现代狂犬病疫苗生产用细胞和毒种：现状和前景(2)

王月  黄思佳综述  严家新审校

(原载《国际生物制品学杂志》2012,35(5)：237-241)                                         

2             狂犬病疫苗生产使用的主要细胞

体外细胞培养技术建立于20世纪50、60年代。1954年美国的Enders 等因在细胞中培养脊髓灰质炎病毒的突破性进展而获得诺贝尔奖[3,4]，随后细胞来源的狂犬病疫苗的研究也开始起步[5]。

2.1  原代地鼠肾细胞(PHKC)

原代地鼠肾细胞疫苗(PHKCV)是第一株被批准的细胞培养人用狂犬病毒疫苗。狂犬病毒街毒株和固定毒株，譬如标准攻击毒(CVS)，于1958年在PHKC培养[6]。1968年，加拿大批准使用狂犬病毒固定毒株CL-60（来源于阿拉巴马州达弗林街[SAD]分离株）的PHKCV [7]。自1971年起，前苏联使用Vnukovo-32毒株 （SAD毒株在PHKC适应后的衍生株） 生产PHKCV [7]。1980年，中国武汉生物制品研究所林放涛教授领导的小组率先研制成功含铝佐剂的PHKCV，毒株为北京aG株，使我国狂犬病疫苗的生产及时赶上了国际先进水平 [8,9]。在随后的二十多年里，我国生产的PHKCV曾是当时世界上累计生产量最大的狂犬病疫苗，高峰年份每年产销量超过500万人份。此外，1974年研发出使用巴斯德毒株(PV株)的胎牛肾细胞狂犬病毒疫苗[7]，1978年研发出使用PM株的狗肾细胞的狂犬病毒疫苗。荷兰批准了上述两株疫苗。

2.2  人类二倍体细胞(HDC)

第一株人二倍体细胞株WI-38建立于1961年。此后不久，狂犬病毒CVS-24在WI-38细胞内增殖，观察到不同的致细胞病变效应[10,11]。约2年后，狂犬病毒PV株、PM株、HEP株和LEP株在HDC中能成功持续感染[12]。1974年12月法国批准狂犬病毒人二倍体细胞疫苗(HDCV)，随后，美国在1980年6月也批准了该疫苗[13]。狂犬病毒HDCV是第一株纯化、浓缩和冻干的无任何佐剂的狂犬病疫苗，含有人血白蛋白作为稳定剂。尔后，狂犬病毒HDCV被WHO推荐为金标准参考疫苗。与其他狂犬病疫苗相比，狂犬病毒HDCV较少引起不良反应。迄今为止，仅有极个别的短暂的神经性麻痹疾病案例[13,14] ，可能与接种HDCV有某种相关性。从一开始，生产HDCV证明难以规模化生产以满足工业化需求。所以，HDCV成本仍然很高，典型地仅适用于发达国家。

2.3  Vero细胞(传代细胞)

二倍体细胞株，包括WI-38、MRC-5 和 FRhL-2，分裂能力有限（有限寿命是连续传代约50次），之后细胞衰老，这种现象称为“Hayflick极限”。此外，二倍体细胞株很难大规模工业化培养用于疫苗生产。永生细胞系具有几乎无限的生长能力，并且易于大规模培养用于工业生产，但可能被认为具有致癌性。理论上讲，体内癌症发生可能由于引入单个细胞或功能性的致癌转录单元插入正常的体细胞染色体。将此细胞株用于疫苗生产需要谨慎考虑。第一株细胞系HeLa建立于1951年。随后开发的其他细胞系已经用于许多感染性疾病研究。感染狂犬病毒CVS株、HEP株、LEP株和PM株的幼地鼠肾细胞(BHK-21)产生细胞病变效应[15,16]。

Vero细胞系来源于非洲绿猴肾细胞，于1962年建立。Vero细胞支持狂犬病毒属多种基因型病毒的感染。在1978年，美国监管当局接受连续传代细胞系用于人用生物制品的生产[17]。在20世纪70年代晚期和80年代早期，以Vero细胞为基质生产商业用灭活脊髓灰质炎疫苗[18]。在20世纪80年代早期，研发Vero细胞为基质生产狂犬病疫苗[19–21]。1985年欧洲批准纯化的Vero细胞狂犬病疫苗(PVRV) [7]。多年来，Vero细胞狂犬病疫苗得到WHO和欧盟的肯定，在全球范围内广泛使用，但是在美国还未获得批准。

经过超过半个世纪的实践，细胞培养已成为常规的疫苗生产技术。经充分鉴定、遗传稳定的狂犬病毒能够适应细胞培养，确保高产量。与动物神经组织培养方法成为鲜明的对比，一支小的冻存管内的Vero细胞即可以无限繁殖，能够以低廉的价格进行大规模工业化生产。Vero细胞按工业规模每批次可以生产约6000升，勿需浓缩，可分装成超过1200万剂PVRV (每剂为0.5毫升）。

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