、常规血液和组织学分析也没有明显差异(辅图2O-R)。总之，这些研究结果证明50mg/kg/day的FOT1治疗对于MASH的治疗是有效且安全的。

图2 新型铁螯合剂FOT1在防止MASH进展方面优于美国FDA批准的铁螯合剂

辅图2 新型铁螯合剂FOT1在防止MASH进展方面优于美国FDA批准的铁螯合剂

3.长期使用FOT1可有效改善重度MASH 

为了探索FOT1对MASH的长期药理作用，研究人员使用HFHC或ND喂养WT小鼠16周以形成MASH和对照模型，同时使用FOT1或溶剂治疗小鼠(图3A)。与上述研究结果一致，FOT1治疗显著降低了HFHC-MASH小鼠中的肝铁水平并降低了NAS和纤维化评分，肝损伤、肝TG水平、巨噬细胞浸润并改善全身IR(图3B-3F’)。与溶剂组相比，FOT1治疗抑制了炎症和纤维化相关基因的表达(图3G，H)。研究人员继续探究FOT1长期治疗对重度MASH的效果(图3I)。WD+CCL₄喂养12周后，重度MASH小鼠显示出明显的肝损伤，表现为高NAS评分伴有高度纤维化，巨噬细胞浸润，血清ALT和LDH水平升高以及肝TG含量升高(图3K-M)。并且FOT1长期治疗的MASH小鼠肝损伤得到显著改善(图3K、K’)以及肝脏铁含量显著降低(图3J)。此外，FOT1治疗的MASH小鼠中肝脏炎症因子明显减少并且抑制了与炎症和纤维化相关的基因表达(图3N-N’’，辅图2T、U)。总之，以上结果表明FOT1的长期治疗能够有效预防小鼠MASH的发生和进展。

图3 长期服用FOT1可有效预防MASH，特别是伴有高度纤维化的重度MASH

辅图3 长期服用FOT1可有效预防MASH，特别是伴有高度纤维化的重度MASH

4.FOT1介导的MASH改善与阻断Acsl4诱导的铁死亡

先前研究表明，铁超载与芬顿反应中ROS的产生和脂质过氧化反应的形成密切相关。由于脂质过氧化的积累和谷胱甘肽(GSH)代谢受损都能够促进铁死亡的发生，研究人员接下来检测了接受FOT1治疗的MCD喂养小鼠的肝脏中丙二醛(MDA)(脂质过氧化的重要副产物)和GSH的水平。研究结果表明，FOT1治疗降低MDA水平，增加GSH/GSSG比值(图4A、B)。体外研究表明，与用ND喂养的对照小鼠相比，在MCD-MASH小鼠的原代肝细胞中通过C11-BODIPY (FL1)测量的脂质过氧化水平显著增加(图4C，辅图3A)。与MCD饮食的溶剂组相比，FOT1治疗组的脂质过氧化水平明显降低，且与ND组水平基本一致(图4C，辅图3A)。同时，与对照组相比，FOT1治疗的HFHC-MASH小鼠中观察到较低的MDA水平和4-羟基壬烯醛(4-HNE) (另一种脂质过氧化副产物)的阳性率，同时表现出更高的GSH/GSSG 比率(图4D-F’)。

为了检测人类MASH肝脏中铁死亡的发生，研究人员检测了MAFLD患者的肝脏MDA和4-HNE水平，结果显示MASH患者的MDA和4-HNE水平显著高于MAFL患者(图4G-H’)，表明铁死亡可能在MASH的进展中被激活。为了对这一假设进行功能性检验，研究人员使小鼠接受HFHC饮食10周，然后用特异性铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1，Fer-1)或溶剂治疗，同时维持HFHC喂养方案6周。通过显著降低的NAS和纤维化评分，表明Fer-1治疗小鼠的MASH病理生理学特征得到显著改善，并且和溶剂组相比，Fer-1治疗组16周时血清ALT和AST水平显著降低，这与上述表型保持一致(图4I-J’)。此外，Fer-1能显著降低肝脏TG水平，并且GTT和ITT结果也得到改善，说明Fer-1对抑制MASH发展具有积极作用(图4K-M)。此外，在MCD-MASH小鼠中也能够观察到Fer-1对抑制MASH发展具有相似的保护作用(辅图3B-F)。综上所述，铁死亡是小鼠肝脏铁沉积诱导MASH的主要下游致病机制。

为了进一步阐明FOT1在MASH发展中有益作用的潜在机制，研究人员首先对ND和HID喂养的小鼠进行RNA测序(RNA-seq)分析。KEGG分析显示,脂质代谢和脂肪酸代谢位于前5个富集途径中(图4N和4N’)，表明MASH中铁代谢紊乱与脂质代谢紊乱同时发生。因此研究人员进一步利用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定MASH肝脏中氧化脂肪酸的水平。通过对质谱结果进行分析， 研究人员发现与ND饮食的对照小鼠相比，MCD诱导的MASH小鼠花生四烯酸（AA）代谢显著升高，而FOT1治疗可以显著抑制MCD诱导的MASH小鼠花生四烯酸（AA）代谢升高(图4O-Q)。重要的是，这些变化的代谢物是乙酰辅酶A合成酶长链家族成员(由Acsl1，Acsl3，Acsl4，Acsl5和Acsl6编码)的主要代谢产物。研究人员随后在三个独立的MASH模型中验证只有Acsl4基因表达具有最显著的变化，同时伴随着其蛋白质表达的增加，并且FOT1治疗在很大程度上恢复了这一基因在mRNA和蛋白水平的变化(图4R-S’’，辅图3G-J)。

因此，研究人员推断FOT1可能通过抑制肝脏Acsl4的表达来阻止MASH中的铁死亡。铁诱导Acsl4调控的多不饱和脂肪酸酯化反应的主要产物AA-PE和AdA-PE氧化(小编注：花生四烯酸-磷脂酰乙醇胺（AA-PE）和肾上腺酸-磷脂酰乙醇胺（AdA-PE）是铁死亡过程中ACSL4催化诱导的多不饱和脂肪酸酯化反应的主要产物)，以促进铁死亡(图4X)。因此，研究人员推测Acsl4及其相关信号通路的激活可能在MASH进展中具有重要作用。

研究人员探索了一种Acsl4选择性抑制剂阿贝西利(25mg/kg/day)在MCD诱导的MASH小鼠模型中的疗效。与对照溶剂治疗的小鼠相比，阿贝西利治疗的小鼠NAS和纤维化评分显著降低，肝损伤得到改善，炎症和纤维化相关基因的mRNA水平受到抑制(图4T-4V和S3K)，并且MDA水平显著降低(图4W)；然而，与对照组相比它对肝脏铁含量的影响较小(辅图3L)。

综上所述，以上结果有力地支持了以下观点：在MASH的进展过程中，铁死亡激活是一个至关重要的下游信号通路，FOT1主要通过抑制Acsl4的表达和肝细胞中的铁死亡进展，从而表现出对MASH的有效治疗作用(图4Y)。

拓展阅读

铁死亡与GSH/GSSG

在铁死亡信号级联过程中，最上游的反应系统为胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白（System xc-），其主要作用是将细胞外的胱氨酸与细胞内的谷氨酸进行交换，而胱氨酸一旦进入细胞后会在谷胱甘肽(GSH)(小编注：谷胱甘肽（GSH）是细胞内的一种重要抗氧化剂，在胱氨酸转化为半胱氨酸的过程中，GSH提供了还原力）或硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)的作用下还原为半胱氨酸。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽，具有保护细胞、抗氧化、抗衰老等作用，转运进入胞内的半胱氨酸通常是GSH生成的限速步骤。GSH是一种强效的还原剂，可以作为谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的辅因子，在细胞内促进磷脂氢过氧化物(PLOOHs)还原为相应的醇(PLOHs)，清除ROS，同时生成GSH的氧化形式GSSG，随后谷胱甘肽-二硫化物还原酶(GSR)利用NADPH/H⁺提供的电子催化GSSG重新还原为GSH。因此，GSH和GSSG之间的平衡对于维持细胞氧化还原状态至关重要。在铁死亡过程中，GSH作为谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的辅助因子，将有毒的脂质氢过氧化物(L-OOH)转化为无毒的脂质醇(L-OH)，本身被氧化为GSSG，导致GSH耗竭，促进了铁死亡过程。因此可认为GSSG与铁死亡呈正相关，通常可以利用相关试剂盒检测细胞或组织内GSH/GSSG的比值，从而判断铁死亡程度。 

已知不受限的脂质过氧化是铁死亡的特征。整个过程主要包括以下几个反应：

1. 脂质过氧化的激活：激活脂质过氧化需要从脂质双分子层中含有多不饱和脂酰基的磷脂(PUFA-PLs)中去除一个双烯丙基氢原子。

2. 形成碳中心磷脂自由基(PL•)：去除氢原子后，会形成以碳为中心的磷脂自由基(PL•)，这是脂质过氧化过程中关键的激活步骤。

3. 与氧气反应：形成的碳中心磷脂自由基(PL•)会与氧气反应，产生磷脂过氧化氢自由基(PLOO•)。

4. 进一步反应(级联反应)：PLOO•会从另一个PUFA分子中移除一个氢，本身形成PLOOH，使得另一个含有PUFA的磷脂又会因为失去氢而形成PL•，PL•又与氧气反应生成PLOO•这个反应持续进行，导致PLOOH大量产生。

5. GPX4的作用：GPX4是一种含硒的酶，它利用还原型谷胱甘肽(GSH)将PLOOH和脂质自由基（特别是PLOO•和烷氧基磷脂自由基PLO•转换成相应的醇(PLOH)。PLOH不是过氧化物，有效阻断了自由基的形成，因此不会继续参与脂质过氧化反应。这样，细胞膜的完整性得以保持，细胞可以避免因脂质过氧化引起的损伤和死亡。

6. 若没有GPX4等铁死亡抑制剂的存在，PLOO•会发生级联反应，产生大量PLOOH，一方面可引起细胞膜结构及其功能的损害，影响细胞膜的流动性和通透性以及完整性。 另一方面，PLOOH会在芬顿反应(即Fe²⁺催化的H₂O₂分解)产生·OH自由基的攻击下产生PLO·，PLO·和PLOOH等通过分子内双键加成反应形成环过氧化物，这些环过氧化物进一步分解生成包括MDA(丙二醛)和4-HNE(4-羟基壬烯酸)在内的多种醛类物质。MDA、4-HNE与蛋白质形成复合物时(尤其是与膜蛋白)具有细胞毒性。MDA也参与DNA的损伤和突变，从而导致细胞周期的停止以及细胞凋亡。ROS与生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质的脂质过氧化反应形成以上脂质过氧化产物, 从而使细胞膜的流动性和通透性发生改变,最终导致细胞结构和功能的改变。

参考文献：

[1]Proneth B, et al. Cell Death Differ. 2019 Jan;26(1):14-24.

[2]Zheng J, Conrad M. Cell Metab. 2020;32(6):920-937.

[3]Jiang X, Stockwell BR, Conrad M. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021;22.

[4]Li FJ, Long HZ, Zhou ZW, et al. Front Pharmacol. 2022;13:91029

拓展阅读

长链酰基辅酶A合成酶ACSL4与花生四烯酸

哺乳动物体内关键的脂肪代谢酶长链酰基辅酶A合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase, ACSL) 能将游离长链脂肪酸转化为酯酰基辅酶A，是哺乳动物利用脂肪酸的第一步反应，并在脂肪酸的合成代谢和分解代谢中起重要作用。长链脂酰辅酶A合成酶家族(ACSLs) 共包括5种亚型(ACSL1、ACSL3、ACSL4、ACSL5 和ACSL6)，每种ACSL成员在特定组织中发挥着不同的特定功能。ACSL1主要分布在肝细胞、心肌细胞、脂肪细胞，它能够通过激活细胞膜转运通道主要将16-18碳链的饱和脂肪酸和16-20碳的不饱和脂肪酸转运到细胞内，催化其形成脂酰辅酶A，从而参与肝脏甘油三酯的从头合成；ACSL3主要分布在大脑、骨骼肌及睾丸组织，能够选择性利用一些饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸以及花生烯酸生成卵磷脂以及脂质颗粒，维持细胞内脂质稳态；ACSL5在十二指肠粘膜中表达最高，它无法利用内源性的脂肪酸只能催化外源的脂肪酸；SCSL6主要分布于骨骼肌，可调控人类骨骼肌细胞内脂质合成及线粒体氧化能力，以催化16-20碳链饱和及不饱和脂肪酸，而ACSL4主要分布在一些类固醇合成组织中，主要以花生四烯酸为底物，增加类花生酸辅酶A的合成，以促进花生四烯酸向甘油二酯、甘油三酯以及甘油磷脂，在铁死亡中ACSL4主要的作用是将花生四烯酸等不饱和脂肪酸最终转化为脂质过氧化物，促使铁死亡的发生。

花生四烯酸(AA，C20:4)是一种n-6多不饱和脂肪酸，可以通过脂肪酸去饱和酶（FADSs）和超常长链脂肪酸延伸蛋白(ELOVLs)从亚油酸(C18:2)合成，或者直接从环境中摄取。AA及其延伸产物，肾上腺酸(AdA)，通过ACSL4和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3(LPCAT3)被整合到膜磷脂中。首先由 ACSL4将AA或AdA催化为花生四烯酰-辅酶A和肾上腺酰-辅酶A，然后LPCAT3将活化的脂酰辅酶A与磷脂酰胆碱(PC)与溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)或溶血磷脂酰胆碱(LPC)发生酯化反应，生成含有AA或AdA的磷脂酰乙醇胺(PEs)或磷脂酰胆碱(PCs)，最后经脂肪氧合酶(ALOX5)氧化为脂质过氧化物。AA-PE和AdA-PE是细胞膜磷脂的组成部分之一，主要功能是参与维持膜的流动性和完整性。但由于其含有的多不饱和脂肪酸链在铁死亡过程中具有重要作用，使之作为脂质过氧化的主要靶点，其含量与铁死亡过程中的脂质过氧化敏感性密切相关。PE-AA和PE-AdA被认为是最容易被过氧化的磷脂，这可能通过脂氧合酶介导或通过非酶促自氧化反应，其氧化可以导致细胞膜完整性的丧失，进而可能导致细胞死亡。过氧化后会产生脂质自由基，如磷脂过氧自由基(PLOO•)，这有助于脂质过氧化链反应，最终导致铁死亡。同时铁死亡可以通过GPX4将脂质过氧化物还原为脂质醇来预防。

参考文献：

[1]Ding K, Liu C, Li L, et al. Chin Med J (Engl). 2023;136(21):2521-2537.

[2]Kim JW, Lee JY, Oh M, Lee EW. Exp Mol Med. 2023;55(8):1620-1631.

图4 综合多组学分析显示，FOT1通过阻断ACSL4介导的铁死亡参与对MASH治疗的积极作用

辅图4 综合多组学分析显示，FOT1通过阻断ACSL4介导的铁死亡参与对MASH治疗的积极作用

5.c-Myc-Acsl4轴在MASH进展中起重要作用

为了探索FOT1介导的铁死亡并改善小鼠MASH的分子机制，研究人员考虑到各种MASH模型中mRNA水平的显著变化，重点阐明了肝脏Acsl4的转录调控(图4R-R’’，辅图3G)。研究人员采用了一种无偏倚高通量多重转录组学方法，分析了FOT1治疗和溶剂组的CD-MASH小鼠与ND小鼠肝脏组织的RNA-seq数据，通过overlap鉴定出9个转录因子。这些转录因子在MCD溶剂治疗组中表达上调，而在MCD的FOT1治疗组小鼠中以上转录因子表达下调(图5A，辅图4A、A’)。同样，研究人员对ND-溶剂组与HFHC-溶剂组和FOT1治疗组进行了类似的RNA-seq分析，发现了14个差异表达的转录因子(图5A，辅图4A、A’)。两项独立转录组学分析的结果显示，c-Myc在溶剂组的MASH肝脏中显著上调，而在FOT1治疗的肝脏中显著下调(图5A)。随后验证了多个MASH 模型中c-Myc  mRNA 和蛋白质水平表达均显着增加，FOT1治疗则可有效阻断c-Myc的表达(图5A’-D’)。队列Ⅱ研究结果显示，与MAFL患者相比，MASH患者肝脏中c-MYC和ACSL4的mRNA水平都显著升高(图5E、E’)。公共数据库(GEO: GSE164760)的队列Ⅲ的分析结果显示，MASH患者的c-MYC和ACSL4的mRNA水平之间存在很强的相关性(图5F)，这与研究人员的临床前数据一致(图5G)。此外，研究人员使用JASPAR数据集预测Acsl4启动子区域的c-Myc结合位点，发现了一个潜在的结合位点(图5H)。研究人员通过荧光素酶报告基因实验验证了Acsl4受c-Myc调控(图5I)。在293T细胞中过表达c-Myc的情况下，预测结合位点的突变体未能提高荧光素酶的活性(图5J、J’)，这支持了Acsl4是c-Myc的直接靶点的观点。

为了进一步研究c-Myc对MASH小鼠的抑制作用，研究人员用或不用c-Myc的选择性小分子抑制剂10058-F4治疗MCD喂养的小鼠。研究人员证实10058-F4治疗显著下调了MASH小鼠肝脏c-Myc和Acsl4的mRNA和蛋白水平(图5K、L)。此外，10058-F4治疗的MASH小鼠的病理特征明显减轻，并表现出更低的AST和ALT水平(图5M-5N’)。用10058-F4治疗的小鼠肝脏中促炎和促纤维化基因的mRNA水平也显著下调(图O、P)。

      此外，通过MDA水平和4-HNE阳性率的变化说明10058-F4治疗的MASH小鼠肝脏脂质过氧化水平显著降低，并且治疗组小鼠肝细胞脂质ROS也减少(图5Q-S’，辅图4B-D)。通过分析公共小鼠单细胞数据库(Tabula Muris数据库)，研究人员发现肝细胞具有较高的c-Myc和Acsl4基因表达水平，这是研究人员发现的两个关键信号分子(辅图4E、E’)。此外，研究人员通过免疫荧光实验证实，在MASH肝脏的肝细胞中，Ascl4的表达最为显著，FOT1治疗则在很大程度上逆转ASCL4的表达(辅图4F)。由于细胞内铁积累可通过芬顿反应触发氧化应激，研究人员进行了流式细胞术分析，发现柠檬酸铁(FAC)显著提高了人永生化细胞系(MIHA)中的ROS水平(辅图4G、G’)，并且FAC能够以剂量依赖性的方式激活MIHA细胞中c-MYC的表达，而TEMPO和NAC等ROS清除剂可以显著抑制c-MYC的表达(辅图4H-I)，这表明氧化应激在铁沉积介导的人肝细胞中c-MYC及其下游转录靶点ACSL4的上调中起着至关重要的作用。在机制上，研究人员发现FOT1主要通过螯合肝细胞中毒性铁沉积，抑制ROS产生诱导的c-Myc-ACSL4的表达，从而下调c-MYC和ACSL4的表达(辅图4J-K’)。鉴于先前的研究报道，肝细胞中c-MYC的表达增加会诱导慢性肝脏疾病(如MASH和肝纤维化)的DNA损伤。研究人员在HFHC和WD+CCI4诱导的MASH模型中的溶剂组和FOT1治疗组中都检测了DNA损伤的敏感标志物γ-H2AX(小编注：组蛋白H2AX在核小体形成、染色质重塑和 DNA 修复中发挥着重要作用。一旦双链 DNA 断裂，它在 Ser139 位点发生磷酸化，成为γ-H2AX。γ-H2AX 可标记双链断裂的位点，并募集细胞周期检查点和 DNA 修复因子至损伤位点。由于γ-H2AX 的水平在双链断裂后数分钟内升高，因而常被用作DNA损伤的标志物。定量检测γ-H2AX表达水平可用于评估 DNA 损伤程度)，发现溶剂组的MASH小鼠肝脏切片中增加的γ-H2AX染色阳性点被FOT1治疗显著消除(辅图4L-M’)。综上所述，这些结果表明FOT1主要通过抑制c-MYC介导的ACSL4转录激活和随后在肝细胞中发生的铁死亡(图5T)，从而对MASH的进展产生抑制作用。

图5 两种独立的MASH模型的转录组分析显示，c-Myc-ACSL4轴在MASH进展中起主要作用

辅图5 两种独立的MASH模型的转录组分析显示，c-Myc-ACSL4轴在MASH进展中起主要作用

6.SF作为一种可靠的分层标志物，或许可以用于预测FOT1在MAFLD中治疗效果

考虑到MAFLD患者的高铁蛋白血症，特别是代谢性高铁蛋白血症(MHF)与更严重的肝损伤和较差的临床结果相关，研究人员在MAFLD队列Ⅰ中对包括性别分层、MAFLD亚型(MAFL、B-MASH和MASH)、肝脏铁沉积程度和MHF在内的亚组进行了分析，以探讨本研究的潜在临床意义。研究人员发现男性和女性MAFLD患者血清铁蛋白(SF)(小编注：铁蛋白(Ferritin)是一种广泛存在于细胞内的高分子蛋白质，主要通过储存铁离子以调节细胞内的铁稳态。而血清铁蛋白(serum ferritin，SF)是去铁蛋白和铁核心Fe3+形成的复合物，血清铁蛋白主要存在于肝、脾、骨髓等网状内皮系统内，为骨髓合成血红蛋白供铁，并按机体的需要向血清中释放。血清铁蛋白的主要功能是反映机体内的总体铁状态。它是评估机体铁缺乏症、铁过载和炎症等疾病的有效指标)水平与肝铁沉积或肝功能呈正相关（图6A-A’’，辅图5A-B’’）。SF水平和MAFLD的亚型呈正相关，在MASH患者中SF水平最高，尤其是在男性MASH患者中，而在女性患者中没有明显差异(图6B-B’’)。此外，在男性MAFLD患者中SF水平与NAS评分(图6C-C’’)或纤维化评分(图6D-D’’)呈正相关，而在女性患者中没有发现这种相关性。研究结果与男性MAFLD患者具有更高的铁沉积患病率一致(辅表1)。根据针对SF和MHF的共识声明提供的建议（小编注：原文参考的是一篇关于代谢性高铁蛋白血症定义和分类的共识声明，为研究人员对研究对象进行正确的高铁素血症患病率统计提供了依据），研究人员发现MAFLD男性患者高铁素血症的患病率比女性患者更高(辅表2、3)。此外，研究人员发现MAFLD和肝铁沉积患者的IR发生率更高(辅表4)，并且SF水平与伴有高SF水平(>550 mg/L)患者的的IR严重程度呈正相关(辅表5、7)。基于先前关于MAFLD伴有高铁蛋白血症患者临床预后不良的报道，研究人员进一步证明了男性具有较高的高铁蛋白血症发病率，并且他们可能比其他患者从基于铁螯合剂的MASH治疗中获益更多。

为了探索SF水平是否可以作为FOT1治疗的分层生物标志物，研究人员在建立的HFHC-MASH小鼠模型中双盲测量了每只小鼠在FOT1治疗前后的SF水平、ALT和AST含量、NAS和纤维化评分。给予FOT1治疗后，高SF水平的MASH小鼠预后较好，表现为肝功能明显改善，NAS评分明显降低(图6E-H)。并且研究人员发现在本研究中检测的所有MASH模型中，FOT1治疗与较低的SF水平显著相关，表明SF水平可能作为FOT1治疗MASH的预后指标。与先前的观点一致，即MAFLD并且具有2/3评级MHF的患者的不良预后表明，肝铁沉积和高SF水平在MALD的发展中起关键作用。本研究充分证明FOT1治疗相较于其他螯合剂，至少在小鼠中更安全、更有效。研究人员对MAFLD患者的亚组分析表明，FOT1可能对患有MASH和高铁蛋白血症(SF>550 g/L)或具有2/3评级MHF的患者更有益。所有这些数据表明，SF水平作为FOT1治疗MASH的潜在预测生物标志物，这需要未来进一步的临床研究。在临床前动物实验中，多个MASH模型显示SF水平明显升高，经FOT1治疗后SF水平得到有效缓解(辅图5C-E)。总之，以上研究表明SF可作为一种有价值且可靠的生物标志物，可用于对疾病发病率和风险程度增加的MAFLD患者进行分层，以及能够识别肝铁沉积程度。鉴于在FOT1治疗后，各种小鼠MASH模型中SF水平显著降低，因此在未来的研究中SF水平或许可以用来预测FOT1的治疗效果。

拓展阅读

高铁蛋白血症与代谢性高铁蛋白血症(MHF)

高铁蛋白血症是一种常见的实验室检查结果，血清铁蛋白水平升高，可能与多种因素相关，包括铁过载、炎症、肝脏疾病等。代谢性高铁蛋白血症反映了铁代谢的改变，这种改变导致铁在体内的积累，并且与心脏代谢性疾病和肝病的风险增加相关。根据最新的共识声明，MHF定义为男性血清铁蛋白浓度>300 ng/mL，女性血清铁蛋白浓度>200 ng/mL。并且根据循环铁蛋白水平对MHF的严重程度进行分级：MHF1级：无显著铁蓄积(铁蛋白水平<550 ng/mL); MHF2级：轻度铁蓄积(铁蛋白水平550-1000 ng/mL); MHF3级：中度或重度铁蓄积(铁蛋白水平>1000 ng/mL)。

参考文献：

[1]Liu WY, et al. J Clin Endocrinol Metab. 2024 May 17;109(6):1540-1549.

图6 血清铁蛋白是预测FOT1在MAFLD中更广泛临床意义的可靠分层生物标志物

总结  

在这项研究中，研究人员通过整合三个人类MASH队列和四种小鼠MASH模型的研究，建立了肝铁沉积在MAFLD进展中的因果作用。这与之前的研究结果相结合，强调了肝铁沉积在MAFLD中的实际存在。这些发现表明铁沉积参与了MAFLD的发病和进展，需要进一步研究以开发恢复铁稳态的潜在治疗策略。为此，研究人员对铁螯合剂FOT1在各种MASH模型中的疗效和安全性进行了全面的研究。研究人员的三个独立队列和多个小鼠MASH模型表明，FOT1铁螯合作用可以抑制MASH的发展，机制上主要是通过抑制c-Myc-Acsl4介导的铁死亡，随后减少了肝脏脂质积累、炎症和纤维化。因此，这项研究结果为测试一种新型铁螯合剂作为治疗MAFLD患者（包括 B-MASH 和严重 MASH）的一种有希望的治疗方法提供了理论依据。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cmet.2024.07.013