代谢学人Cell Metabolism：脂肪转录奥秘深，m6A标记引路人

撰文| 胡敏 武霞 张俊 马莹 郭明伟 

编辑| 孟美瑶 

校对| 张俊

背景介绍

棕色脂肪组织（BAT）由于解偶联蛋白1（UCP1）介导的产热功能，已成为治疗和预防人类肥胖症及相关代谢疾病的潜在靶点。人体在冷刺激后，BAT 介导的能量消耗有助于减少体内脂肪。传统上认为BAT在冷刺激下具有产热能力，同时它也可以在能量消耗过程中，通过分泌因子的作用帮助利用营养物质（如葡萄糖、脂肪酸、支链氨基酸）来促进新陈代谢。

已有报道称BAT可通过分泌因子（包括肽、蛋白质、脂质或microRNAs）对全身代谢产生积极影响。特别是近年来，一类被称为BAT脂肪因子（lipokine）的脂质引起了人们的关注。脂肪因子最初是被定义为与全身代谢过程相关的脂肪组织分泌的脂质激素，包括对胰岛素敏感性、葡萄糖耐量和炎症的调节。例如，BAT经寒冷和运动诱导产生的12,13-diHOME可增强脂肪酸向BAT的转运，降低循环中的甘油三酯，并促进骨骼肌对脂肪酸的吸收。12-HEPE是另一种冷诱导的BAT分泌的脂肪因子，可刺激BAT和肌肉摄取葡萄糖。此外，BAT分泌的脂质如maresin 2可介导BAT-肝脏之间的抗炎作用。

拓展阅读

产热脂肪分泌的脂肪因子

近年来，哈佛大学医学院的曾玉华团队发现在冷刺激环境下，棕色和米色脂肪细胞会分泌三种lipokine，进而调节机体脂质和葡萄糖稳态，能量平衡和炎症反应。

早在2017年，该团队发表在《Nature Medicine》上的一项研究表明，寒冷和β3-肾上腺素处理能促进BAT中Ephx基因的转录，该基因编码一种环氧化物水解酶，通过作用于亚油酸产生12,13-二羟基十八烯酸（12,13-dihydroxy-octadecaenoic acid，12,13-diHOME），该脂质反过来作用于BAT，促进两种脂肪酸转运蛋白向细胞膜上易位，进而提高细胞吸收和利用甘油三酯（TG）的能力，最终维持机体代谢稳态。

2019年，该团队在《Cell Metabolism》上发表的一项研究表明，寒冷和β3-肾上腺素能促进产热脂肪中的12-脂氧合酶（12-LOX）的激活，随后催化ω-3多不饱和脂肪酸（PUFA）来产生12-羟基二十碳五烯酸（12-hydroxy-eicosapentaenoic acid，12-HEPE），通过类胰岛素的细胞内信号传导途径促进棕色脂肪细胞和骨骼肌细胞摄取葡萄糖，并通过适应性（UCP1-依赖和非依赖性）产热来维持体温。作者在讨论部分解释目前尚不清楚葡萄糖支持产热的具体机制，摄取的葡萄糖可能经过下游的糖酵解途径，进一步生成脂肪酸从头合成所需的底物乙酰辅酶A，而乙酰辅酶A等底物能够通过TCA循环和氧化磷酸化产生质子势能，为线粒体中的UCP1的解偶联作用或者无效肌酸循环等利用ATP的UCP1非依赖产热方式提供动力。

前两篇工作都聚焦于冷刺激通过BAT改善糖脂代谢来维持机体稳态。接下来，该团队进一步探究了冷刺激是否能通过BAT来改善肥胖引起的全身炎症。2022年，该团队发表在《Nature Metabolism》的工作表明，在BAT巨噬细胞中，冷刺激或激活β3-AR可以促进12-LOX和sEH的表达，进而分泌Maresin 2（MaR 2）进入体循环，该类脂质是一种介导炎症消退的特异性促炎症消退介质（specialized pro-resolving mediators，SPM）。循环中的MaR 2进一步作用于肝脏，促进单核细胞（CD45+ CD11b+ F4/80−）来源的Ly6Clow巨噬细胞数量，该亚群分泌抗炎因子，从而介导炎症消退反应。（详细研究结果请见我们往期精读，超链接：Nature Metabolism：寒冷抗炎新机制）

参考文献

[1] Lynes MD, Leiria LO, Lundh M, et al. Nat Med. 2017 May;23(5):631-637.

[2] Leiria LO, Wang CH, Lynes MD, et al. Cell Metab. 2019;30(4):768-783.e7.

[3] Sugimoto S, Mena HA, Sansbury BE, et al. Nat Metab. 2022;4(6):775-790.

N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是真核生物mRNA中最普遍、最丰富、最保守的转录后修饰。这种修饰主要由Writer复合物协调，该复合物由类甲基转移酶14（METTL14）、类甲基转移酶3（METTL3）、Wilms’ tumor 1-associated protein（WTAP）等蛋白组成。而脂肪和肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）或alkB同源物5（ALKBH5）等去甲基化酶可去除m⁶A。m⁶A修饰对mRNA代谢的影响主要取决于不同蛋白识别m⁶A的能力，从而调节mRNA的稳定性、翻译、剪接或输出。例如，YTH N(6)-甲基腺苷 RNA结合蛋白2（YTH N(6)-methyladenosine RNA binding protein 2，YTHDF2）或 YTH N(6)-甲基腺苷 RNA结合蛋白3（YTHDF3）对m⁶A的识别可控制目标mRNA的稳定性和翻译过程。

最近的研究表明，m⁶A的修饰与多种生理过程有关，包括对人类β细胞存活和功能，以及棕色/米色脂肪生成和产热的调控，但其在改变BAT分泌组来调控全身胰岛素敏感性方面的意义仍有待探索。

在本研究中，研究人员提出METTL14通过一种独立于UCP1的独特机制调节BAT的分泌功能，从而调节全身胰岛素敏感性。 BAT特异性Mettl14基因敲除（M14^KO）小鼠显示出更好的胰岛素敏感性和葡萄糖耐量，而与体重、性别或经典BAT产热无关。对小鼠BAT和人类棕色脂肪细胞（hBATs）进行的非靶向脂质组学分析发现，在METTL14缺乏之后，前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、前列腺素D2（PGD2）、前列腺素F2 alpha（PGF2a）和13,14-二氢-15-酮-PGE2都得到上调。PGE2 和PGF2a可抑制关键外周代谢组织中的AKT磷酸酶，从而改善全身胰岛素敏感性。从机制上讲，BAT中METTL14的缺乏会阻止编码前列腺素生物合成酶的PTGES2和CBR1转录本的降解，从而使其蛋白质水平增加。下调M14^KO-肩胛间BAT（iBAT）的Ptges2或Cbr1基因可逆转胰岛素敏感表型。综上所述，这些结果证明了一种新的机制，它将m⁶A甲基化与BAT分泌组结合起来，调节全身胰岛素敏感性，而不依赖于典型的BAT产热。

敲黑板啦！

1.缺失METTL14的BAT可通过器官间通讯改善胰岛素敏感性；

2.PGE2和PGF2a是BAT分泌的胰岛素增敏因子和iWAT棕色化诱导因子；

3.PGE2和PGF2a通过AKT信号轴来改善胰岛素敏感性；

4. 缺失METTL14会增加PTGES2和CBR1 mRNA的稳定性；

研究结果

1. 小鼠BAT缺失Mettl14可改善全身胰岛素敏感性和葡萄糖耐量，而与UCP1介导的产热无关

首先，为了确定在肥胖和胰岛素抵抗状态下m⁶A writers复合物的表达是否会发生改变，研究人员利用RT-qPCR对从非肥胖（体重指数[BMI] < 30）或肥胖（BMI≥30）的人体BAT活检组织（小编注：BAT是来源于通过PET/CT而确定具有BAT的健康志愿者和手术患者，一共6男7女，包括腹膜后脂肪、深腹部脂肪、肾上腺周围深层脂肪和腹膜后深层脂肪）进行了分析。与非肥胖者相比，肥胖者BAT中的METTL14（而非METTL3或WTAP）的基因表达显著上调（图1 A）。为了研究 BAT m⁶A 对全身胰岛素敏感性的影响，研究人员研究了全身胰岛素抵抗的小鼠模型。研究人员分析了一种遗传性胰岛素抵抗高血糖小鼠模型（即瘦素受体缺陷的db/db小鼠）iBAT 样本中m⁶A writers复合物METTL14、METTL3和WTAP的表达水平。与对照组相比，db/db小鼠在mRNA（图1B）和蛋白质（图1C和S1A）水平上都表现出更高的Mettl14。接下来，为了排除肥胖的影响，只探究胰岛素敏感性下降的影响，研究人员利用了肝脏特异性敲除胰岛素受体（LIRKO）小鼠模型，该模型在没有肥胖的情况下表现出严重的胰岛素抵抗。与对照组相比，LIRKOs中iBAT 的Mettl14基因和蛋白表达水平上调（图1D、1E 和S1B）。这些研究结果表明，METTL14在调节BAT功能以调节全身胰岛素敏感性和代谢平衡方面具有潜在作用。

为了直接研究METTL14的作用，研究人员通过将Mettl14-floxed（M14^fl/fl）动物与Ucp1-cre小鼠杂交，产生了BAT特异性M14^KO小鼠。研究人员在iBAT中验证了Mettl14的特异性敲除，与对照组（M14^fl/fl）相比，M14^KO小鼠的腹股沟白色脂肪组织（iWAT）、附睾白色脂肪组织（eWAT）、肝脏或肌肉等其他代谢组织中未观察到METTL14蛋白质丰度或基因表达的显著变化（图S1C-S1F），并且在肾脏、胸腺、下丘脑和肾上腺等非代谢组织（数据未显示）的蛋白质丰度或基因表达均未发生显著变化。M14^KO和对照组小鼠出生时的孟德尔比例正常，没有发育缺陷（数据未显示）。

为了探索METTL14在生理条件下的作用，研究人员首先让雌性和雄性小鼠食用正常粮食（CD）。缺失Mettl14的小鼠体重在以CD喂养的各组之间并无显著差异（图1 F）。但是不论雌性或者雄性，M14^KO小鼠的胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性均有所改善（图1G-1J）。

为了进一步研究M14^KO小鼠改善胰岛素抵抗的能力，研究人员用高脂饮食（HFD）（60% 脂肪含量）喂养小鼠，并与低脂饮食（LFD）（10% 脂肪含量）喂养的小鼠进行比较。HFD饮食的M14^KO小鼠体型较小（图S1G），表现出iBAT 增加，但iWAT、eWAT 和肝脏质量下降（图S1H）。同样，苏木精和伊红（H&E）染色显示，HFD喂养M14^KO的小鼠的棕色脂肪细胞数量多（图S1I），并且它的iWAT（图S1J）和eWAT（图S1K）中脂肪细胞的脂滴也较小。有趣的是，虽然HFD饮食增加了对照组棕色脂肪细胞的尺寸，但对M14^KO小鼠的棕色脂肪细胞大小没有显著影响（图S1I），这同样证明了敲除小鼠BAT中的脂肪细胞数量增加了。与对照组相比，HFD-M14^KO小鼠iWAT（图S1J）和eWAT（图S1K）中的脂肪细胞视觉上更小。令人惊讶的是，免疫组化（IHC）染色显示，M14^KO-iBAT的UCP1丰度较低（图S1I）。相反，LFD-M14^KO小鼠的iWAT中出现了UCP1阳性细胞（图S1J），表明WAT发生棕色化。与对照组相比，M14^KO小鼠免受HFD诱导的巨噬细胞浸润（如eWAT中F8/40 IHC染色所示）（图S1K）和肝脏脂肪变性（图S1L）。

接下来，作者通过胰岛素抵抗的稳态模型评估（HOMA-IR）来测量胰岛素抵抗。与对照组LFD饮食的雌性小鼠相比，对照组HFD饮食的雌性小鼠体重增加，空腹胰岛素水平升高（图1K-1P）。相比之下，M14^KO雌性小鼠在HFD条件下不表现出胰岛素抵抗，即空腹胰岛素水平较低，HOMA-IR有所改善（图1K-1N）。因此，与对照组相比，M14^KO雌性小鼠的胰岛素敏感性和葡萄糖耐量均有所改善，而且与饮食无关（图1O 和1P）。 雄性小鼠也出现了类似的变化（图1Q-1V）。

与对照组相比，以LFD饮食的M14^KO雌性小鼠血清中的脂联素水平升高（图S1M），但雄性小鼠的血清脂联素水平相似（图S1O）。LFD组间雌雄小鼠的循环瘦素水平相似（图S1N和S1P，左侧）；然而，两性WT小鼠中HFD诱导的瘦素水平上升，在M14^KO两性小鼠中得到缓解（图S1N和S1P，右侧）。总之，这些数据表明，在BAT中敲除Mettl14可改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐量，而与体重变化或饮食无关。

最后，研究人员研究了UCP1在观察到的M14^KO小鼠表型中的作用。 M14^KO-iBAT中UCP1蛋白丰度的降低（图S1I、S1Q和S1R）使他们推测，M14^KO小鼠胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性的增强是独立于UCP1介导的BAT产热作用的。为了探索这一假设，对两组独立的小鼠进行了为期7天的低温（5°C）或热中性（30°C）试验，以分别激活或关闭UCP1的活性。尽管存在这些条件，M14^KO 小鼠始终表现可以改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性（图1W-1Z）。此外，虽然M14^KO小鼠在iWAT中显示出PGC1α和UCP1蛋白表达上升（图S1S和S1T），耐寒性也有所提高（图S1U），但它们的能量消耗（图S1V）、耗氧量（图S1W）和二氧化碳产生量（图S1X）与对照组小鼠相当。这些结果证实了这一假设，即胰岛素敏感性和葡萄糖耐量表型的增强确实与经典的BAT产热无关（小编注：KO小鼠BAT中UCP1介导的产热能力下降，但是iWAT的UCP1产热能力上升。同时KO小鼠在寒冷环境下，其BAT分泌的lipokine通过作用于BAT本身，促进葡萄糖和TG的吸收和利用，然后TG经过脂肪甘油三酯脂酶（ATGL）介导的脂解作用，进一步提高非震颤的适应性产热，最终维持体温。至于能量消耗不变的原因，我们认为相比于对照组，KO小鼠的UCP1依赖型产热下降，但是被上述提到的其他产热途径所补偿，最终导致总体能量消耗不变）。

总之，这些结果表明，BAT中METTL14的缺失可改善全身胰岛素敏感性，而与体重减轻和典型BAT产热无关。

图 1| 敲除BAT中的Mettl14可改善小鼠全身胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性

图 S1| 敲除BAT中的Mettl14可改善HFD诱导的主要代谢组织中的变化

2. M14KO-BAT分泌的因子可增强小鼠外周代谢组织和人类原代代谢细胞对胰岛素的敏感性

在iBAT中敲除Mettl14后，可以改善胰岛素敏感性，这种改善与性别、体重减轻和UCP1介导的产热无关，这促使研究人员利用体内胰岛素刺激实验来研究组织特异性的胰岛素敏感效应。为此，研究人员对各组进行了体内腔静脉胰岛素注射，然后采集胰岛素刺激后的代谢组织进行分析（图2 A）。与对照组相比，M14^KO小鼠的肝脏蛋白激酶B丝氨酸473磷酸化（pAKT_s473）显著升高，与饮食或胰岛素刺激的胰岛素受体β亚基磷酸化或IGF1受体磷酸化（IRβ/IGF1Rβ）无关（图2B和2C）。

拓展阅读

胰岛素信号通路中的IRβ/IGF1Rβ和AKT

IRβ/IGF1Rβ：胰岛素受体（Insulin Receptor, IR）和胰岛素样生长因子1受体（Insulin-like Growth Factor 1 Receptor, IGF1R）都是跨膜受体酪氨酸激酶，它们在结构上具有高度相似性。胰岛素受体由两个α亚基和两个β亚基组成，其中β亚基具有酪氨酸激酶活性。当胰岛素结合到其受体的α亚基时，会引起β亚基的自磷酸化，从而激活受体的酪氨酸激酶活性。这种激活启动了下游的信号传导，包括IRS蛋白的磷酸化，进而激活PI3K/AKT信号通路。IGF1R在细胞生长和分化中也扮演着重要角色，它可以被IGF1或IGF2激活，并通过类似的机制启动信号传导。

AKT：AKT（又称蛋白激酶B, PKB）是胰岛素信号通路中的关键分子，它是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，由PI3K通过其产物磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸酯激活。AKT的激活需要在Thr308和Ser473位点的磷酸化，这一过程分别由PDK1和mTORC2催化。激活后的AKT可以促进细胞存活、抑制凋亡、促进细胞增殖和葡萄糖摄取，以及调节糖原合成和脂质代谢。AKT通过磷酸化多种底物，如GSK3、FoxO转录因子和mTOR，来执行其生物学功能。

在胰岛素敏感性方面，IRβ/IGF1Rβ和AKT的区别在于它们在信号通路中的位置和作用。IRβ/IGF1Rβ是信号传导的起点，它们通过自磷酸化激活下游的信号分子，而AKT是下游效应分子，直接参与细胞代谢和存活的调控。胰岛素敏感性降低可能与IRβ/IGF1Rβ的活性降低或AKT信号通路的障碍有关。例如，IRβ/IGF1Rβ的表达减少或功能受损，或者AKT的磷酸化和活化受阻，都可能导致细胞对胰岛素的反应减弱，从而影响胰岛素敏感性。

在上述研究中，M14KO小鼠的肝脏中pAKTs473的增加表明，METTL14的缺失可能通过增强AKT的激活来提高胰岛素敏感性，而这种效应与IRβ/IGF1Rβ的磷酸化状态无关，表明可能存在其他调节机制。

参考文献

[1] J Biol Chem. 2021 Jan-Jun:296:100534.

此外，与对照组相比，LFD饮食中，M14^KO小鼠的eWAT（图2D和2E）和iWAT（图2F和2G）中的 pAKT_s473均升高。对照组中响应HFD而下降的pIRβ/IGF1Rβ和pAKT_s473，在M14^KO小鼠的eWAT（图2D和2E）或iWAT（图2 F和2G）中并没有检测到。

与相同饮食的对照组小鼠相比，LFD饮食的M14^KO小鼠肌肉中的pIRβ/IGF1Rβ水平降低，但pAKT_s473激活水平升高（图2H和2I）。与对照组小鼠相比，M14^KO小鼠在摄入HFD后，其肌肉中pIRβ/IGF1Rβ和pAKT_s473的水平更高（图2H和2I）。

值得注意的是，LFD饮食的对照组和M14^KO小鼠的iBAT中pIRβ/IGF1Rβ和pAKTs473水平没有明显差异（图S2A 和S2B）。而HFD饮食中，与对照组iBAT相比，M14^KO-iBAT中pIRβ/IGF1Rβ增加，但对照组和M14^KO-iBAT的pAKT_s473水平没有差异（图S2A和S2B）。这些研究结果表明，iBAT中缺失Mettl14会导致胰岛素刺激反应增加，主要是在外周代谢组织中，这突显了M14^KO小鼠模型中器官间的交流。

接下来，研究人员推测M14^KO-BAT释放的分泌因子可以增强远距离代谢器官的胰岛素敏感性，从而增强全身胰岛素敏感性。为了进一步验证这一点，他们利用单向导RNA（single-guide RNA）生成了三种稳定的M14^KO人棕色前脂肪细胞（sgM14#1-、sgM14#2-和sgM14#3-hBAT）；同时还生成了单向导非靶向对照（sgNTC）RNA转染的hBAT细胞作为对照（图2J）。在已分化的hBAT细胞中敲除METTL14可通过Western印迹分析得到证实（图S2C）。并且通过油红O染色确定，在hBAT细胞中敲除METTL14提高了分化能力（图S2D）。

接下来，研究人员探讨了METTL14在调节hBAT细胞分泌功能方面的相关性。为了模拟体内环境，研究人员进行了共培养实验，用已经分化的sgNTC-或 sgM14-hBAT细胞的无血清条件培养基处理分化的人白色脂肪细胞（hWATs）、原代人肝细胞（hHepatocytes）或分化的原代人肌管（hMyotubes），然后分析受体细胞的胰岛素刺激信号传导（图2J）。与体内数据一致，与sgNTC-hBAT的条件培养基相比，sgM14-hBAT的条件培养基提高了分化的hWAT细胞中pAKT_s473的水平（图2K和2L）。同样，在胰岛素的作用下，与使用sgNTC-hBAT条件培养基处理的细胞相比，sgM14-hBAT条件培养基提高了hHepatocytes（图2M和2N）或 hMyotubes（图2O和2P）中pAKT_s473的水平。总之，体内和体外数据都有力地支持了他们的假设，即BAT中METTL14的敲除或敲减会促进棕色脂肪细胞"因子"的系统性释放，从而促进细胞内胰岛素对远处代谢组织的敏感性。

图 2| 消减BAT中的Mettl14可通过分泌因子增强小鼠外周代谢组织和人类代谢细胞对胰岛素的敏感性

图 S2| 敲除METTL14促进人棕色脂肪细胞脂肪生成

3 确定PGE2和PGF2a为M14KO-BAT分泌的主要胰岛素增敏剂

接下来，研究人员试图确定M14^KO小鼠棕色脂肪细胞分泌的细胞因子。变性的hBAT条件培养基能够诱导pAKT_s473水平的提高，这与hWAT细胞中的非变性条件培养基相似（图S3A），因此他们得出结论，M14^KO-棕色脂肪细胞释放的一种或多种因子可能是脂质因子。

为了特异性鉴定M14^KO棕色脂肪细胞分泌的脂质，研究人员对五组样本应用了全面的非靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）信号脂质组学。首先，研究人员收集了空腹过夜小鼠的血浆，以评估循环的脂质（图3A，左）。 此外，他们对iBAT外植体进行了体外培养，并收集了条件克雷布斯溶液（Krebs solution，CKS）以及在37°C培养2小时后的iBAT组织（小编注：CKS是一种用于生物学实验的平衡盐溶液，它在维持细胞或组织在体外实验中的正常生理状态方面起着重要作用。CKS通常包含多种离子和缓冲物质，如NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2、NaHCO3和葡萄糖等，这些成分模拟了体内环境，有助于保持细胞的渗透压、pH值稳定，并提供基本的营养需求），以检测BAT分泌的脂质（图3A，左）。此外，考虑到iBAT是一种异质性组织，研究人员采用了稳定的M14^KO-hBAT细胞，以确保分泌的因子专门来自棕色脂肪细胞。 因此，他们分化了hBAT细胞，并收集了条件培养基和细胞颗粒（图3A，右图）。

脂质分析数据的多变量统计模型用于确定五种M14^KO样品类型中富集的常见脂质（图S3B-S3F）。通过将对照组和M14^KO样品中的单个信号脂质进行比较分析（图3B、S3G和S3H），确定了在iBAT、iBAT-CKS和hBAT条件培养基中出现重叠的66种脂质（图3 C）。此外，当将iBAT、CKS和血浆样本交叉时，75种脂质在三组样本中普遍表达（图S3I）。 他们注意到，73种脂质在条件hBAT培养基和hBAT细胞之间重叠（图S3J），而82种脂质在条件hBAT培养基、CKS和血浆之间重叠（图S3K）。重要的是，属于类前列腺素家族的四种脂质，PGE、PGD2、PGF2a和13,14-二氢-15-酮-PGE2（13,14-dh-15-keto-PGE2），在大多数样本（M14^KO-iBAT、M14^KO-iBAT-CKS和sgM14-hBAT条件培养基）中都持续显著增加（p < 0.05）（图3C）。接下来，研究人员利用酶联免疫吸附试验（ELISA），在独立的小鼠血浆、iBAT-CKS和hBAT培养基中证实了PGE2和PGF2a的上调（图3D和3E），从而验证了这一观察结果。有趣的是，由于这两种PGs的半衰期较短，它们在血浆中的浓度低于在培养基中的浓度。这些数据表明，PGE2、PGD2、PGF2a和13,14-dh-15-keto-PGE2是M14^KO-BAT可能分泌的脂因子。

为了直接验证候选前列腺素改善外周代谢细胞胰岛素敏感性的原因，研究人员在人肝细胞系（HepG2）（图S4A）、分化的小鼠骨骼肌细胞系（C2C12）（图S4B）、分化的hWAT细胞（图S4C）或分化的hBAT细胞（图S4D）中进行了一系列独立的剂量反应研究。简而言之，用生理浓度（10和100 nM）或超生理浓度（1,000 nM）的PGE2、PGD2、PGF2a或13,14-dh-15-keto-PGE2 处理细胞过夜。然后清洗细胞并用100 nM胰岛素刺激15分钟（图S4A-S4D）。四种候选信号脂质中的PGE2（100 nM）和PGF2a（10 nM）分别在生理性和棕榈酸酯诱导的胰岛素抵抗条件下增加了HepG2（图S4E）、C2C12（图S4F）、hWAT（图S4G）或 hBAT 细胞（图S4H）中，胰岛素刺激的pAKT_s473水平（结果汇总于表S2）。这些结果表明，PGE2和PGF2a有助于改善体外代谢细胞中的胰岛素信号传导。

拓展阅读

前列腺素的合成和调控

前列腺素（Prostaglandins, PGs）是一种二十碳不饱和脂肪酸，存在于人体内的大多数细胞，并充当自分泌和旁分泌脂质介质，它们不会储存，可以组成型表达，也可以在细胞受到机械损伤或特定细胞因子、生长因子和其他刺激激活时，通过环氧化酶（COX）的作用从花生四烯酸（arachidonic acid, AA）中合成。它广泛参与多种生理和病理过程，包括炎症反应、血管舒缩、血小板聚集和疼痛感知等。在调节胰岛素敏感性方面，PGE2和PGF2a是两种特别重要的前列腺素。

前列腺素的合成：前列腺素来自花生四烯酸。花生四烯酸的内源合成途径主要是通过必需脂肪酸亚油酸（Linoleic Acid）的代谢而来。除了通过亚油酸转化这一途径外，花生四烯酸也可以通过其他ω-6多不饱和脂肪酸转化而来。例如，某些特定的脂肪酸，如次亚麻油酸（Gamma-Linolenic Acid, GLA）和共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid, CLA），也可以转化为花生四烯酸，尽管这一过程的效率较低。花生四烯酸通常以酯化形式存在于细胞膜的磷脂中，它是细胞膜的重要组成部分，对维持细胞膜的流动性和功能至关重要。当细胞受到刺激时，例如炎症介质、生长因子或其他信号分子，促使IV型胞质磷脂酶（cPLA2）被激活并易位到ER和核膜，催化花生四烯酸从磷脂中释放出来。释放后的花生四烯酸可以被进一步代谢，通过环氧化酶（COX）和脂氧合酶（LOX）等酶的作用，生成多种生物活性物质，如前列腺素、血栓素和白三烯等，这些物质在调节生理和病理过程中起着关键作用。其他PLA2亚型也可能参与花生四烯酸的释放。花生四烯酸通过PGHS-1（COX-1）或PGHS-2（COX-2）合成中间代谢中间产物PGH2。PGH2可通过不同的前列腺素合成酶形成PGE2（13,14-dh-15-keto-PGE2是PGE2的一种代谢产物）、PGD2（PGD2还可以转化PGJ2）、PGF2a、PGI2（前列环素）和TxA2（血栓素）。这些前列腺素也可以通过不同的合成途径相互转换，PGH2在前列腺素E合酶（PGES）的催化下生成PGE2，也可以在前列腺素D合酶（PGDS）的催化下生成PGH2的另一代谢产物PGD2。PGE2在前列腺素F合酶（PGFS）的催化下转化成PGF2a。PGD2在前列腺素D2 11-酮酶（11-KET-prostaglandin D2 synthase）的催化下转化成9α,11β-PGF2，这也是PGF2a的一个异构体。PGF2a还可以进一步被转化为其他代谢产物，如13,14-dihydro-15-keto-PGE2。

前列腺素的调控：前列腺素的合成和代谢在多种生理和病理过程中扮演着重要角色，并且受到体内平衡机制的严格控制，以确保适当的信号传递和生理反应，包括疼痛感知、炎症反应、血管舒张和收缩、以及体温调节。例如，生理功能涉及到一个复杂的下丘脑调控系统。下丘脑的视前区-下丘脑前部（PO/AH）是体温调节的关键区域，其中包含对温度变化敏感的神经元。这些神经元可以响应体内外的温度变化，并调节产热和散热过程，以维持体温的稳定等。当身体受到感染或其他炎症刺激时，免疫系统会产生致热源，这些物质作用于下丘脑，导致PGE2的合成和释放增加。PGE2通过与其受体结合，提高下丘脑的调定点（调定点的作用相当于恒温箱的调定器，是调节温度的基准。下丘脑前部视前区的温敏神经元与冷敏神经元起着调定点的作用。这两类神经元活动的强度依下丘脑温度的高低而改变，其变化的特点，呈钟形曲线。两条曲线的交叉点，就是已经调试完毕的体温基准点，简称调定点。正常人此点温度定为37℃），使得身体在更高的体温下达到产热和散热的平衡，从而导致体温上升。这就是为什么在发烧时，即使环境温度不是很高，人们仍然会感到寒冷，因为下丘脑的调定点已经上升。此外，前列腺素也参与了生理体温调节。例如，PGE2能够增加皮肤的血流量，促进热量的散发，有助于体温的下降。同时，前列腺素还能通过影响血管的收缩和舒张，调节身体各部位的温度分布。值得注意的是，非甾体抗炎药（NSAIDs），如阿司匹林和布洛芬，通过抑制环氧化酶（COX）的活性，减少前列腺素的生成，从而发挥退热和镇痛的效果。这类药物可以降低下丘脑的调定点，帮助体温恢复到正常水平。但不是所有的组织都表达所有类型的前列腺素，前列腺素的表达模式取决于特定组织的细胞类型和功能需求。例如血小板和巨噬细胞中存在血栓素合成酶，内皮细胞中存在前列环素合成酶，子宫中存在PGF合成酶，大脑和肥大细胞中存在两种PGD合成酶。微粒体PGE合成酶（mPGES）是MAPEG（类二十酸和谷胱甘肽代谢中的膜相关蛋白）家族的成员，负责合成 PGE2。前列腺素合成过程需要多种酶催化，其中COX是前列腺素合成的关键酶，存在两种同工型，COX-1和COX-2。COX-1在大多数组织中表达，参与维持正常生理功能；COX-2在炎症刺激下诱导表达，参与炎症反应。多个转录因子参与前列腺素的合成及调控，例如NF-κB转录因子在炎症反应中被激活，促进COX-2和其他合成酶的表达，在炎症反应的早期主要是以PGE2为主，并且PGE2可激活NF-κB，以促炎的方式发挥作用，而在炎症反应的后期，PGJ2水平最高，通过抑制IKK来抑制NF-κB的活性。将NF-κB限制在细胞质中，并减少NF-κB依赖性炎症基因的表达。由于NF-κB活性降低，这种负反馈调节导致COX-2基因表达减少，发挥抗炎的作用。非甾体抗炎药（NSAIDs）如阿司匹林、布洛芬等也可以通过抑制COX活性减少前列腺素的生成。

参考文献

[1] Funk CD. Science. 2001 Nov 30.

[2] Smith WL, et al. Chem Rev. 2011 Oct 12.

[3] Poligone B, et al. J Biol Chem. 2001 Oct 19.

接下来，研究人员试图找出介导PGE2和PGF2a的胰岛素敏感效应的受体和细胞内信号网络。众所周知，前列腺素是通过G蛋白偶联受体（GPCRs）来发挥其作用的。有四种指定的GPCR亚型（EP1、EP2、EP3和EP4）介导PGE2 的作用。此外，PGF2a的生物作用是通过与前列腺素F受体（FP）结合来介导的。因此，研究人员推测PGE2或PGF2a是通过与这些受体结合来发挥胰岛素增敏效应的。为了直接验证这一假设，他们用EP1（ONO8711）、EP2（PF04418948）、EP3（L826266）、EP4（AH23848）、或 FP（OBE022）受体的拮抗剂预先处理每种细胞类型，进行了独立的阻断实验。随后用PGE2（100 nM）或 PGF2a（10 nM）处理细胞，浓度由之前的实验确定（图S4E-S4H）。最后利用细胞的葡萄糖摄取量来作为检测指标。与上述评估胰岛素信号转导的处理方法类似，在检测2DG摄取前，先用特定受体拮抗剂预处理细胞，然后用PGE2（100 nM）或PGF2a（10 nM）过夜处理，并进行急性胰岛素刺激（100 nM，15分钟）。

在HepG2细胞中，100 nM的PGE2处理会诱导pAKT_s473的活化，而与胰岛素无关（图3F，pAKT_s473暴露时间更长，以及图S5 A）。使用EP1、EP3 或 EP4 拮抗剂（即ONO8711、L826266或AH23848）进行预处理后，即使在有胰岛素存在的情况下，PGE2诱导的pAKT_s473也会减弱（图3F和S5A）。PGE2能协同增加pAKT_s473而不影响 pIRβ/IGF1Rβ；此外，用ONO8711或AH23848抑制EP1或EP4受体能显著消除PGE2对胰岛素的协同作用（图3F和S5A）。另一方面，PGF2a本身并不激活 pAKT_s473；但它可能通过作用于肝细胞中的FP受体而增加了胰岛素刺激的pAKT_s473，因为OBE022可抑制PGF2a诱导的pAKT_s473 的增加（图3G和S5B）。正如预期那样，胰岛素会诱导HepG2细胞摄取更多葡萄糖（图3H）。有趣的是，在100 nM的浓度下，单独使用外源PGE2可使葡萄糖摄取量增加1.6倍，尽管这种摄取量不如胰岛素对HepG2细胞的影响那么强烈（图3H）。

在C2C12细胞中，PGE2和PGF2a都不会增加pAKT_s473的基础水平；但这两种前列腺素都会提高胰岛素刺激的pAKT_s473水平（图3I、S5C和S5D）。 令人震惊的是，单独使用PGE2（100 nM）或PGF2a（10 nM）可分别诱导C2C12 细胞葡萄糖摄取量增加2.6倍或3.2倍，与胰岛素无关，而胰岛素本身可诱导葡萄糖摄取量增加2倍（图3K）。同时阻断EP1和EP2受体可消除PGE2诱导的葡萄糖摄取。同样，使用PF受体拮抗剂可显著降低PGF2a诱导的C2C12细胞葡萄糖摄取的增加（图3K）。

在分化的hWAT细胞中，PGE2而不是PGF2a能增加基础pAKT_s473的水平，两种PGs都能增加胰岛素刺激的pAKT_s473水平（图3L、3M、S5E和S5F）。抑制EP2或EP4受体以及FP受体可分别降低PGE2或PGF2a诱导的效应。相反，阻断EP1或EP2受体会部分降低PGE2-诱导的效应，而FP拮抗剂OBE022 则不会显著改变PGF2a的诱导效应（图3L、3M、S5E和S5F）。此外，在没有胰岛素的情况下，PGE2和PGF2a都不会影响葡萄糖摄取，而PGE2则会增强胰岛素刺激的葡萄糖摄取（图3N）。

在分化的hBAT细胞中，PGE2和PGF2a都能增加胰岛素刺激的pAKT_s473，而不直接影响pAKT_s473（图3O、3P、S5G和S5H）。有趣的是，阻断EP4受体可显著增加PGE2诱导的pAKT_s473（图3O和S5G）。另一方面，FP受体拮抗剂完全消除了PGF2a诱导的胰岛素刺激pAKT_s473的升高（图3P和S5H）。hBAT细胞的葡萄糖摄取受到胰岛素的显著刺激，但对两种PGs的刺激却没有改变（图3Q），这表明棕色脂肪细胞不太可能是PGs的主要靶标。 这些数据共同表明，PGE2和PGF2a作为分泌因子，主要在肌肉细胞、肝细胞和白色脂肪细胞中外源性控制葡萄糖摄取。

最后，研究人员研究了PGE2或PGF2a激活pAKT_s473上升的分子机制。有几种机制可以在受体水平和级联的下游点减弱、微调或终止胰岛素信号。 例如，已知PH结构域和富亮氨酸重复蛋白磷酸酶（PHLPPs）、含SH2结构域的肌醇磷酸酶1/2（SHIP-1/SHIP-2）以及磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）等磷酸酶在胰岛素信号级联中对AKT起负向调节作用。因此，研究人员推测PGE2和PGF2a会抑制PI3K通路中特定负调控因子的表达和pAKT的活性。以HepG2细胞为模型，研究人员观察到PGE2降低了PHLPP-1蛋白丰度，它可使AKT去磷酸化，SHIP-1/2以及PTEN，它们都对PI3K通路有负向调节作用。阻断EP1或EP4受体可部分缓解这些磷酸酶的表达（图3R和S5I）。 PGF2a降低了SHIP-1和SHIP-2的蛋白水平，阻断FP受体可逆转这种效应（图3S和S5J）。

综上所述，METTL14缺失的小鼠或人类棕色脂肪细胞会释放四种信号脂质，即PGE2、PGD2、PGF2a和13,14-dh-15-keto-PGE2。其中，PGE2和PGF2a可能是介导外周胰岛素敏感改善的主要内分泌因子。例如，PGE2可在没有胰岛素的情况下刺激pAKT_s473，并通过不同的细胞特异性EP受体使胰岛素刺激的 pAKT_s473敏感。在HepG2细胞中，这些作用分别通过降低PHLPP-1、SHIP-1/2或PTEN的表达来实现。PGF2a通过与FP受体结合，负向调节SHIP-1和SHIP-2，从而增加胰岛素刺激的pAKT_s473（图3T）。

图 3 | 消减Mettl14主要通过前列腺素E2和前列腺素F2a改善胰岛素敏感性

图 S3 | 信号脂质负责M14缺陷棕色脂肪细胞诱导的器官间通讯

图 S4 | PGE2、PGD2、PGF2a和13,14-二氢-15-keto-PGE2是M14KO -iBAT/hBAT分泌型胰岛素增敏剂

图 S5 | 消减Mettl14改善胰岛素敏感性主要通过前列腺素E2和前列腺素F2a

4 外源性PGE2和PGF2a可改善DIO小鼠的胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性

接下来，研究人员试图研究PGE2或PGF2a是否是造成M14^KO小鼠代谢表型的原因。为此，他们使用了抗PGE2单克隆重组抗体 (2B5) 来阻断PGE2的作用。研究人员使用HepG2细胞对2B5的中和功效进行了体外验证，结果表明2B5能以剂量依赖的方式中和PGE2诱导的pAKT_s473的增加（图S6A-S6C）。此外，这项实验还让他们考虑了2B5在体内中和研究中的最佳浓度。

接下来，研究人员给对照组小鼠注射了同型对照免疫球蛋白G（IgG）抗体，给M14^KO小鼠注射对照抗体或2B5（图4A），并通过测定实验小鼠的IgG1水平验证了抗体注射的有效性（图S6D）。正如预期的那样，与注射IgG的对照组小鼠相比，注射IgG的M14^KO小鼠在胰岛素敏感性（图4B）、葡萄糖耐量（图4C）和肝脏胰岛素敏感性（图4D和4E）方面都有系统性改善。值得注意的是，这些表型几乎完全被2B5所减弱（图4B-4E），这有力地证明了PGE2是M14^KO小鼠表型的基础。 然而，由于无法获得针对PGF2a的商用中和抗体，在本实验中阻断PGF2a是不可行的。

在确定PGs（尤其是PGE2）是导致M14^KO小鼠主要表型的胰岛素增敏因子之后，研究人员开始直接评估外源性PGE2和PGF2a对小鼠胰岛素的增敏作用。但值得注意的是，PGE2（12.5毫克/千克）和PGF2a（12.5毫克/千克）在饮食诱导肥胖（DIO）小鼠体内的血浆半衰期都很短，分别为3.3分钟和1.4分钟（图S6E和S6F）。注射2小时后，只有490 pg/mL PGE2和770 pg/mL PGF2a仍留在血液循环中，这表明清除速度很快，而且必须达到超生理循环浓度才能在体内产生可观察到的效应。

因此，研究人员对五组13周大的雄性小鼠进行了体内给药：LFD喂养组注射对照或25 mg/kg PG（12.5 mg/kg PGE2 + 12.5 mg/kgPGF2a），DIO小鼠注射对照、25 mg/kg PG（12.5 mg/kg PGE2 + 12.5 mg/kg PGF2a）或50 mg/kg PG（25 mg/kg PGE2 + 25 mg/kg PGF2a）（图4 F）。监测活动量、基础核心体温和食物摄入量是长期服用PG可能引起副作用的指标。 在任何剂量下，服用PG都不会影响LFD或HFD饮食的小鼠的活动（图S6G和S6H）或基础核心体温（图S6I），这表明服用PG对小鼠是安全的。此外，除了接受25mg/kg PGE2+PGF2a的HFD饮食的小鼠（图4 G）外，两种剂量的PGE2+PGF2a联合注射对食物摄入量（图S6J）和体重都没有显著影响。此外，注射低剂量PGE2+PGF2a的DIO饮食小鼠体型较小，iBAT、liver、iWAT和eWAT的大小和重量均有所下降（图4H和4I）；然而，在LFD饮食的组别之间没有观察到这些差异（图4G、4I和S6 K）。脂肪组织和肝脏的组织学分析表明，HFD饮食的小鼠在注射PGE2+PGF2a后形态更健康（图4J-4L）。 具体来说，PGs可减少HFD饮食引起的肝脏脂肪变性（图4J）、免疫细胞浸润以及eWAT（图4K）和iWAT（图4L）中的脂肪细胞肥大。与对M14^KO小鼠iWAT的观察结果一致（图S1J、S1S和S1T），在注射PG的小鼠iWAT中观察到多房脂滴形态（图4 L）、UCP1阳性（图4 M）和棕色化标记物的存在（图4N和4O）。同样，用PGE2、13,14-dh-15-keto-PGE2、PGF2a或PGD2处理人类前脂肪细胞可诱导棕色化标记物的表达（图S6L）。

为了排除这种胰岛素敏感性上升是由于体重变化的影响，研究人员在注射PGE2+PGF2a后的第11天进行了IPITT，此时各组的体重相似（图S6M）。PGE2+PGF2a对LFD饮食的小鼠没有影响，LFD饮食的小鼠表现出正常的胰岛素敏感性，而两种剂量的PGE2+PGF2a都能保护DIO小鼠免受HFD诱导的胰岛素抵抗（图4P和4Q）。实验结束时，注射PGE2+PGF2a（50 mg/kg）可降低 HFD 饮食小鼠的空腹血糖（图4R），两种剂量的PGs均可改善HFD诱导的葡萄糖耐受（图4S）。此外，用PGs（25 mg/kg）治疗DIO小鼠，然后在腔静脉注射胰岛素后评估组织水平的胰岛素敏感性，结果显示肝脏（图4T）和iWAT（图4U）中的pAKT_s473增加。值得注意的是，在肝脏中观察到PHLPP1、SHIP1和PTEN蛋白丰度降低（图4V），在iWAT中观察到PHLPP1和SHIP1蛋白丰度降低（图4W），这表明通过抑制pAKT信号转导的负调控因子可直接使胰岛素敏感。

为了进一步了解PGs诱导的胰岛素敏感性的全面改善是否依赖于典型的UCP1介导的BAT产热，研究人员在急性冷暴露后进行了间接热量测定。尽管两种剂量的PG都能提高DIO小鼠的耐寒能力（图S6N），这可能是因为PG诱导的iWAT棕色化（图4M-4O），但在急性寒冷暴露6小时后，以HFD饮食的PG组和Veh处理组在能量消耗（图S6O）、氧气消耗（图S6P）或二氧化碳产生（图S6Q）方面均未观察到差异。这些结果支持了一种观点，即M14^KO-BAT分泌的前列腺素可改善全身代谢，而与BAT的产热无关。（小编注：全身代谢功能改善会促进能量物质利用率，即利用葡萄糖产生ATP，生成的ATP通过UCP1依赖和UCP1非依赖（如肌酸无效循环和脂解作用等）的方式释放热量，进而维持体温）。

总之，用PGE2和PGF2a对DIO小鼠进行长期治疗，可以模拟M14^KO小鼠模型，并支持M14^KO-BAT通过PGs的内分泌效应改善代谢健康的概念。

图 4 |PGE2和PGF2a是M14KO-iBAT分泌的胰岛素增敏剂

图 S6 |PGE2和PGF2a的给药可改善胰岛素DIO小鼠的敏感性与体重和能量消耗无关

5 血浆中PGE2和PGF2a的水平与人体肥胖和胰岛素抵抗呈负相关

由于M14^KO小鼠和经PGE2+PGF2a处理的小鼠对HFD诱导的胰岛素抵抗具有抵抗力，研究人员试图研究这些发现与人类的相关性。因此，他们在三组独立的人类受试者中测试了PGE2或PGF2a循环水平与代谢参数之间的关系，这些受试者的体重指数和胰岛素敏感性分布广泛。

在第一组人群中，个体被分为瘦、超重和肥胖组（样本信息见表S3，n = 55）。研究人员观察到，与超重（25≤ BMI < 30 kg/m²）或肥胖（BMI ≥ 30 kg/m²）组相比，瘦人（BMI < 25 kg/m²）的 PGE2 水平更高（图5A），与被鉴定为BAT阴性（BAT-）的个体相比，BAT阳性（BAT+）的人PGE2水平更高（图5B）。值得注意的是，Spearman相关分析表明，血浆PGE2水平与体重指数（图5C）和HOMA-IR（图5D）呈显著负相关。此外，PGE2与空腹血浆胰岛素（FPI）和瘦素水平呈负相关（图S7A）。 同样，瘦人的PGF2a水平高于超重或肥胖者（图5E），BAT+ 组高于BAT- 组（图5 F）。 PGF2a还与BMI（图5G）、HOMA-IR（图5H）、FPI和瘦素（图S7 B）呈负相关。鉴于已知肥胖者体内BAT的质量和活性会下降，这些数据支持BAT是人体PGE2和PGF2a的主要来源组织。 PGE2或PGF2a水平与HOMA-IR之间的反相关性表明，血浆PG水平低与胰岛素抵抗增加有关。

为了进一步分析PGs独立于BMI的胰岛素增敏作用，研究人员接下来在第二组人群（也称为Kuopio肥胖症手术 [KOBS] 研究，n = 175）中研究了循环PGE2或PGF2a水平与代谢参数的关系，其中只包括肥胖受试者（BMI ≥ 30）。PGE2和PGF2a的绝对水平是通过ELISAs测定的。血浆中PGE2的水平与BMI没有明显的相关性（图5I），这使研究人员能够从体重调节的角度来分析PGs对这组人群的潜在影响。 与第一组结果一致，他们在第二组人群中也观察到PGE2与HOMA-IR呈负相关（图5J）。 此外，PGE2与空腹血糖、胰岛素和甘油三酯呈负相关（图S7 C）。PGF2a与上述参数显示出类似的相关模式（图5 K、5L和S7 D）。

最后，研究人员着手确定PGE2和PGF2a循环水平与外周胰岛素敏感性之间的关系。在第三组人群（也称为Stop Diabetes [StopDia] 研究，n = 73）中，研究人员发现PGE2与松田指数之间（Matsuda index）存在显著的正相关性（图5M），松田指数代表肝脏和外周组织对胰岛素的敏感性。此外，还发现血浆中的PGE2水平分别与体重指数（图5N）、HOMA-IR（图5O）和FPI（图S7E）呈负相关。 同样，PGF2a水平与松田指数呈正相关（图5P），而与上述其他参数呈负相关（图5Q、5R和S7F）。 总之，这些研究结果表明，PGE2和PGF2a与人体的系统代谢和胰岛素敏感性有关。

拓展阅读

KOBS研究、StopDia研究和松田指数

Kuopio肥胖手术（KOBS）研究是一项前瞻性观察性研究，通过为期1年的随访来调查Roux-en-Y胃搭桥术（RYGB）的代谢后果（n=172）。StopDia研究是一项基于科学证据的预防 2 型糖尿病的研究，旨在通过健康生活方式预防 2 型糖尿病及其并发症。该研究的目标是提高对高风险个体的覆盖率，评估数字生活方式干预措施以及数字和面对面小组生活方式干预措施与常规护理相比的有效性和成本效益，并在社会层面评估 StopDia 模型的采用和实施情况。

松田指数（Matsuda Index）是一个用于评估胰岛素敏感性的指标，它通过口服葡萄糖耐量试验（OGTT）得到的血糖和胰岛素数据来计算，其中松田指数越高，表示体内对葡萄糖的利用效率越高，胰岛功能越好。一般来说，松田指数大于2可以被认为是正常的胰岛功能。松田指数的计算公式如下：

图5 |血浆中PGE2和PGF2a的水平与人体肥胖和胰岛素抵抗呈负相关

 图S7 |循环PGE2和PGF2a与空腹血糖、胰岛素、瘦素和甘油三酯水平、人类肝脂肪病变严重程度呈负相关

6 METTL14缺失会上调BAT中与前列腺素合成有关的途径

为了回答METTL14调节棕色脂肪细胞中前列腺素合成机制的问题，研究人员首先确定了METTL14缺失后前列腺素合成的转录基础。研究人员对对照组或M14^KO小鼠的iBAT进行了RNA测序（RNA-seq）和m⁶A-RNA免疫沉淀测序（m6A-RIP-seq）（图6A）。RNA-seq和m⁶A-seq数据的主成分分析（PCA）显示，对照组和M14^KO-iBAT之间存在明显的差异（图6B和 6C）。在M14^KO-iBAT中，RNA-seq发现了697个差异表达基因（DEGs）（p < 0.01），其中包括324个上调基因和373个下调基因（图6D）。对明显上调基因的通路和过程富集分析表明，脂质代谢和磷脂代谢过程是因缺失Mettl14而上调最多的通路（图6E和S8A）。与对照组相比，M14^KO-iBAT中包括对胰岛素的反应、脂肪生成和葡萄糖稳态在内的通路都上调。另一方面，下调基因的TOP GO通路与血管生成、细胞周期和有丝分裂有关（图S8B）。

正如之前所报道的，对照组和M14^KO-iBAT中的m⁶A峰都富集在起始和终止密码子处，并以典型的GGACU基序为特征（图S8C）。为了进一步检验与磷脂合成途径相关的转录组变化是否受METTL14介导的m⁶A修饰的调控，研究人员将差异上调基因（p < 0.05）和 m⁶A-低甲基化基因（p < 0.05）进行了交叉，得到了714个转录本（图6F）。与RNA-seq序列数据一致，这组714个基因在磷脂代谢过程和脂质代谢途径中的富集程度最高（图6G和S8D）。

当环氧化酶（Cox1和Cox2，又分别称为Ptgs1和Ptgs2）将花生四烯酸转化为中间体，然后再转化为PGE2和PGF2a等活性前列腺素时，前列腺素就合成了。前列腺素E合成酶（PTGES、PTGES2 和 PTGES3）等前列腺素合成酶直接促成了花生四烯酸等多种前列腺素的生物合成，但同时也受到一些转录调节因子或转录辅助激活因子的间接调控。为了进一步确定METTL14参与PG生物合成途径的靶转录本，研究人员分析了对照组和M14^KO-iBAT中编码前列腺素生物合成酶的基因的m⁶A水平。参与PG生物合成途径的几个基因在M14^KO-iBAT中低甲基化（图6 H）。更具体地说，负责产生PGF2a和13,14-dh-15-keto-PGE2的前列腺素E合成酶2（Ptges2）（图6 I）、羰基还原酶1（Cbr1）（图6 J）和醛酮还原酶家族1成员B10（Akr1b10）（图K）的m⁶A水平较低。该通路中的其他低甲基化基因包括促进PGE2合成/释放的过氧化物酶体增殖激活受体γ（Pparγ）（图6 L）；过氧化物酶体增殖激活受体γ辅助激活剂1 α（Ppargc1α）（图6M），它能促进前列腺素内过氧化物合成酶1（Ptgs1）的表达；以及过氧化物酶体增殖激活受体γ辅助激活剂1β（Ppargc1β）（图6N），它是已知的几种前列腺素合成酶的调控因子。 M14^KO-iBAT中其他低甲基化的基因包括A型内皮素受体（Ednrα）（图6O）；磷脂酶A2，XIIA型（Pla2g12α）（图6P），它诱导花生四烯酸从细胞膜中释放；以及促进花生四烯酸转化为前列腺素H2（PGH2）（图6H）的11β-羟类固醇脱氢酶1型（Hsd11b1）（图6Q）。因此，这三个转录本可能通过提供额外的底物（即花生四烯酸和PGH2）来促进前列腺素的产生。同样，在sgM14-hBAT细胞中也观察到了丰富的通路和基因（图S8 E 和S8F）。总之，这些结果表明，METTL14的缺失直接或间接地调节了小鼠和人类棕色脂肪细胞中前列腺素的合成。

图6 |METTL14 选择性地甲基化编码前列腺素生物合成酶及其调节因子的转录本

图S8 |iBAT或hBAT 中M14缺陷上调相关基因脂质代谢途径

7 METTL14介导的m6A修饰以YTHDF2/3依赖性方式延缓前列腺素生物合成酶及其调节因子的mRNA衰减

研究人员接着验证了测序结果，并探索了METTL14介导的m⁶A修饰PG合成途径中目标转录本的分子机制。RT-qPCR分析初步证实了M14^KO-iBAT中Pparγ、Ppargc1α、Ppargc1β、Ptges2、Crb1和Akr1b10的上调（图7A）。有趣的是，虽然在15-Pgdh和Ptgds的转录本中没有检测到m⁶A水平的变化，但它们的基因表达在M14^KO-iBAT中上调（图S9 A），这表明它们不是METTL14介导的m⁶A的直接靶标。此外，在M14^KO小鼠的iBAT中，PPARγ、PGC1α、PGC1β、PTGES2、CBR1和AKR1B10的蛋白水平都有所增加（图7B和S9B）。同样，sgM14-hBAT 细胞中PG生物合成酶及其正调控因子的基因表达（图7C和S9C）和蛋白水平（图7D和S9 D）也有所增加。

随后，研究人员利用hBAT细胞模型开展了机制研究。首先，他们研究了hBAT细胞在使用转录抑制剂放线菌素D（Act D）处理后，METTL14缺失对候选靶mRNA稳定性的影响。METTL14的缺乏并没有明显影响ACTB mRNA的稳定性；但是，它能有效抑制PTGES2、CBR1和AKR1B10 mRNA在分化的hBAT 细胞中的降解（图7 E）。 这些数据表明，METTL14介导的m⁶A甲基化通过影响靶mRNA的稳定性来调节其水平。

为了证实这一假设，研究人员用小干扰 RNA（siRNA）介导敲除了对mRNA 稳定性非常重要的m⁶A阅读蛋白YTHDF2和YTHDF3（图7F），并检测了野生型hBAT细胞经ActD处理后PTGES2、CBR1和AKR1B10 mRNA的表达和稳定性。敲除YTHDF2或YTHDF3后再用ActD处理，不会影响ACTB的稳定性，但会增加PTGES2、CBR1和AKR1B10 mRNA的稳定性（图7 G）。在翻译抑制剂环己亚胺（CHX）的追逐实验中，METTL14的缺失在12小时内没有改变 GAPDH蛋白的表达，这可能是由于其半衰期较长（图7H和S9E）。此外，METTL14的缺失并没有明显影响hBAT细胞中PPARγ、PGC1α、PGC1β、PTGES2、CBR1和AKR1B10 mRNA的翻译效率（图7H和S9E），这表明METTL14主要调控转录过程而不是翻译效率。

在hBAT中过表达METTL14（M14OE）（图S9 G和S9H）不会影响脂肪的生成（图S9 F），但会降低PPARγ、PGC1α、PGC1β、PTGES2、CBR1和AKR1B10 的基因表达（图S9 H）。M14OE促进了CTD处理后hBAT细胞中PTGES2、CBR1和AKR1B10 mRNA的降解（图S9I），并减少了PGE2和PGF2a的分泌（图S9J）。此外，与对照组相比，M14OE-hBAT条件培养基降低了胰岛素刺激前预处理的HepG2细胞（图S9K）和hWAT细胞（图S9L）中pIRβ/IGF1Rβ和 pAKT_s473的水平。

最后，研究人员确定了Ptges2和Cbr1是M14介导的m⁶A的关键靶转录本，它们分别编码PGE2和PGF2a生物合成酶（图7I），他们的目的是阐明Ptges2和Cbr1对增强胰岛素敏感性的重要贡献。将AAV8-scramble、AAV8-shPtges2或 AAV8-shCbr1注入iBAT以特异性基因敲除Ptges2或Cbr1（图7J）。iBAT中PTGES2和CBR1蛋白丰度的降低证实了基因敲除的效率和组织特异性（图7K、7 L、S9 M和S9N）。敲除每个基因都会显著降低M14^KO小鼠血浆中PGE2和 PGF2a的水平（图7M），从而证实PTGES2和CBR1分别是PGE2和PGF2a生物合成的关键酶。值得注意的是，Ptges2的缺失几乎消除了M14^KO小鼠对全身胰岛素敏感性和葡萄糖耐量的改善（图7N和7O），这可能是由于PGE2是 PGF2a和13,14-dh-15-keto-PGE2的前体。Cbr1基因敲除可部分逆转这种表型（图7N和7O）。同样，在组织水平也观察到了胰岛素敏感性，尤其是在肝脏（图7P和7Q）。这些结果证实了Ptges2和Cbr1是棕色脂肪细胞中M14介导的m⁶A 的关键靶点，并强调了BAT分泌的PGE2和PGF2a是M14^KO小鼠胰岛素敏感性提高的主要驱动因素。

总之，研究人员发现了一种独特的机制，即BAT可以调节外周代谢组织对全身胰岛素的敏感性。他们的研究结果表明，METTL14的缺失会选择性地诱导编码前列腺素生物合成酶的转录本发生低甲基化，从而抑制其mRNA的降解。这导致棕色脂肪细胞内前列腺素分泌的上调。

图7 |METTL14介导的m6A修饰以YTHDF2/3依赖性方式促进PGs生物合成酶及其调控因子mRNA的衰变

图S9 |METTL14介导的m6A修饰以YTHDF2/3依赖的方式促进PG生物合成酶及其调节因子mRNAs的衰变

总结

棕色脂肪组织（BAT）通过释放信号脂质调节全身代谢。 N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是最普遍和最丰富的转录后mRNA修饰，据报道可调节BAT的脂肪生成和能量消耗。在这里，研究人员证明了m⁶A甲基转移酶样14 (METTL14) 的缺失会改变BAT分泌组，从而改善全身胰岛素敏感性，而与UCP1无关。 通过脂质组学，研究人员发现前列腺素E2 (PGE2) 和前列腺素F2a (PGF2a) 是BAT分泌的胰岛素增敏剂。PGE2和PGF2a与人类的胰岛素敏感性成反比，并通过抑制特定的 AKT磷酸酶保护小鼠免受高脂饮食引起的胰岛素抵抗。从机制上讲，METTL14介导的m⁶A可通过YTHDF2/3促进棕色脂肪细胞中编码PGE2和PGF2a生物合成酶的基因PTGES2和CBR1的降解。同样，在M14^KO小鼠体内，BAT特异性敲除Ptges2或Cbr1可逆转胰岛素致敏效应。总之，这些发现揭示了一种新的生物学机制，即依赖于m⁶A的BAT分泌组调控系统胰岛素敏感性。

原文链接：https://www.cell.com/cell-metabolism/fulltext/S1550-4131(24)00333-4