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狂犬病的实验室诊断(23)

已有 121 次阅读 2026-6-6 23:25 |个人分类:狂犬病防治|系统分类:科普集锦

狂犬病的实验室诊断(23)

前记:

目前国际上关于狂犬病研究最权威最全面的大型学术专著是《狂犬病：科学基础和管控（RABIES: SCIENTIFIC BASIS OF THE DISEASE AND ITS MANAGEMENT）》，简称《狂犬病(RABIES)》。该书最新版（第４版）已于2020年5月面世。

该书共有22章，其中第12章是《Laboratory diagnosis of rabies(狂犬病的实验室诊断）》。现将此章的内容全文翻译成中文供参考。

第12章狂犬病的实验室诊断(23)

(Laboratory diagnosis of rabies)

4. 病毒RNA检测的分子生物学方法(续)

(Molecular methods of viral RNA detection)

4.6 RT-PCR在研究中的应用

(Application of RT-PCR in research)

当然，分子方法在狂犬病发病机制研究中具有巨大价值，此应用在其他部分有更详细的描述（见第8章）。标准RT-PCR方法已被用于检测实验性（Charlton, Nadin-Davis, Casey, & Wandeler, 1997; Vos et al., 2004）或自然感染动物（Serra-Cobo, Amengual, Abellan, & Bourhy, 2002）体内病毒的器官分布，但实时RT-PCR在此类研究中尤其具有优势，因为凭借其定量特性，它可以提供此类样本中实际病毒载量的测量值。因此，实时RT-PCR已被用于确定感染人类（Panning et al., 2010）或动物（Brookes et al., 2007; Freuling et al., 2009; Johnson et al., 2008）死后各组织中的病毒水平，以及确定接受实验性治疗患者唾液样本中的病毒滴度（Nadin-Davis et al., 2009）。对于野生动物（尤其是欧洲许多受保护的蝙蝠种群）狂犬病的流行病学研究，从口腔拭子中提取的RNA通过RT-PCR检测狂犬病病毒的存在已被证明是有用的（Echevarrıa, Avellon, Juste, Vera, & Ibanez, 2001; Picard-Meyer et al., 2011）。

4.7 其他用于狂犬病病毒检测的分子生物学方法（1）

(Other molecular methods for rabies virus detection)

已经开发出不同于PCR的扩增方法来检测特定的核酸序列，但只有少数研究报告了探索此类方法应用于狂犬病诊断的研究（Fooks et al., 2009）。有三种等温方法被推崇为廉价的狂犬病病毒诊断检测方法，因为这些技术对技术要求不高，每次测试的试剂成本仅需几美元，并且有可能在现场使用。这些特点使得此类检测对缺乏卫生系统基础设施的发展中国家具有吸引力，尤其是在狂犬病持续对人类健康构成重大威胁的更偏远地区。

其中第一种方法称为基于核酸序列的扩增（NASBA），它使用三种酶——禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶、大肠杆菌RNase H和T7 RNA聚合酶，以及一组引物，来支持RNA模板的等温扩增。Wacharapluesadee and Hemachudha (2001)探索了应用该技术检测狂犬病病毒RNA的方法，其靶向狂犬病病毒N基因中心区域内的180个碱基的病毒序列，随后通过与内部序列结合的报告探针进行识别。就灵敏度而言，该检测方法与标准RT-PCR相比似乎具有优势。

另一种新颖的扩增策略是逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）方法。LAMP方法由Notomi等人（2000）首次描述，它使用具有高链置换活性的DNA聚合酶（例如Bst DNA聚合酶大片段）以及两个内引物和两个外引物。两个内引物中的每一个都结合到靶分子上两个不同的、反义方向的序列上。在65°C孵育1小时期间，涉及所有引物的一系列复杂反应生成多个茎环结构，因此最终反应通过凝胶电泳检测时会产生多种不同大小的产物。这些产物的特异性可以通过限制性内切酶分析来确认，该分析应产生少数几个预期大小的酶切产物。最佳的扩增效率通过靶向长度<300 bp的DNA序列并在反应中加入额外的环引物来实现（Nagamine, Hase, & Notomi, 2002）。逆转录酶与DNA聚合酶的同时使用使得该检测方法能够应用于RNA靶标。