撰文 | 李欣茜 郑宇含 张彦康 张婷 仲银召 李雨

编辑 | 孟美瑶

校对 | 张婷

研究背景

代谢相关脂肪性肝病(MASLD)已成为全球最常见的慢性肝病，患病人数高达世界人口的三分之一。MASLD包括一系列肝脏病变，包括单纯性肝脂肪变性、可能伴有肝纤维化的代谢相关脂肪性肝炎(MASH)，以及最终的肝硬化，并可能导致肝细胞癌和肝功能衰竭。MASH发病机制的核心是肝脏脂质超负荷，其原因包括肝脏对脂肪组织释放的脂肪酸过度摄取、过量碳水化合物摄入或脂肪酸β氧化(FAO)抑制导致脂肪从头合成水平增加，这导致肝脏中活性氧积累、线粒体功能障碍和内质网应激，进而导致脂肪毒性，激活炎性小体，导致促炎介质的释放和积累，进而促进白细胞浸润和肝星状细胞活化，最终会导致MASH和肝纤维化。尽管研究人员在探究驱动MASH的代谢和分子机制方面取得了重大进展，并且在开发针对脂质和碳水化合物代谢的药物方面做出了相当大的努力，但可用于治疗MASH的临床药物仍然有限。因此，目前亟需确定可以靶向治疗MASH的其他失调代谢途径。

MASLD常被归因于脂质和碳水化合物代谢异常，但越来越多的证据表明，氨基酸代谢受损是MASH的一个致病因素。值得注意的是，有研究报道在人类和小鼠模型中，低水平甘氨酸循环与MASH恶化相关，而甘氨酸缺乏会加速小鼠的疾病进程。丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶(AGXT)是一种肝脏特异性酶，在催化乙醛酸生成甘氨酸的过程中起核心作用，最近本文研究团队和其他团队的转录组学研究都一致报道，患MASH的人类和小鼠肝脏中AGXT表达下调。AGXT功能丧失会导致乙醛酸的积累，此外乙醇酸氧化酶(GO)也可将乙醇酸转化为乙醛酸，乙醛酸再通过肝乳酸脱氢酶(LDHA)迅速转化为终产物草酸（小编注：LDHA的底物主要为乳酸、丙酮酸和乙醛酸。LDHA属于2-羟基酸氧化还原酶家族的一员，可催化多种2-羟基酸的氧化还原反应。而丙酮酸、乳酸和乙醛酸都属于2-羟基酸，因此可作为LDHA的底物）。

本文研究团队最近的研究表明，AGXT缺失加剧了小鼠饮食诱导的MASH，但其具体机制尚未得到系统的研究，包括肝脏对草酸代谢的调节及其在MASH人类和小鼠中的水平，肝细胞(产生草酸的主要细胞)中草酸积累的影响，以及靶向草酸代谢的治疗潜力。

多个团队一致报道MASH中AGXT表达下调，最近研究表明AGXT功能障碍和原发性高草酸尿症与肝脏疾病有关。已知草酸对肾脏和心血管疾病会产生有害作用，同时MASH患病率在不断上升，而现有治疗手段却仍十分有限。因此探究MASH中的草酸代谢，并评估靶向肝脏草酸代谢的治疗潜力，是十分必要的。在本文的研究中，研究人员在多种特定人群、MASH小鼠模型和肝细胞体外系统中系统地评估了肝脏草酸代谢调节和水平，以及驱动NASH发展的分子机制。通过肝细胞特异性过表达AGXT、药理抑制LDHA和GO，并结合转录组学、脂质组学和功能分析，研究人员确定了遗传和药理抑制草酸过量产生对MASH的保护作用，以及这种治疗方法的潜在机制。

拓展阅读：甘氨酸代谢与代谢性疾病

甘氨酸属于非必需氨基酸，可从饮食中摄取，也可内源性合成。甘氨酸主要由丝氨酸、胆碱、肌氨酸和乙醛酸合成。机体内甘氨酸可通过细胞质SHMT1（丝氨酸羟甲基转移酶1）转化为丝氨酸，这是体内甘氨酸分解代谢的主要途径。其次，甘氨酸可分解产生CO2和NH4+，从而修饰四氢叶酸（THF）产生CH2-THF，它是主要的甲基供体，可通过SAM（S-腺苷甲硫氨酸）参与嘌呤、蛋氨酸等分子的生物合成。此外，GNMT（甘氨酸-N-甲基转移酶）可催化甘氨酸转化为肌氨酸，这一过程中需要SAM，因此在调节甲基化过程中发挥重要作用。 目前研究发现，与健康人相比，肥胖和糖尿病患者的血浆甘氨酸水平下降。而通过减肥、运动或药物改善胰岛素敏感性，这一干预措施会增加肥胖或糖尿病患者血浆的甘氨酸浓度。此外，一项前瞻性研究表明，低血浆甘氨酸水平先于糖尿病的临床发病，这提示血浆甘氨酸水平降低可能是糖稳态受损和2型糖尿病的预测因子。也有研究在MASLD小鼠模型中发现在MASLD早期阶段肝脏甘氨酸水平下降，抑制了GSH的合成，促进肝脏氧化氧化应激，进而促进MASLD发展。

[1] Anaïs Alves, et al. Nutrients. 2019. [2] M Adeva-Andany, et al. Amino Acids . 2018.  [3] Alia Ghrayeb, et al. Cell Metab. 2024.

拓展阅读：草酸与代谢性疾病

血浆中草酸可由体内代谢产生，也可从饮食中摄取。研究显示，肝脏草酸生物合成水平占全身草酸水平的50-80%。内源性草酸合成的主要前体分子是乙醛酸，在LDHA的催化下产生草酸。乙醛酸的来源主要有三种途径：1）来源于肝脏线粒体中的胶原蛋白代谢，羟脯氨酸转化为HOG（4-羟基-2-氧代戊二酸），随后在HOGA1（4-羟基-2-氧代戊二酸醛缩酶1）催化下转化为乙醛酸；2）过氧化物酶体中甘氨酸在DAO（D-氨基酸氧化酶）催化下转化为乙醛酸；3）DNA修复。DNA损伤时末端带有3-磷酸乙醇酸的DNA链会发生断裂，而阻断DNA链断裂的DNA修复过程中会产生2-磷酸乙醇酸，2-磷酸乙醇酸通过磷酸乙醇酸磷酸酶转化为乙醇酸、果糖（主要发生在植物中）或乙二醇代谢（乙醇醛通过醛脱氢酶转化为乙醇酸）产生乙醇酸，进而在HAOX1（乙醇酸氧化酶，也称GO）转化为乙醛酸。 一般认为草酸在哺乳动物体内不发挥重要的生理功能，太少也不会有什么危害，反而如果从食物（许多植物富含草酸）中摄入过多草酸或肝脏草酸过量生成，容易形成草酸钙晶体引发结石或增加肾脏负荷等，对机体有害。血浆中草酸可被胃、肠道、肝脏、肾脏等组织吸收，经粪便或尿液排泄，或被降解。人类和哺乳动物无法代谢草酸，需要依赖细菌降解。目前研究发现可降解草酸的菌群包括甲酸杆菌、大肠杆菌、双歧杆菌属和乳酸杆菌属。 有研究通过对1255名接受血液透析的糖尿病患者进行分析，发现血清草酸水平在需要慢性透析的肾衰竭患者中升高，且血清草酸浓度较高的患者比血清草酸浓度低的患者更容易发生心血管死亡，特别是心源性猝死。也有研究发现Apoe-/-小鼠肝脏AGXT表达下降导致草酸积累，加剧了动脉粥样硬化发展，这与肝脏氧化还原稳态失调、炎症水平升高有关，而在Apoe-/-小鼠肝脏中过表达AGXT后，降低了草酸水平，可缓解动脉粥样硬化表型。本篇文章中研究人员发现肝脏草酸积累可通过抑制 PPARα 介导的脂肪酸氧化并促进单核细胞趋化性、NF-κB 和 TGFβ 靶水平，促进肝脏脂肪变性、炎症和纤维化。

[1] Theresa Ermer, et al. Nat Rev Nephrol. 2023. [2] Anja Pfau, et al. J Am Soc Nephrol. 2021.  [3] Yuhao Liu, et al. Cell Rep. 2021.

敲黑板啦！

1.MASH患者和小鼠的肝脏中AGXT被抑制，导致草酸过量产生，在肝脏中过表达AGXT能降低草酸水平并改善MASH

2.草酸通过抑制PPARα和FAO促进肝脏脂肪变性

3.在肝脏中过表达AGXT可通过诱导FAO抑制肝脏脂肪变性，减轻MASH炎症及纤维化

4.通过药理学方法抑制草酸过量产生，可抑制MASH小鼠肝脏的促炎反应和纤维化，改善MASH

研究结果

1.MASH导致人类和小鼠的肝脏中草酸过量生成

乙醇酸、甘氨酸和4-羟基-L-脯氨酸是乙醛酸的前体物质。乙醇酸在乙醇酸氧化酶（glycolate oxidase，GO，由HAO1编码）的催化下会氧化生成乙醛酸。羟脯氨酸脱氢酶（hydroxyproline dehydrogenase，HYPDH，由PRODH2编码）能将4-羟基-L-脯氨酸转化为4-羟基-2-酮戊二酸，进而在4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶1（4-hydroxy-2-oxoglutarate aldolase 1，HOGA1）的催化下生成乙醛酸。此外，甘氨酸也能在D-甘氨酸氧化酶（DAO）的催化下生成乙醛酸。而乙醛酸可在乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDHA）的催化下氧化形成草酸。草酸是人体代谢的终产物，人体内缺少可以进一步代谢草酸的酶，但特定的肝酶可以降解乙醛酸以防止草酸过度生成，例如丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶（alanine-glyoxylate aminotransferase，AGXT）能催化乙醛酸转化为甘氨酸，乙醇酸还原酶/羟丙酮酸还原酶（glycolate reductase/hydroxypyruvate reductase，GRHPR）能催化乙醛酸转化为乙醇酸。为了探究MASH中草酸代谢失调情况，研究人员检测了人类肝脏中有关乙醛酸代谢和草酸形成的关键调节因子的表达。首先，研究人员在206例肝移植供体（小编注：这206位供体肝脏的选择标准是不伴有肝病，但由于供体年龄从十几岁到六十几岁不等，可能这些供体的肝脏本身有一些脂质积累但未达到确诊疾病的程度）（GSE26106）中探究了上述基因与肝脂肪变性之间的关系。结果表明，AGXT和PRODH2的表达水平与肝脏脂肪含量负相关，且AGXT的负相关性最显著（图1a，蓝色箭头）。研究人员通过回归模型分析了MASH患者或非MASH患者肝脏转录组学（GSE83452和GSE61260），发现在所有乙醛酸/草酸代谢相关基因中，只有AGXT表达与MASH显著负相关（图1a，紫色箭头）。接下来，研究人员利用终末期MASH患者与健康人的肝脏标本（图1b），评估了草酸代谢失调情况。其中，MASH患者和健康对照组在种族、年龄和性别上没有明显差异（扩展数据图1a）。研究人员发现MASH患者肝脏中AGXT的基因表达水平和蛋白质水平显著下降（图1c-e），而其他调节乙醛酸代谢或草酸形成的基因（GRHPR、PRODH2、HOGA1、HAO1、LDHA）表达没有明显变化（图1c）。此外，尽管MASH患者肝脏中LDHA的mRNA和蛋白水平没有明显差异（图1c和扩展数据图1b-c），但MASH患者肝脏中LDHA活性显著增强（图1f）。与此一致的是，MASH患者肝脏中草酸浓度显著增加（图1g）。值得注意的是，研究人员发现肝脏AGXT蛋白质水平与肝脏草酸浓度、NAFLD活动评分（NAS，反映MASH严重程度）均显著负相关（扩展数据图1d-e），而肝脏草酸浓度与NAS呈正相关（扩展数据图1f）。此外，与健康对照组相比，MASH患者血浆转氨酶和草酸浓度显著升高 （扩展数据图1g）。

接下来，研究人员给小鼠喂食12周或24周的高脂肪、高果糖、高胆固醇饲料（MASH饲料）以构建早期或晚期MASH小鼠模型（图1h和扩展数据图2a）。小鼠肝脏HE和天狼星红染色显示在喂食12周时小鼠肝脏出现轻度炎症和纤维化（扩展数据图2b），在24周时出现晚期脂肪性肝炎和纤维化（图1i）。与对照组相比，在早期MASH小鼠肝脏中，AGXT mRNA和蛋白质水平显著降低（扩展数据图2c-e），而LDHA mRNA和蛋白质水平显著增加（扩展数据图2c，f-g），同时乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性增强（扩展数据图2h），导致肝脏中草酸浓度显著上调（扩展数据图2i）。同样的，在晚期MASH小鼠中， 肝脏AGXT表达显著抑制（图1j-l），而LDHA表达显著上调（图2j和扩展数据图2j-k），同时LDH活性和肝脏草酸浓度也明显升高（图1m-n）。此外，离子色谱-质谱（IC-MS）结果同样证明了MASH小鼠肝脏中草酸浓度显著上调（扩展数据图21）。与人类相似，小鼠肝脏AGXT蛋白水平与MASH严重程度呈负相关（扩展数据图2m），而肝脏草酸浓度与MASH严重程度呈正相关（扩展数据图2n）。为了探究AGXT对MASH的抑制作用与饮食或性别是否有关，研究人员更换MASH饲料类型，给雄性和雌性小鼠喂食16周的果糖-棕榈酸酯-胆固醇（FPC），构建MASH模型（扩展数据图3a-b）。在FPC饮食诱导的MASH小鼠中，雄性小鼠和雌性小鼠肝脏中AGXT蛋白质水平均显著下降（扩展数据图3c-f）。有研究表明，肝脏脂肪变性中的高甲基化水平介导了AGXT的下调。于是，研究人员利用简并代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）对全基因组DNA甲基化进行无偏倚分析，发现晚期MASH小鼠肝脏中AGXT启动子和第一个外显子的甲基化水平显著增加（图S1和扩展数据图3g），提示可能是高甲基化水平抑制了晚期MASH小鼠肝脏中AGXT表达。最后，为了探究肝细胞中的脂质积累是否抑制AGXT并促进草酸积累，研究人员培养了正常饮食小鼠的原代肝细胞和HepG2细胞（人肝癌细胞系），并用棕榈酸（PA）处理诱导脂质积累（扩展数据图3h-i）。结果表明，PA处理显著抑制了原代肝细胞和HepG2细胞中AGXT mRNA和蛋白表达水平（扩展数据图3j，图1o-p），促进了细胞内草酸积累（图1q，扩展数据图3k），并且原代肝细胞和HepG2细胞中草酸积累量分别与使用250µM和500µM外源草酸钠（NaOX）处理相当。研究人员分别用250µM和500µM NaOX处理原代肝细胞和HepG2细胞，发现细胞内均未形成草酸盐晶体，而在用5mM以上NaOX处理的细胞中可见草酸盐晶体。总之，这些结果表明，在MASH患者和MASH小鼠模型中，肝脏AGXT表达受抑制，同时LDHA活性增强，最终导致草酸过度生成。

                 图1.MASH患者和小鼠肝脏中，AGXT抑制后LDHA激活，从而促进草酸过度生成

                                                     扩展数据图1.MASH患者草酸代谢失调

                                                  扩展数据图2. MASH小鼠草酸代谢失调

            扩展数据图3. MASH增加了AGXT甲基化水平并抑制其表达，以及在肝细胞中优化草酸处理条件

                                                             图S1.MASH中AGXT的高甲基化

2.肝细胞特异性过表达AGXT可以抑制肝脏草酸生成，改善MASH

在MASH进程中AGXT持续下调，伴随着的肝脏草酸过量产生与MASH严重程度相关，并且据报道AGXT的缺失加速了小鼠MASH的进展（小编注：之前的文章主要讲的是AGXT缺失后，甘氨酸生成减少，促进MASH，并没有引入草酸。本文的新意是AGXT促进乙醛酸转化为甘氨酸后，草酸形成的前体减少，导致草酸积累减少，而草酸积累会抑制PPARα和FAO从而诱导肝脏脂肪变性、促进单核细胞浸润和肝脏炎症，因此，过表达AGXT减少草酸积累可以改善MASH）。因此，研究人员给小鼠注射了肝细胞特异性甲状腺素结合球蛋白（TBG）启动子驱动的AAV8-AGXT或AAV8-GFP，并用MASH饲料喂养24周，构建肝细胞特异性过表达AGXT的MASH小鼠模型（图2a）。TBG驱动的GFP仅在肝细胞中表达（扩展数据图4a），并且注射AAV8-AGXT仅诱导肝脏中AGXT表达上调（图2b-c），不会影响肝外组织（肾）中AGXT表达（扩展数据图4b）。随后，研究人员发现肝细胞特异性过表达AGXT显著抑制了小鼠肝脏中草酸含量（图2d）。此外，与对照组相比，过表达AGXT不影响小鼠体重（图2e），但肝脏重量、肝脏与体重之比显著降低（图2f-g）。同样的，肝细胞特异性过表达AGXT的小鼠血浆中天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）水平显著降低（图2h-i）。尽管过表达AGXT不影响小鼠的肥胖程度（图2,扩展数据图4c），但过表达AGXT小鼠的肝脏明显变小（扩展数据图 4c-d），并且肝脂肪变性、肝小叶炎症和总体NAS评分显著降低（图2j-k）。值得注意的是，向正常饮食的小鼠注射AAV8-AGXT后（扩展数据图4e-f），小鼠肝脏草酸浓度有轻微下降的趋势（扩展数据图4g），肝重比、血浆AST和ALT水平、肝脏组织学等肝损伤指标均无显著差异（扩展数据图4h-m）。总之，这些结果表明，通过肝细胞特异性过表达AGXT来降低肝脏草酸的过量产生，可以有效改善MASH。

                                         图2.肝细胞特异性过表达AGXT降低草酸可改善MASH

                                 扩展数据图4.在MASH或正常饮食小鼠肝细胞中特异性过表达AGXT

3.过表达AGXT可通过诱导FAO来抑制肝脏脂肪变性

为了探究过表达AGXT降低草酸水平并改善MASH的潜在机制，研究人员对MASH饮食的AAV8-GFP和AAV8-AGXT小鼠肝脏进行了RNA-seq。主成分分析（PCA）显示，AAV8-AGXT小鼠的肝脏基因表达模式与用AAV8-GFP处理的小鼠不同（图3a）。与AAV8-GFP小鼠相比，过表达AGXT小鼠肝脏中检测到超过700个差异表达基因（DEGs），分别有508个下调基因和199个上调基因（图3b）。其中，最显著的上调基因是细胞色素P450 CYP2家族成员，如调节FAO和多不饱和脂肪酸（PUFA）代谢的Cyp2c37、Cyp2c50、Cyp2c54和Cyp2e1，以及已知的抗炎巨噬细胞标志物Cd163。而最显著的下调基因是MASH中纤维化和炎症反应的调节因子，包括E74样因子3（Elf3）和骨形态发生蛋白8b （Bmp8b） 。KEGG分析表明，过氧化物酶体途径以及与FAO相关的其他关键途径（包括脂肪酸降解和过氧化物酶体增殖激活受体（PPAR）信号通路）是最显著的富集途径（图3c）。研究人员通过qRT-PCR（图3e）对RNA测序（图3d）结果进行验证，也明确了驱动肝脏FAO的关键基因在过表达AGXT小鼠的肝脏中显著上调，其中包括FAO的主调控因子Ppara，以及PPARγ辅激活因子1α （Ppargc1a）和众多PPAR α下游靶基因（如肉碱棕榈酰基转移酶1A（Cpt1a）、酰基辅酶a脱氢酶中链（Acadm）、酰基辅酶a脱氢酶长链（Acadl）、酰基辅酶a脱氢酶长链（Acadvl）、酰基辅酶a氧化酶1（Acox1）、羟酰基辅酶a脱氢酶亚基α （Hadha）、Hadhb、乙酰辅酶a酰基转移酶2（Acaa2）和乙酰辅酶a合成酶长链1 （Acsl1））。由于增加脂肪酸利用率可以减少肝脏脂质积累，研究人员接下来对AAV8-GFP和AAV8-AGXT MASH小鼠的肝脏进行切片，并利用油红O染色检测脂质积累，发现结果与转录组的改变一致，过表达AGXT小鼠的肝脏中脂质积累显著减少（图3f-g）。此外，肝脏裂解物的生化分析也证实AGXT过表达显著降低了肝脏甘油三酯水平（扩展数据图5a）。为了全面评估MASH期间AGXT过表达对脂质和脂肪酸组成的影响，研究人员采用非靶向脂质组学进行进一步研究。PCA结果显示，AAV8-AGXT小鼠肝脏中的整体脂质组与用AAV8-GFP小鼠不同（图3h）。非靶向脂质组一共检测和注释出315种脂质代谢物，其中有132种在两组间存在显著差异，分别有71种在AAV8-AGXT小鼠肝脏中显著降低，而有61种显著升高（扩展数据图5b）。值得注意的是，在过表达AGXT的小鼠肝脏中，饱和脂肪酸减少，PUFA增加（图3i），而与MASLD/MASH相关的促炎和脂毒性鞘脂代谢产物，包括鞘磷脂、神经酰胺和己糖神经酰胺等也显著减少（图3i和扩展数据图5c-f）。此外，通过硫代巴比妥酸反应物（TBARS）测定，过表达AGXT小鼠的肝脏中脂质过氧化标志物丙二醛（MDA）水平也显著降低（扩展数据图5g）。值得注意的是，在正常饮食的小鼠中，肝细胞特异性过表达AGXT不会导致Ppara及其调控FAO的靶基因的显著上调（扩展数据图5h），或肝脏甘油三酯的降低（扩展数据图5i）。总之，这些结果说明，AGXT的过表达降低草酸水平并改善MASH的机制主要是通过诱导FAO。

                图3.肝细胞特异性过表达AGXT降低草酸可通过促进脂肪酸β氧化途径抑制肝脏脂肪变性

                 扩展数据图5.肝细胞特异性过表达AGXT对MASH或正常饮食喂养小鼠肝脏脂肪的影响

4.草酸通过抑制PPARα和FAO来诱导脂肪变性

考虑到脂质积累会导致肝细胞中草酸水平增加，而AGXT过表达可减少草酸积累，并通过诱导FAO通路减轻肝脏脂质堆积，因此研究人员进一步探究草酸是否影响了肝细胞脂质代谢。通过尼罗红染色，研究人员发现用NaOX（所用的NaOX浓度分别为250µM和500µM，前文已证实该浓度可引起细胞内草酸积累（图1q和扩展数据图3k））处理原代肝细胞和HepG2细胞会诱导脂质积累（图4a-b）。为了探究草酸促进肝细胞脂质积累的机制，研究人员分别在原代肝细胞和HepG2细胞中，检测了NaOX处理后，与脂肪酸摄取和转运、脂肪酸/脂质生物合成及FAO等相关的基因表达变化。发现NaOX处理不影响原代肝细胞和HepG2细胞中脂肪酸摄取和运输相关基因（包括CD36、溶质载体家族27成员2（SLC27A2）、SLC27A4和SLC27A5等）的表达，但显著促进了原代肝细胞中脂肪酸/脂质生物合成相关基因表达（如脂肪酸合成酶（Fasn）和乙酰辅酶a羧化酶α（Acaca）），但不影响硬脂酰辅酶a去饱和酶1（Scd1）和脂合成相关主要调节因子甾醇调节元件结合转录因子1（Srebf1）的表达（扩展数据图6a-c）。此外，在HepG2细胞中，NaOX处理并未影响脂肪酸/脂质生物合成相关基因表达（扩展数据图6d）。然而，与以上这些相反，在用NaOX处理的原代肝细胞和HepG2细胞中，PPARA及其调控FAO的靶基因PPARGC1A、CPT1A和ACADM均显著下调（图4c-d），这些结果与AAV8-AGXT小鼠肝脏中草酸水平及转录组变化相对应。CPT1α受PPARα调节，可将酰基辅酶a转化为酰基肉碱，使其能够进入线粒体中发生β氧化，是FAO的限速步骤，WB结果验证了CPT1α在转录水平上的改变，NaOX显著降低了CPT1α的蛋白丰度（图4e）。为了进一步评估草酸过量是否会诱导肝细胞脂质积累，研究人员分别用草酸前体羟脯氨酸和乙醇酸处理原代肝细胞和HepG2细胞。结果显示，草酸前体处理会引起原代肝细胞和HepG2细胞中脂质积累呈剂量依赖性增加（扩展数据图6e-g），在用10 mM羟脯氨酸和乙醇酸处理的细胞中效果最为显著。同样的，在用10 mM羟脯氨酸或乙醇酸处理的原代肝细胞和HepG2细胞（扩展数据图6k-l）中，PPARA及其靶基因CPT1A也显著下调，同时细胞内草酸显著增加（扩展数据图6m-o）。综上所述，这些研究表明肝细胞中草酸的过量产生和积累通过抑制PPARα来诱导脂质积累。

接下来，研究人员试图探究草酸如何抑制PPARA以及PPARA所调控的FAO基因表达。为了检验草酸是否在转录水平上影响PPARA的表达，研究人员在HepG2细胞中加入放线菌素D（RNA Pol II抑制剂，可抑制RNA转录），发现NaOX在没有放线菌素D的情况下显著降低了PPARA的表达，但加入放线菌素D后消除了这种作用，这表明草酸抑制了PPARA的转录（扩展数据图7a）。为了直接评估PPARA从头转录，研究人员进一步采用了生物正交“点击”化学方法，应用Click-iT Nascent RNA Capture assay对HepG2细胞的新合成RNA进行检测。该实验使用一种特殊的核苷酸类似物——5-乙炔基尿苷（EU），EU对mRNA结合的亲和力比内源性尿嘧啶高10倍，因此通过生物正交方法来检测具有高灵敏度。研究人员在有或没有NaOX、含或不含炔基修饰核苷5-乙基尿苷（EU）的情况下，对HepG2细胞进行培养，并利用链霉亲和素磁珠捕获并沉淀含EU的新合成mRNA，通过检测基因表达分析PPARA转录本的从头合成。结果显示，NaOX存在时，PPARA的新生转录显著减少（图4f）。为了评估草酸是否直接调节PPARα的转录活性，研究人员接下来使用了双荧光素酶报告系统。研究人员用PPAR反应元件（PPRE）报告基因（PPREx3-TK-荧光素酶）、人PPARα和Renilla载体转染HepG2细胞，用加或不加NaOX或用PPARα激动剂Wy14643作为阳性对照。结果表明，NaOX处理显著降低了PPARα的转录活性（图4g），这与PPARA及其靶基因的下调一致。为了确定草酸的作用是否由PPARα介导，研究人员接下来分别在NaOX处理后的细胞中恢复PPARα的表达（扩展数据图7b）和活性（Wy 14643）并检测其靶基因表达。研究人员发现，在 NaOX处理后的HepG2细胞中过表达PPARα逆转了NaOX对CPT1A和ACADM的抑制（图4h），添加Wy14643也发现了类似的结果（扩展数据图7c）。由于PPARα会诱导调节线粒体FAO的基因表达，而草酸处理会抑制这些基因的表达，因此研究人员接下来使用Seahorse实验来评估草酸对线粒体生物能的影响。结果显示，NaOX处理的HepG2细胞的基础呼吸、最大呼吸和ATP产生显著减少（扩展数据图7d-e）。而恢复PPARα会逆转这些影响（图4i和扩展数据图7f），同时消除了NaOX诱导的脂质积累（图4j和扩展数据图7g）。研究人员猜测这些影响可能是由于CPT1α缺失后脂肪酸无法转运到线粒体中进行FAO造成的。因此，研究人员用加或不加NaOX和CPT1α抑制剂etomoxir的方法处理HepG2细胞，通过Seahorse测量线粒体呼吸。结果显示，用NaOX处理的HepG2细胞不受etomoxir的影响，而对照细胞中CPT1α的抑制显著降低了耗氧率，达到与草酸处理的细胞相当的水平（图4k），这表明草酸主要通过抑制FAO来抑制肝细胞中的线粒体呼吸。此外，与受损的线粒体功能一致，NaOX能显著促进线粒体超氧化物的产生（扩展数据图7h-i）。总之，这些发现表明草酸通过抑制PPARα和减弱线粒体呼吸中脂肪酸的转运和利用，刺激肝细胞中的脂质积累。

考虑到AGXT的过表达通过诱导FAO通路改善小鼠的MASH，研究人员进一步探究这些作用是否通过减少肝细胞中草酸的过量产生来介导。研究人员发现，与GFP对照相比，AGXT的短暂过表达足以显著降低PA诱导的HepG2细胞内草酸含量（图4l-m），同时尼罗红染色显示脂质积累显著减少（图4n，扩展数据图7j）。此外，PA和过表达AGXT处理的HepG2细胞显示PPARα靶基因CPT1A和ACADM的表达增强（图4o），CPT1α蛋白丰度增加（图4p）。此外，Seahorse实验表明，与GFP对照相比，PA处理的HepG2细胞中AGXT的过表达显著增强了基础呼吸、最大呼吸和ATP的产生（图4q和扩展数据图7k），同时抑制了线粒体超氧化物的形成（扩展数据图7l-m）。总之，这些数据表明，抑制草酸的过度产生可通过诱导调节FAO和线粒体呼吸的基因表达来减少肝细胞中的脂质积累。

                                          图4.草酸通过抑制PPARα调控的FAO诱导肝细胞脂质积累

                                   扩展数据图6.草酸及其前体对肝细胞脂质代谢相关基因的影响

      扩展数据图7.草酸处理和AGXT过表达对肝细胞中PPARα、线粒体生物能量学和线粒体功能的影响

5.过表达AGXT可减轻MASH的炎症和纤维化

肝脏脂毒性可促进促炎反应，从而在MASH进展过程中促进白细胞浸润。如前所述，与AAV8-GFP小鼠相比，AAV8-AGXT MASH小鼠肝小叶炎症显著减少（图2j-k）。同时，基于肝脏RNA测序的KEGG通路分析显示，涉及炎症的多个通路均显著下调，包括趋化因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用以及核因子（NF）-κB和肿瘤坏死因子（TNF）信号通路（图5a）。基因表达结果和RNA测序分析均显示，AAV8-AGXT小鼠肝脏中NF-κB和TNF信号通路的关键基因显著下调（图5b-c），包括Nfkb2、Relb和TNF，以及趋化因子（C-C motif）配体2（Ccl2）和Ccl5（Ccl5被认为是MASH的驱动因素和治疗靶点，与Ccr2一起调节MASH中单核细胞来源细胞的募集）。另外，F4/80的免疫荧光显示，AAV-AGXT的小鼠肝脏中总体肝巨噬细胞显著减少（扩展数据图8a-b）。有研究报道，在MASH小鼠的肝脏中，单核细胞来源的浸润性巨噬细胞会在肝细胞周围形成具有大脂滴的冠状结构，其分为两个亚群，分别主要表达Ccr2或Trem2。于是研究人员进一步评估了两组小鼠肝脏中免疫细胞亚群的变化。结果显示，AAV8-AGXT小鼠肝脏的F4/80+ CCR2+巨噬细胞和F4/80+ TREM2+巨噬细胞水平均显著降低（图5d-g），而Ly6G+中性粒细胞没有明显变化（扩展数据图8c-d）。这些结果说明，在肝脏中过表达AGXT会阻碍单核细胞向肝脏的募集，因此研究人员接下来评估了草酸是否具有潜在的趋化作用。为此，研究人员进行Transwell侵袭实验，将HepG2细胞置于底孔，荧光标记的人原代血液单核细胞（hPBMs）置于顶孔，检测NaOX处理HepG2细胞后hPBMs的迁移情况。与体内研究结果一致，研究人员发现HepG2细胞经NaOX处理后CCL2上调，在过表达PPARɑ后能逆转这种趋势（图5h，扩展数据图8e）。同时，用NaOX处理后，hPBMs向含有HepG2细胞的底孔的转移率显著提高（扩展数据图8f-h）。为了验证CCL2是否介导草酸的趋化作用，研究人员使用siRNA （siCCL2）敲除HepG2细胞中的CCL2，通过检测基因表达证实敲除成功（扩展数据图8i）。同样将HepG2细胞置于Transwell的底孔中，接着用siCCL2或乱序siRNA对照（siCTL）进行处理，检测NaOX对荧光标记的hPBMs迁移率的影响（图5i）。在对照细胞中，NaOX处理会引起单核细胞迁移率的显著升高，而这种作用在CCL2敲除后被显著降低（图5j，扩展数据图8j）。综上所述，这些数据表明草酸通过上调肝细胞CCL2来促进单核细胞趋化，而AGXT过表达能降低MASH中草酸的过量产生，减轻单核细胞浸润和肝脏炎症。

肝纤维化是MASH中导致肝脏相关事件和高死亡率的主导因素。AAV8-AGXT小鼠除了促炎途径被抑制外，KEGG途径分析还显示肝纤维化相关途径显著下调，包括局灶粘连信号、肌动蛋白细胞骨架和细胞外基质（ECM）-受体相互作用（图5a）。基因表达和RNA-seq结果均表明，在AAV8-AGXT小鼠中，与肝纤维化和ECM重塑相关的关键基因均显著下调（图6a-b）。前者包括转化生长因子（TGF）β信号通路中的Tgfb1、Tgfb2、Tgfbr1和Tgfbr2（图6b），后者包括I型胶原蛋白、α-1（Col1a1）、Col1a2和Col4a1。这些基因转录组的改变表明，过表达AGXT能减少肝纤维化，于是研究人员接下来通过组织病理学、免疫荧光分析以及生化验证来评估肝纤维化。天狼星红染色结果表明，AAV8-AGXT小鼠体内胶原堆积显著减少（图6c-d），纤维化评分降低（图6e）。同时AAV8-AGXT小鼠肝脏羟脯氨酸含量明显降低（图 6f）（小编注：肝纤维化的特征是细胞外基质大量增生并积累，而胶原是细胞外基质的主要成分。羟脯氨酸是胶原的主要成分之一，约占胶原氨基酸总量的13%，对胶原的形成和结构稳定性具有重要作用，并且几乎所有的羟脯氨酸都存在于胶原中。因此，肝脏中羟脯氨酸含量是反映肝纤维化程度的分子指标之一，其含量与肝纤维化程度呈正相关）。与这些结果相一致，α-平滑肌肌动蛋白（SMA）免疫荧光显示，在AAV8-AGXT小鼠肝脏中，肝星状细胞（驱动纤维化的主要细胞）的数量减少（图6g-h）。最后，研究人员通过非靶向脂质组学与RNA-seq，探究AGXT过表达引起的脂质代谢改变与肝脏炎症和纤维化之间的联系。PCA显示，AAV8-AGXT小鼠肝脏的整合脂质组和转录组与AAV8-GFP小鼠不同（扩展数据图9a）。值得注意的是，在AAV8-AGXT小鼠肝脏中，已知的促炎和促纤维化基因表达降低（Nfkb2、Relb、Ccl2、Ccl5、Tgfb3和Bmp8b），这与促炎和脂毒性鞘脂代谢物的丰度降低相一致（鞘磷脂、神经酰胺和己糖神经酰胺；扩展数据图9b）。由此可得出结论，促炎/纤维化基因的表达与鞘脂代谢产物丰度呈显著正相关（扩展数据图9c），而与PUFAs丰度呈负相关（小编注：作者并未进一步探究鞘脂代谢产物、PUFAs和促炎/纤维化基因之间是否具有调控关系，但鞘脂代谢产物（例如神经酰胺、鞘氨醇-1-磷酸（S1P））的积累通常会引发促炎反应。本文中作者并未具体指出相关性具体检测的是哪种PUFAs的丰度，也并未查到PUFAs总含量与炎症/纤维化是否具有调控关系。通常不同的PUFAs在抗炎或促炎方面也表现不同，例如花生四烯酸会形成前列腺素、血栓素等促炎因子，而二十碳五烯酸则会竞争结合环氧合酶、脂加氧酶等减少促炎因子分泌发挥抗炎作用。看图3i的结果，确实也是C20:5的增加比较明显，所以作者可能在这里认为PUFAs是抗炎的脂类代谢物）（扩展数据图9d）。综上，这些数据表明，MASH中AGXT过表达能降低草酸，保护肝脏免受炎症和纤维化，并降低脂肪毒性。

          图5. 在MASH小鼠肝脏中过表达AGXT能降低草酸水平，减少单核细胞浸润并减轻肝炎和肝纤维化

                               图6.在MASH小鼠肝脏中过表达AGXT降低草酸水平并减少肝纤维化

               扩展数据图8. 草酸通过CCL2诱导单核细胞趋化，过表达AGXT降低草酸可减少肝巨噬细胞

                                   扩展数据图9.过表达AGXT的小鼠肝脂质组和转录组的整合分析

6.通过药理学方法抑制草酸产生能减轻MASH

由于AGXT过表达能降低肝脏草酸过量产生并防止MASH，研究人员接下来试图探究：（1）这些保护作用是单纯由AGXT介导还是通过降低草酸的作用导致；（2）评估靶向减少肝脏草酸过量的药物是否在MASH中具有治疗价值。如前所述，GO能将乙醇酸转化为乙醛酸，乙醛酸能被AGXT清除，也能被LDHA催化形成草酸（图1a）。由于此前发现，在患有MASH的人类和小鼠肝脏中LDHA活性增强（图1f-m），以及最近在靶向GO或LDHA治疗原发性高草酸尿症方面取得的进展，研究人员设计开发了水杨酸衍生物MDMG-935P（图7a），它能通过抑制GO和LDHA有效地减少草酸产生。为了评估降低草酸的治疗潜力，研究人员接下来检测MDMG-935P在MASH小鼠中的作用。首先让小鼠进行MASH饮食24周，在后12周MASH饮食期间，每天口服5mg/kg或10mg/kg MDMG-935P（图7b）。此前研究表明，让原发性高草酸尿症小鼠每日口服20mg/kg （20mg/kg/d）MDMG-935P，仅持续5天就能有效地降低草酸（小编注：原发性高草酸尿症（Primary Hyperoxaluria，PH）是罕见的常染色体隐性遗传性疾病，主要是由于编码肝脏中草酸生成相关酶的基因发生突变，导致肝脏中草酸生成过量。由于机体中没有降解草酸的酶，过量的草酸只能通过尿液排出，而体内高浓度草酸容易与Ca2+结合生成难溶的草酸钙，例如在肾小管中形成结晶，引发肾结石、肾钙质沉着等。因此PH患者往往存在慢性小管间质炎症、结石引发的肾脏梗阻，甚至肾衰竭等。当肾脏清除草酸能力受损，草酸会在多种组织中积累，进一步引发多器官疾病。PH主要分为三种类型，PH1由AGXT基因突变引起，PH2由GRHPR基因突变引起，PH3由HOGA1基因突变引起。其中PH1是最常见、最严重的类型，其肾衰竭发病率较高，甚至在婴儿期就可能出现）。考虑到治疗持续时间较长，研究人员选择每日给药10mg/kg。到实验终点，研究人员发现10mg/kg/d MDMG-935P能显著降低肝脏LDH活性（图7c）和草酸水平（图7d），而5mg/kg/d则没有显著影响。此外，MDMG-935P处理没有改变肝脏中GO和LDHA的mRNA（扩展数据图10a-b）和蛋白质（扩展数据图10c-f）水平（小编注：水杨酸衍生物MDMG-935P结构中同时带有GO和LDHA的底物类似物的结构，其能进入对应酶的催化位点，竞争性抑制GO/LDHA酶活性，因此并不影响肝脏本身GO/LDHA的mRNA和蛋白质水平）。与安慰剂组小鼠相比，10mg/kg/d MDMG-935P显著降低了肝脏重量（扩展数据图10g）和肝体重比（图7f），而体重没有明显变化（图7e）。此外，10mg/kg/d MDMG-935P小鼠的肝损伤循环标志物AST（图7g）和ALT（图7h）显著降低。研究人员通过观察腹腔的大体形态，发现各组小鼠的肥胖程度没有明显差异（扩展数据图10h），但肝脏的组织病理学分析（图7i）显示，在10mg/kg/d MDMG-935P小鼠中，脂肪变性、肝小叶炎症、肝细胞球囊和总体NAS显著减少（图7j）。同时，肝脏裂解物的生化分析证实，10mg/kg/d MDMG-935P小鼠肝脏中甘油三酯显著降低（图7k），这与脂肪变性评分的降低一致。此外，在10mg/kg/d MDMG-935P处理的小鼠肝脏中，调控FAO的基因显著上调，包括Cpt1a、Acadl、Acadvl、Hadha、Hadhb和Acaa2等，这也与草酸对FAO的抑制结果相一致（图71）。值得注意的是，在正常饮食的小鼠中，10mg/kg/d MDMG-935P处理12周，对体重和肝脏重量、肝脏草酸、循环转氨酶、肝脂肪变性或FAO调控基因的表达没有显著影响（扩展数据图10i-p）。总之，这些数据表明，通过抑制GO和LDHA来靶向MASH中肝脏草酸的过量产生，能增强FAO和降低肝脂肪变性，起到一定的治疗效果。

                                   图7.靶向减轻肝脏草酸过量产生的药理学方法可改善MASH

                                 扩展数据图10.MDMG-935P处理对MASH或正常饮食小鼠的影响

7.抑制草酸的形成可以抑制炎症和纤维化

鉴于AGXT过表达可减轻MASH中肝脏炎症和纤维化，于是研究人员进一步探究了在MASH小鼠中，药理靶向肝脏草酸的过量产生是否足以抑制促炎和促纤维化反应。与过表达AGXT的小鼠的研究结果一致，给予小鼠10mg/kg MDMG-935P（而非5mg/kg）可显著降低促炎反应的关键趋化因子和细胞因子的表达，包括Ccl2、Ccl5和Tnf（图8a）。与之相符，F4/80的免疫荧光显示，与对照组相比，10mg/kg/d MDMG-935P处理小鼠肝脏中的肝巨噬细胞显著减少（图8b-c）。巨噬细胞亚群的免疫荧光分析表明，在接受10mg/kg/d MDMG-935P治疗的小鼠肝脏中，单核细胞来源的F4/80+ CCR2+巨噬细胞（图8d-e）和F4/80+ TREM2+巨噬细胞（扩展数据图10q-r）明显减少。此外，10mg/kg MDMG-935P的治疗具有明显的抗纤维化作用，并且能显著降低TGFβ信号传导和ECM重塑途径中关键基因的表达，包括Tgfb1、Tgfb2和Col1a2（图8f）。这些发现与组织病理学分析以及纤维化的生化评估相一致，结果显示，在接受10 mg/kg/d MDMG-935P治疗的小鼠中，天狼星红染色（图8g-i）、SMA免疫荧光（图8h-j）和肝脏羟脯氨酸含量（图8k）均显著降低。最后，纤维化评分评估显示，对照组与5mg/kg/d MDMG-935P组之间的水平相似，而10mg/kg/d MDMG-935P组呈下降趋势，但未达到统计学意义（P=0.0798；图8l）。总的来说，这些数据表明，在MASH小鼠中通过药理学方法抑制草酸过量产生，可抑制草酸诱导的促炎反应和肝纤维化。

                                       图8.药理学靶向肝脏草酸过量产生可减少肝脏炎症和纤维化

总结：

本文研究人员通过对人类MASH临床样本、MASH 小鼠模型和体外肝细胞实验，揭示了AGXT 抑制和 LDHA 激活可导致草酸过量产生促进MASH发生发展。机制上，一方面草酸通过抑制PPARα转录进而抑制脂肪酸β氧化，导致线粒体脂肪酸利用受损和脂毒性，另一方面，草酸可促进促炎反应的关键趋化因子和细胞因子的表达，促进炎症的发展。通过遗传学 (肝脏过表达 AGXT) 和药理学 (水杨酸类似物MDMG-935P) 靶向草酸过量产生可降低 MASH 中的肝草酸，进而诱导 PPARα 驱动的脂肪酸氧化和抑制单核细胞趋化性、NF-κB 和 TGFβ 靶点来改善肝脏脂肪变性、炎症和纤维化。这些发现揭示了靶向肝脏草酸过量有望成为治疗MASH的新方法。

链接：https://www.nature.com/articles/s42255-024-01134-4