撰文 | 李欣茜 张婷 仲银召 郑宇含 张彦康 李雨

编辑 | 孟美瑶

校对 | 张婷

研究背景

由于高血压、肥胖和糖尿病等患病风险增加，以及人口老龄化加剧，急性缺血性脑卒中在世界范围内的患病率逐年增加，目前已成为导致人类死亡的主要疾病之一。缺血性脑卒中病发时，脑血流（CBF）的紊乱限制了氧气和能量底物的传递，导致线粒体氧化磷酸化功能障碍和细胞生物能应激，最终造成严重且永久性的神经损伤，威胁人类健康。

低密度脂蛋白受体（LDLR）相关蛋白-1（LRP1）是一种属于LDLR家族的多功能跨膜受体，它在生物体中广泛表达，主要富集于大脑、肝脏和血管。据报道，LRP1与神经元稳态、心肌梗塞、血脑屏障完整性、胰岛素反应、血管生成、能量代谢、肺功能以及阿尔茨海默病（AD）相关发病机制相关。此外，LRP1也与缺血性脑卒中相关，例如，在非裔美国人的缺血性卒中遗传学研究（ISGS）中，研究人员发现LRP1的突变体rs11172113与卒中风险增加相关。然而，尽管目前的临床前研究取得了一定的成果，但LRP1在神经元稳态中的作用尚有疑义，这阻碍了LRP1靶向治疗的发展。因此，LRP1如何维持脑内稳态，以及其在缺血性脑卒中里发挥的作用仍有待深入研究。

拓展阅读

低密度脂蛋白受体（LDLR）相关蛋白-1（LRP1）

LRP1属于低密度脂蛋白受体家族成员之一，是一种多功能跨膜受体，既可介导包括LDL在内的多种配体的内吞，又可与多种不同的蛋白相互作用，发挥不同功能，参与细胞信号转导启动下游级联反应。LRP1由LRP1a和LRP1b两个亚基组成，其中LRP1a包含配体结合域，是LRP1的细胞外部分；而LRP1b则包含跨膜域和胞质侧尾端，负责LRP1在细胞膜上的定位和内吞作用，因此LRP1通过LRP1a结合多种配体，并通过LRP1b介导这些配体的内吞和信号转导事件。如在人血管平滑肌细胞中，LRP1介导的LDL摄取诱导细胞内胆固醇酯（CE）积累，继而引发动脉粥样硬化。而除了介导LDL摄取外，LRP1也会介导其他配体的内吞。例如，在脑中，LRP1可以通过介导Tau和APP内吞，促进其清除，维持神经元稳态，参与AD进程调控。此外，LRP1也可以通过内吞信号分子参与信号转导调控，如LRP1介导Bmper/Bmp4信号复合物内吞，并且作为Bmp4的辅助受体同时与Bmp4和Bmp4受体ALK6形成复合体，促进Bmp4下游信号转导，激活Smad1/5/8磷酸化，促进内皮细胞迁移和血管生成。LRP1也可与细胞膜上的其他膜蛋白结合参与信号通路调控。例如，LRP1可与细胞膜上的Notch配体DLL3结合，促进其与泛素化连接酶的相互作用，维持DLL3在细胞膜上的正确定位和稳定性以及Notch信号通路的正常运转，促进白血病细胞的侵袭和迁移。而LRP1的定位也不仅只局限在细胞膜上，LRP1b可被γ-secretase切割后从质膜上释放，并转移到细胞核中，与多种转录因子相互作用发挥转录促进或抑制功能。有研究发现LRP1b可以直接在细胞核中与PPARγ的配体结合域相互作用，增强其转录活性，促进PPARγ靶基因Pdk4和C/ebpα表达，增强内皮细胞糖脂代谢，维持小鼠代谢稳态。除与PPARγ结合外，在巨噬细胞中也发现，LRP1b可在细胞核中与IRF-3结合，促进其核输出和蛋白酶体依赖的降解，从而抑制IRF-3介导的靶基因表达，减轻炎症反应。但是尽管LRP1可辅助转录因子参与转录过程调控，LRP1本身是否直接具有转录调控活性似乎尚无文献报道。此外，LRP1还可在细胞质或细胞核中与PARP-1相互作用并抑制其活性，从而抑制Rb和CDK2磷酸化，从而抑制内皮细胞增殖。总之，LRP1是一种多功能的蛋白，可通过介导胞外配体的内吞作用，或与不同类型的蛋白进行相互作用并影响其介导的信号转导过程，最终参与细胞代谢、分化、免疫等多种生命活动中的调控。

参考文献：

[1] Llorente-Cortés V, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006 Jan;26(1):117-23.

[2] Bian W, et al. Low-density-lipoprotein-receptor-related protein 1 mediates Notch pathway activation. Dev Cell. 2021;56(20):2902-2919.e8.

[3] Rauch JN, et al. Nature. 2020 Apr;580(7803):381-385. 

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[5] Mao H, et al. Nat Commun. 2017 Apr 10;8:14960.

[6] Zurhove K, et al. Gamma-secretase limits the inflammatory response through the processing of LRP1. Sci Signal. 2008 Nov 25;1(47):ra15.

[7] Pi X, et al. LRP1-dependent endocytic mechanism governs the signaling output of the bmp system in endothelial cells and in angiogenesis. Circ Res. 2012;111(5):564-574.

线粒体在ATP产生、代谢调节、Ca2+缓冲（小编注：线粒体Ca2+通过调节线粒体电子转运、ATP合成和酶活性（如丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、酮戊二酸脱氢酶复合体等），在细胞活动和能量产生中发挥重要作用，线粒体也可以通过调节内部的Ca²⁺浓度来影响细胞的能量代谢。线粒体Ca2+单向转运体（MCU）是一个高度选择性的Ca²⁺通道，负责将Ca2+从细胞质转运到线粒体基质中。细胞内Ca2+浓度增加时，Ca2+通过MCU进入线粒体。线粒体通过钠/钙交换器（NCLX）将多余的Ca2+排出线粒体，防止线粒体Ca2+超载。）和细胞应激反应等过程中发挥重要功能，对维持细胞健康至关重要。多种神经退行性疾病（如帕金森病、AD、认知障碍等）都与神经元线粒体功能障碍有关。据报道，星形胶质细胞能释放多种对神经元发育、信号传导、生长和突触发生至关重要的因子，例如：星形胶质细胞可以向受损神经元提供胞外健康线粒体，从而促进神经元健康（小编注：16年Nature同样也是在缺血性脑卒中模型下做的。本文的创新点主要在机制部分，证明LRP1通过抑制糖酵解和乳酸生成，抑制ARF1乳酸化，从而促进线粒体转移）。那么，在缺血性脑卒中发病过程中，星形胶质细胞是否以及如何向受损神经元提供线粒体从而发挥有益作用呢？

在本篇研究中，研究人员观察到星形胶质细胞中的LRP1能调节健康线粒体从星形胶质细胞向神经元转移，并在脑缺血再灌注（I/R）损伤中保护神经元；而抑制星形胶质细胞LRP1能显著抑制线粒体向受损神经元的转移，并加重缺血性卒中。研究人员进一步发现，星形胶质细胞LRP1是通过抑制葡萄糖摄取、糖酵解和乳酸生成，抑制ADP-核糖基化因子1（ARF1，是一种促进囊泡运输的细胞质蛋白）的乳酸化，最终促进功能性线粒体转移并减轻I/R损伤。

拓展阅读

ADP-核糖基化因子1调控细胞内囊泡运输

ARF1（ ADP-ribosylation factor 1， ADP-核糖基化因子1）是一种小GTPase蛋白，在细胞内囊泡运输中发挥重要作用。当未被激活时，ARF1位于细胞质中，与GDP结合。在鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）的催化下，ARF1释放GDP，并从GDP结合状态转换到GTP结合状态，从而与GTP结合，形成ARF1-GTP。ARF1存在一个酰化氨基末端的两亲螺旋结构，当结合GTP时，这个螺旋结构会插入膜中，使激活的ARF1能与膜紧密结合，这确保了与ARF1-GTP结合的效应蛋白与膜表面紧密相连。ARF1激活后，可以招募货物适配器（Cargo adaptor），如COP I蛋白、衔接蛋白（AP）、exomer等，形成二价复合物，调控囊泡的形成和运输。例如，COPⅠ能诱导膜弯曲及分拣货物形成囊泡，并从高尔基体运向内质网。此外，ARF1也可以参与内质网-细胞膜、内质网-溶酶体、高尔基体-细胞膜、高尔基体-溶酶体间的物质运输。当囊泡运输到目的地后，GTPase激活蛋白（GAPs）促进GTP水解，ARF1从活化状态转变为非活化状态，从而与囊泡分离，进而促进囊泡与目标膜的融合。总之，ARF1在细胞内囊泡运输中起着核心作用。

参考文献：

[1] Kaczmarek B, et al. Biol Cell. 2017 Dec; 109(12):391-399.[2] Paczkowski JE, et al. Trends Cell Biol. 2015 Jul;25(7):408-16.[3] Roth MG. Cell. 1999 Apr 16;97(2):149-52.

敲黑板啦！

1.星形胶质细胞LRP1促进健康线粒体从星形胶质细胞转移到神经元

2.LRP1抑制星形胶质细胞中ARF1的乳酸化，从而介导线粒体转移

3.LRP1介导的星形胶质细胞-神经元间线粒体转移可以减轻脑I/R损伤

4.脑卒中患者乳酸升高与脑脊液星形胶质细胞线粒体呈负相关

研究结果

1.星形胶质细胞中的LRP1缺失可减少星形胶质细胞线粒体向神经元转移

据报道，星形胶质细胞可以释放健康的线粒体并将其转移到邻近的神经元，以恢复神经元的健康。为了验证这一观点，研究人员用3×FLAG-eRFP慢病毒标记星形胶质细胞线粒体（小编注：3×FLAG-eRFP全称是Lentivirus-m-mito-3xflag-eRFP，用慢病毒为载体，将线粒体的信号肽构建到病毒载体上，从而与线粒体结合定位于线粒体），并将星形胶质细胞与神经元共培养。结果显示，星形胶质细胞条件培养基（ACM）中存在包含线粒体的细胞外囊泡（EVs）和游离线粒体（图 S1A），并且研究人员还观察到星形胶质细胞线粒体向邻近神经元转移（图 S1B、S1C）。通过耗氧率（OCR）检测，游离线粒体和EVs中线粒体都是健康的，具有正常的功能（图S1D）。用0.22μm滤膜过滤ACM可显著降低功能性细胞外线粒体数量（图S1E-S1H）。为了进一步确认线粒体的健康状况，研究人员用mitoSypHer（一种pH依赖性荧光蛋白）标记星形胶质细胞胞外线粒体（小编注：MitoTracker系列探针专用于检测活细胞线粒体，易于在有活性的线粒体中积累，并且该染料的积累取决于膜电位，实验中对其浓度有较高要求，过多会导致潜在伪影和线粒体毒性，而且过高的浓度可能会对其他细胞结构进行染色。mitoSypHer全称是Lentivirus-SypHer3s-dmito，也是一种慢病毒，可结合到线粒体上，不存在线粒体毒性等潜在问题），并与神经元共培养（图S1I），结果观察到健康线粒体向神经元进行转移，而用0.22μm滤膜过滤阻断了这一转移过程（图S1I）。

为了检验星形胶质细胞LRP1是否影响线粒体的释放和转移，研究人员在小鼠C8-D1A星形胶质细胞中用shLrp1敲低Lrp1，用新鲜培养基培养24 h后收集ACM（图1A和1B）。与对照组相比，Lrp1敲低减少了ACM细胞外线粒体的数量（图1B和1C），同时伴随着线粒体功能的下降，包括耗氧量和ATP产生减少（图1D, 1E和S1J）。接下来，研究人员从mitoSypHer标记的shLrp1星形胶质细胞中分离细胞外线粒体，并处理小鼠HT22海马神经元。通过荧光显微镜发现，与对照ACM相比，shLrp1 ACM的细胞外线粒体处理后HT22海马神经元中被mitoSypHer标记的线粒体数量显著减少（图1F和S1K），这表明Lrp1敲低减少了星形胶质细胞线粒体向神经元的转移。柠檬酸合成酶活性、线粒体膜电位、OCR和线粒体动力学蛋白测量结果显示，星形胶质细胞释放的线粒体健康且功能齐全（图S1L-S1N）。此外，在神经元-星形胶质细胞共培养24小时后，研究人员在对照组神经元中观察到更多的线粒体（大多数直径<0.5 mm），而在与shLrp1星形胶质细胞共培养的神经元中则没有（图1G）。由此可见，星形胶质细胞中Lrp1的敲低降低了共培养神经元线粒体ATP的产生和OCR（图1H和S1O）。据报道，CD38-cADP核糖信号的钙依赖性机制能介导星形胶质细胞的细胞外线粒体颗粒释放，研究人员通过实验发现CD38蛋白表达和CD38-cADP信号强度在对照组和shLrp1星形胶质细胞之间没有差异（图S1P），这表明该过程与CD38无关。此外，Lrp1沉默不影响星形胶质细胞的凋亡或活性，表明线粒体释放减少不是由于非特异性的细胞毒性造成的（图S1Q和S1R）。LRP2是LDLR家族的另一个重要成员，研究人员接下来探究了LRP2的影响，发现与Lrp2相比，Lrp1在星形胶质细胞中的含量要丰富得多（图S1S）。星形胶质细胞中Lrp2敲低对Lrp1的表达和随后线粒体的释放没有显著影响（图S1T和S1U）。总的来说，这些结果表明星形胶质细胞LRP1促进线粒体从星形胶质细胞转移到邻近的神经元。

为了探究LRP1介导的线粒体转移是否会影响神经元的急性死亡，研究人员将转染shCtrl或shLrp1的星形胶质细胞和HT22神经元进行共培养，并对其进行2小时的氧糖剥夺，然后进行18小时的复糖复氧（OGD）（图 1I）。经过OGD处理或Lrp1敲低后，星形胶质细胞的活性和线粒体功能并没有明显下降（图 S1V 和 S1W）。这一结果与现有研究一致，表明星形胶质细胞对I/R损伤更具弹性。对照组星形胶质细胞在氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）后可维持共培养神经元的活性，而Lrp1敲低后星形胶质细胞恢复神经元活性的能力明显降低（图 1I）。此外，用从对照组或Lrp1敲低的星形胶质细胞中分离出的细胞外线粒体处理暴露于OGD的神经元时，也观察到了相同的结果（图 1J）。此外，研究人员使用原代神经元进行了相同的实验，观察到Lrp1对线粒体功能和转移具有与前述一致的影响（图 S1X-S1Z）。这些结果表明，星形胶质细胞中Lrp1缺失会抑制星形胶质细胞线粒体释放并转移到神经元，使神经元对急性应激敏感。

拓展阅读：

CD38-cADP核糖信号与线粒体释放

在大脑中，CD38主要在神经胶质细胞中表达，并可能在神经胶质串扰中发挥作用。CD38是一种 NAD+依赖性代谢酶,其在线粒体膜上可使用NAD+作为底物来形成环状ADP核糖（cADPR）等核苷酸代谢产物。核苷酸代谢产物是有效的第二信使，可调节细胞质中Ca2+的动员，激活控制各种生物学过程的信号通路。先前研究人员发现，当小鼠大脑中的神经元遭受线粒体损伤时，星形胶质细胞中CD38/cADPR信号被激活，并以Ca2+依赖的方式释放自身的一些线粒体来帮助修复它们。

先前研究发现，人神经胶质瘤U87细胞通过饥饿处理会促使大量NAD+释放到细胞外，并与细胞膜外侧的CD38结合；在CD38催化作用下，NAD+被进一步转化成信使因子cADPR（小编注：NAD+是尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD+分子由尼克酰胺（维生素PP）、一分子核糖、一分子磷酸以及一分子腺苷酸（AMP）组成，ADP是二磷酸腺苷，由一分子腺苷与两个相连的磷酸基团组成。NAD+在脱掉尼克酰胺（维生素PP），加入一分子磷酸基团后即可形成cADPR），再次进入胞内。随后，cADPR作用到内质网Ryanodine受体，启动钙库释放钙离子，释放的钙离子快速聚集到细胞膜内侧，促进细胞骨架蛋白F-actin重新聚合，继而导致细胞膜内陷，引发胞吞作用将外源性线粒体从胞外转移到细胞内。

参考文献：

[1] Hayakawa K, et al. Nature,2016, 535(7613):551-5.[2] Chao S, et al. Theranostics,2019,9(12):3595-3607.

                                   图1.星形胶质细胞LRP1促进线粒体从星形胶质细胞转移到神经元

                                                   图S1.星形胶质细胞LRP1促进线粒体释放

2.星形胶质细胞LRP1敲低增加糖酵解和乳酸生成

线粒体在细胞能量代谢中起核心作用，反之，营养状况也会影响线粒体功能。为了探索LRP1介导线粒体转移的代谢机制，研究人员对shCtrl或shLrp1处理的星形胶质细胞进行了靶向代谢组学分析。结果显示，在Lrp1敲低的星形胶质细胞中，细胞内葡萄糖和糖酵解中间体甘油醛-3-磷酸和乳酸的含量显著增加（图2A）。此外，与对照组相比，许多三羧酸循环（TCA）中间体，包括琥珀酸、草酰乙酸和苹果酸，在shLrp1处理的星形胶质细胞中也显著增多（图2A）。为了验证这些代谢变化，研究人员接下来测定星形胶质细胞的OCR和胞外酸化率（ECAR），分别用来检测细胞内线粒体的氧化磷酸化功能和细胞糖酵解能力。结果发现，与shCtrl组相比，shLrp1组星形胶质细胞的OCR和ECAR随着糖酵解和TCA代谢物的积累而增加（图2B和2C）。此外，Lrp1敲低的星形胶质细胞的ECAR/OCR比率和ATP生成速率也显著增加，表明其糖酵解能力相对于氧化磷酸化增强（图2D和S2A）。

为了探究Lrp1敲低的星形胶质细胞中糖酵解能力的增强是否由葡萄糖摄取增加引起，研究人员用同位素标记的葡萄糖（[U-13C]葡萄糖）处理星形胶质细胞。与对照组相比，Lrp1敲低显著增加了星形胶质细胞的葡萄糖摄取（图2E）。由于葡萄糖转运蛋白-1 （GLUT1）介导的质膜运输在葡萄糖进入星形胶质细胞中起关键作用，研究人员对GLUT1蛋白含量进行检测。结果显示，虽然GLUT1蛋白总量保持不变，但与shCtrl组相比，shLrp1组星形胶质细胞膜上的GLUT1积累增加了约50%（图S2B-S2D）。

在中枢神经系统（CNS）中，乳酸主要是由星形胶质细胞中葡萄糖和糖原的糖酵解产生。因此研究人员推测，在shLrp1处理的星形胶质细胞中会生成更多的乳酸。实验结果显示，与shCtrl组相比，shLrp1处理的星形胶质细胞内和培养基中的乳酸水平均升高，乳酸脱氢酶（LDH）活性增强，同时乳酸脱氢酶A/B（LDHA/B）、磷酸果糖激酶（PFK）和丙酮酸激酶（PK）的蛋白水平升高，表明有氧糖酵解被激活（图2F-2I和S2E）。此外，Lrp1敲低并没有上调细胞内糖原含量，也没有上调糖原代谢和乳酸转运中酶的表达，包括糖原合酶1 （Gys1）、糖原脱支酶（Agl）、单羧酸转运蛋白1 （Mct1）和泛连接蛋白1 （Panx1）（图S2F和S2G）。因此，乳酸增加不是来自糖原分解或乳酸运输失调。此外，研究人员探究了Lrp1的下游信号通路，观察到Lrp1敲低与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激酶1/2 （MEK1/2）和细胞外信号调节激酶1/2 （ERK1/2）磷酸化升高相关，这是MAPK途径的关键成分，同时还观察到糖酵解的中心调节因子c-MYC的表达升高（图S2H）。接着用MEK特异性抑制剂U0126来抑制MAPK-c-MYC信号级联通路，其有效抑制了shLrp1星形胶质细胞内乳酸水平的升高（图S2H和S2I）。因此，Lrp1的敲低通过促进Glut1介导的葡萄糖摄取增强和MAPK-c-MYC信号通路的激活来提高糖酵解能力。（小编注：P38 MAPK可调控c-MYC磷酸化,进而激活c-MYC, c-MYC作为转录因子可以调控多种糖酵解酶（HK2等）的表达）

除了糖酵解，细胞还可以通过谷氨酰胺和乙酸的氧化产生乳酸（图2J）。为了进一步研究Lrp1敲低后星形胶质细胞乳酸增加的来源，研究人员进行了碳13 （13C）示踪实验。分别用[U-13C]葡萄糖、[U-13C]L-谷氨酰胺或[U-13C]乙酸标记星形胶质细胞，并分析乳酸和TCA循环代谢产物中13C水平（图2J）。在星形胶质细胞中，仅有很少一部分乳酸是由13C标记的谷氨酰胺或乙酸生成，因此二者不是乳酸生成的主要来源（图2K和S2J）。大部分乳酸由葡萄糖产生，Lrp1的下调增加了星形胶质细胞中乳酸的产生（图2K和2L）。这些结果表明星形胶质细胞Lrp1敲低是通过糖酵解产生更多乳酸。已有研究表明，除了释放线粒体外，星形胶质细胞还可以产生多种神经元保护因子，包括组织型纤溶酶原激活剂（tPA）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、血管内皮生长因子（VEGF）和成纤维细胞生长因子2（FGF-2）。于是研究人员对这些因子进行检测，发现在Lrp1敲除后，它们的表达保持不变，表明这些因子不介导Lrp1对星形胶质细胞-神经元串扰的影响（图S2K）。

拓展阅读：

谷氨酰胺和乙酸如何转化成乳酸

谷氨酰胺分解代谢可为乳酸生成提供碳骨架，具体过程为谷氨酰胺通过氨基酸转运蛋白进入细胞质，随后在谷氨酰胺酶作用下转化为谷氨酸，谷氨酸在氨基转移酶作用下转化成α-酮戊二酸进入三羧酸循环，经苹果酸-丙酮酸途径，最终在乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A, LDHA）作用下转变为乳酸。 乙酸通过乙酰辅酶A合成酶1/2（ACSS1/2）催化生成乙酰辅酶A,随后进入三羧酸循环，通过与上述谷氨酰胺相似途径生成乳酸。

参考文献：

[1] Li X, et al. Signal Transduct Target Ther, 2022, 7(1):305.

                                         图2.Lrp1基因沉默促进星形胶质细胞的糖酵解和乳酸代谢

                                图 S2.Lrp1基因沉默促进星形胶质细胞的葡萄糖摄取并调节乳酸代谢

3.乳酸抑制星形胶质细胞释放功能性线粒体

接下来，为了确定乳酸生成的增加是否会影响星形胶质细胞的线粒体释放，研究人员对星形胶质细胞进行缺氧处理，从生理上诱导无氧糖酵解（图3A）。缺氧处理导致细胞内乳酸增加，ACM中胞外线粒体和ATP水平降低，表明缺氧抑制线粒体释放（图3B）。此外，鱼藤酮（小编注：有研究表明，乳酸可作为一种信号分子，直接进入线粒体，激活线粒体电子传递链，增加线粒体ATP产生。而这里用鱼藤酮抑制线粒体呼吸链复合体I后，致使呼吸链无法正常进行，就会导致乳酸的累积，从而导致和上述无氧糖酵解相似的现象）能通过抑制线粒体呼吸链复合体I，对乳酸生成和线粒体释放产生类似的影响（图S3A）。相反，2-脱氧-d-葡萄糖（2-DG）（一种非代谢葡萄糖类似物）会通过抑制糖酵解来抑制乳酸的产生，导致细胞外线粒体和ATP的产量激增（图3C）。

LDH包括LDHA和LDHB两种异构体，能催化丙酮酸和乳酸之间的可逆反应。为了测试星形胶质细胞线粒体释放是否需要LDH的参与，研究人员用（R）-GNE-140（一种LDHA/B的选择性抑制剂）（小编注：（R）-GNE-140是LDHA抑制剂，但其对LDHB也有一定的抑制作用）对其进行处理，发现与对照组相比，（R）-GNE-140处理降低了星形胶质细胞的乳酸生成，并增加了细胞外线粒体和ATP水平（图3D）。接着，研究人员敲减星形胶质细胞中的Ldha和Ldhb基因，以完全阻断乳酸和丙酮酸的相互转化（图S3B）。结果显示，Ldha和Ldhb双敲减能抑制50%的乳酸生成，并促进细胞外线粒体和ATP生成（图3E），这些影响能在补充乳酸后被显著逆转（图3E）。研究人员进一步证实，Ldha/b敲减显著降低了shLrp1星形胶质细胞中乳酸水平，并促进线粒体释放；而过表达Ldha/b可促进星形胶质细胞中乳酸水平，并抑制线粒体的释放，与shLrp1星形胶质细胞的结果相似（图3F、3G、S3C和S3D）。为了检测乳酸是否能调节星形胶质细胞线粒体的释放，研究人员用梯度剂量的乳酸（范围从静息血液中的乳酸浓度到生理性和病理性状态下的乳酸浓度）培养星形胶质细胞2小时，发现乳酸以剂量依赖的方式降低细胞外线粒体和ATP水平（图3H），表明乳酸能够抑制星形胶质细胞的线粒体释放。总之，上述发现表明LRP1通过抑制星形胶质细胞中的乳酸生成来促进线粒体释放。

                                              图3.乳酸抑制星形胶质细胞功能性线粒体的释放

                         图S3.LDH调控星形胶质细胞线粒体释放和ARF1的表达、乳酸化和琥珀酰化

4.ARF1-K⁷³乳酸化介导LRP1诱导的线粒体释放

研究人员还观察到shLrp1星形胶质细胞中乳酸水平升高，组蛋白赖氨酸乳酸化（Kla）整体水平也显著升高，这是一种新型的乳酸衍生的翻译后修饰（图4A和S3E）。为了确定蛋白Kla修饰对线粒体转移的影响，研究人员接下来对shCtrl和shLrp1星形胶质细胞进行了乳酸化蛋白组分析，从136个Kla修饰改变的蛋白中鉴定出163个赖氨酸残基（倍数变化≥2或≤0.5）。其中84个蛋白（占总蛋白的61.76%）位于细胞核内，32个蛋白（占总蛋白的23.53%）位于细胞质内（图4B）。实验结果显示乳酸处理可以在不到2小时的时间内抑制线粒体的转移（小编注：图3H用不同浓度乳酸处理星形胶质细胞2h，结果显示乳酸（10-50nm）可在2h内抑制线粒体的转移）（图3H），故研究人员推测，乳酸对线粒体的影响更可能是通过胞质蛋白的乳酸化介导的，而非核内蛋白。值得注意的是，在发生Kla修饰的胞质蛋白中，ADP-核糖基化因子1第73位赖氨酸（ARF1-Kla⁷³）的乳酸化修饰水平位于前列（图4C-4E、S3F和S3G）。Lrp1敲低不影响细胞中总琥珀酰化和赖氨酸去琥珀酰化酶Sirtuin5的表达（小编注：琥珀酰化修饰是由来自琥珀酰辅酶A的琥珀酰基团共价结合到氨基酸残基的过程，主要发生在赖氨酸残基上；乳酸化修饰是指乳酸基团共价结合到氨基酸上，主要发生在赖氨酸残基上。图2A-2D结果显示与对照组相比，shLrp1星形胶质细胞中糖酵解代谢产物和TCA循环代谢产物含量显著增加，且OCR和ECAR水平也显著升高，而ECAR/OCR比值显著升高，这说明shLrp1星形胶质细胞的糖酵解能力高于线粒体的氧化磷酸化能力。而在这里，琥珀酰化修饰主要依赖于来自TCA循环产物琥珀酰辅酶A，乳酸化修饰主要依赖于糖酵解产物乳酸，与对照组相比，shLrp1星形胶质细胞中蛋白琥珀酰化水平无显著差异，而蛋白乳酸化修饰水平显著增加，可进一步说明Lrp1主要通过调控糖酵解途径，影响星形胶质细胞的线粒体释放过程），而乳酸处理可诱导细胞中ARF1蛋白总乳酸化修饰和73位赖氨酸的乳酸化修饰，不影响ARF1的琥珀酰化修饰水平（图S3H-S3J）。此外，GO分析显示ARF1与LRP1的功能相似性最高（图4F）。接着，研究人员对这些发生高乳酸化修饰的胞质蛋白进行了蛋白-蛋白互作分析，发现ARF1及其相关蛋白高度富集在在囊泡出芽、运输和定位过程中（图4G），表明ARF1在线粒体释放中具有潜在的功能。此外，IP和WB实验结果显示，shLrp1星形胶质细胞中ARF1蛋白活性更高（表现为更多GTP与ARF1结合），这是ARF1调节囊泡运输所必需的（图4H）。

为了测试ARF1- Kla⁷³是否是介导线粒体释放的关键因子，研究人员将ARF1第73位赖氨酸突变为精氨酸（K73R），从而抑制其位点发生乳酸化修饰，结果显示K73R显著抑制了ARF1活性，并促进线粒体释放到胞外（图4I-4K）。相比之下，将K73突变为谷氨酰胺（K73Q，模拟了ARF1蛋白第73位点乳酸化修饰）（小编注：ARF1 K73位点发生乳酸化修饰可提高ARF1的蛋白活性，而ARF1 K73Q突变可促进ARF1活性，与ARF1 K73乳酸化作用类似，因此ARF1 K73Q突变体模拟了ARF1 K73乳酸化修饰）可促进ARF1活性，并抑制线粒体的释放（图4I-4K）。这些发现表明乳酸通过ARF1-Kla⁷³抑制星形胶质细胞的线粒体释放。

拓展阅读：

组蛋白乳酸化修饰

传统上认为乳酸是糖酵解代谢的废物，细胞通过排泄将其丢弃，然而越来越多研究表明，乳酸可作为信号分子、能量底物和免疫调节分子发挥重要作用。2019年赵英明教授首次发现了细胞中积累的乳酸可导致组蛋白上的赖氨酸发生乳酸化修饰，进而调控基因表达，并参与细菌感染的M1巨噬细胞的稳态调控。随后，越来越多研究揭示了蛋白乳酸化修饰在各种疾病中的重要性。如，在阿尔兹海默症中，组蛋白H4K12乳酸化修饰可正反馈调控小胶质细胞的葡萄糖代谢，加剧阿尔兹海默症中小胶质细胞的功能紊乱；肝星状细胞中HK2激活可促进乳酸水平和组蛋白H3K18乳酸化水平，通过促进肝星状细胞激活的关键诱导基因的表达，促进肝纤维化。本篇文章发现，星形胶质细胞Lrp1缺失促进了糖酵解水平和乳酸生成，进而促进ARF1蛋白乳酸化修饰，抑制星形胶质细胞释放功能线粒体，加剧神经元的损伤和脑I/R损伤。

参考文献：

[1] Zhang D, et al. Nature. 2019.

[2] Rui-Yuan Pan , et al. Cell Metabolism. 2022.

[3] Hyunsoo Rho, et al. Cell Metabolism.2023.

                                        图4.ARF1-K⁷³乳酸化介导LRP1诱导的线粒体释放

5.LRP1调控的线粒体转移可缓解脑I/R损伤

接下来，为了探究LRP1诱导的线粒体转移是否能缓解脑缺血再灌注（I/R）损伤，研究人员将shLrp1或shCtrl序列导入2型腺相关病毒（AAV2）载体上，并在序列前插入星形胶质细胞特异性GfaABC1D启动子，通过眶后注射构建星形胶质细胞Lrp1特异性敲减小鼠（Lrp1 cKD小鼠）（图5A、S4A和S4B），Lrp1 cKD小鼠在摄食量、体重、空腹血糖、神经功能、星形胶质细胞丰度、脑血流量（CBF）、血管结构、线粒体功能、神经发生和神经网络活动方面与对照小鼠无显著差异（图S4C-S4M），而Lrp1 cKD小鼠大脑的葡萄糖摄取水平和乳酸水平显著升高，脑脊液中星形胶质细胞来源的线粒体显著下降（图5B-5D）。接下来研究人员利用AAV2-GfaABC1D-Cre驱动的PhAMfloxed（光激活线粒体）标记Lrp1 cKD小鼠的星形胶质细胞线粒体（小编注：PhAM floxed小鼠表达线粒体特异性的Dendra2荧光蛋白。该PhAM floxed小鼠与AAV2-GfaABC1D-Cre小鼠杂交后，可在线粒体中切除一个固定的stop片段，使Dendra2荧光蛋白表达绿光，从而特异性标记星形胶质细胞线粒体。若将绿色荧光线粒体暴露在405 nm激光下，可将绿色荧光不可逆地转换为红色），结果显示Lrp1 cKD小鼠神经元中星形胶质细胞来源的线粒体显著减少（图5E和S4N）。接下来，研究人员采用大脑中动脉闭塞术（MCAO）诱导脑I/R损伤，对照小鼠和Lrp1 cKD小鼠的CBF均减少，两组小鼠间无显著差异（图S5A）。MCAO术后，Lrp1 cKD小鼠脑梗死区域明显增大，表明Lrp1可缓解脑IR损伤（图5F）。此外，通过改良的Bederson神经功能评分、水迷宫和旷场实验，Lrp1 cKD小鼠表现出神经功能恶化（图5G）。神经元的电镜和荧光染色结果表明，Lrp1 cKD小鼠神经元内线粒体减少，尤其是来自星形胶质细胞的线粒体（图5H-5J）。此外，研究人员观察到与对照小鼠相比，MCAO手术后Lrp1 cKD小鼠神经元中凋亡水平增加，而在星形胶质细胞没有观察到明显凋亡；此外Lrp1 cKD小鼠梗死半球中神经元线粒体功能受损程度更高，而星形胶质细胞的线粒体功能保持不变（图S5B-C），这一观察结果表明在应激条件下星形胶质细胞在维持大脑稳态发挥着重要作用。

随后研究人员向小鼠脑室内注射线粒体，显著促进了MCAO术后Lrp1 cKD小鼠神经元线粒体含量，并改善了Lrp1 cKD小鼠的脑梗死、神经功能（图S5D-S5H），提示Lrp1通过调控星形胶质细胞线粒体向神经元转移，保护神经元免受脑I/R损伤；而向小鼠脑室注射乳酸，会导致MCAO术后Lrp1 cKD神经元线粒体显著减少，加剧神经功能损伤（图S5I-S5K），表明乳酸可抑制星形胶质细胞线粒体转移到邻近神经元并加剧缺血性损伤。为了探究LDH是否介导LRP1的神经保护作用，研究人员向小鼠脑室注射星形胶质细胞特异性AAV2-shLdha/b或注射(R)-GNE-140（LDHa/b选择性抑制剂）抑制LDH，结果显示Ldha/b敲低或（R）-GNE-140处理降低了术后Lrp1 cKD小鼠大脑乳酸水平、梗死面积，并提高Lrp1 cKD小鼠神经功能和神经元线粒体含量（图S5L-S5R），表明LDH可介导Lrp1对脑IR损伤的保护作用。

                            图5.LRP1能通过调控星形胶质细胞线粒体释放和转移来减轻脑I/R损伤

                            图S4.在正常条件下星形胶质细胞LRP1不会引起小鼠生理和神经元的变化

                              图S5.脑室内注射外缘线粒体和乳酸代谢介导LRP1对脑I/R损伤的影响

6.星形胶质细胞ARF1-K73乳酸化抑制线粒体转移，加剧脑I/R损伤

为了进一步探究ARF1-K⁷³乳酸化是否介导LRP1对脑I/R损伤的保护作用，研究人员将星形胶质细胞特异性AAV2-ARF1 WT/ARF1 K73R/ARF1 K73Q通过眶后注射到Lrp1 cKD小鼠中，以在大脑星形胶质细胞中特异性过表达ARF1 WT/ARF1 K73R/ARF1 K73Q（图S6A-C），结果显示过表达ARF1 WT/ARF1 K73R/ARF1 K73Q不影响Lrp1 cKD小鼠的摄食量、体重、空腹血糖水平和神经功能（图S6D-S6G），然而，与ARF1 WT相比，过表达ARF1 K73R的Lrp1 cKD小鼠脑脊液和神经元中线粒体水平显著升高，而过表达ARF1 K73Q的Lrp1 cKD小鼠脑脊液和神经元中线粒体水平显著降低（小编注：星形胶质细胞通过其水通道介导脑脊液与间质液（位于神经元和胶质细胞之间的空间）的交换，以清除大脑中的废物。星形胶质细胞的“足”排列在大脑的血管上，这些“足”上含有水通道，可以让脑脊液（包括其中的分子）进入星形胶质细胞，然后进入大脑，在这里脑脊液可以与神经元直接相互作用，影响神经元功能。有研究报道星形胶质细胞可释放线粒体到脑脊液中，这一过程由星形胶质细胞CD38信号介导，脑脊液中线粒体可被受损神经元摄取，维持神经元功能（Nature，2016））（图6A、6B和S6H），这表明ARF1乳酸化修饰可抑制Lrp1 cKD小鼠大脑中星形胶质细胞的线粒体释放。接着，研究人员对过表达ARF1 WT/ARF1 K73R/ARF1 K73Q的Lrp1 cKD小鼠进行MCAO手术来诱导脑I/R损伤，以评估ARF1 K73R和ARF1 K73Q在脑损伤中的潜在作用。结果显示，与ARF1 WT相比，过表达ARF1 K73R的Lrp1 cKD小鼠大脑梗死面积减少，神经功能得到改善，神经元中线粒体水平升高；相反，过表达ARF1 K73Q的Lrp1 cKD小鼠大脑梗死面积增大，神经功能恶化，神经元中线粒体水平降低（图6C-6F）。这些结果表明，星形胶质细胞ARF1乳酸化会抑制星形胶质细胞线粒体向神经元转移，进而加剧脑I/R损伤。

                              图6.星形胶质细胞ARF1-K⁷³乳酸化抑制线粒体转移，加剧脑I/R损伤

                                  图S6.星形胶质细胞ARF1突变对Lrp1-cKD小鼠的表型影响不大

7.与健康对照相比，脑卒中患者的脑脊液中乳酸水平升高

为了进一步探究此项研究结果的临床意义，研究人员量化分析了人类脑卒中患者和健康受试者脑脊液（CSF）中乳酸水平。结果表明，与健康对照相比，缺血性脑卒中患者脑脊液中乳酸水平明显升高（图6G），并且乳酸水平与脑梗死面积呈正相关，而与脑脊液中星形胶质细胞线粒体呈负相关（图6H-6J）。总之，这些结果表明，乳酸会抑制线粒体转移并加重脑I/R损伤。

总结：

本项研究中，研究人员发现星形胶质细胞Lrp1通过抑制乳酸的产生和ARF1的乳酸化从而促进线粒体从星形胶质细胞转移到神经元。研究人员首先将星形胶质细胞与神经元共培养，证明星形胶质细胞Lrp1缺失会抑制星形胶质细胞的线粒体向神经元转移。随后，通过代谢组学等研究发现抑制星形胶质细胞的Lrp1能促进促进GLUT1在细胞膜上的积累，从而促进葡萄糖摄取、糖酵解和乳酸生成，从而促进ARF1乳酸化，减少星形胶质细胞的线粒体释放。接下来，研究人员通过构建小鼠缺血性脑卒中模型，证明了抑制星形胶质细胞Lrp1可减少线粒体向受损神经元的转移，并加重I/R损伤。此外，研究人员还发现人类脑卒中患者CSF中乳酸升高，并与星形胶质细胞线粒体数量呈负相关。总之，本篇研究揭示了Lrp1通过介导线粒体转移影响星形胶质细胞-神经元交流，对于缺血性脑卒中具有重要的保护作用。（小编注：本文利用电镜证明星胶条件培养基中存在囊泡包裹的线粒体和游离线粒体，并利用TOM20抗体偶联的磁珠分离游离线粒体和氧耗率检测证明游离线粒体和囊泡包裹的线粒体本身都具有线粒体功能，但并未进一步证明星胶到神经元的线粒体转移主要是哪种线粒体发挥作用。线粒体转移到受损神经元后，可以改善线粒体膜电位，增加细胞内ATP水平，帮助神经元维持正常功能和存活，促进神经元轴突延长和树突再生。）

链接：https://doi.org/10.1016/j.cmet.2024.05.016