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狂犬病的实验室诊断(22)

已有 530 次阅读 2026-5-31 13:08 |个人分类:狂犬病防治|系统分类:科普集锦

狂犬病的实验室诊断(22)

前记:

目前国际上关于狂犬病研究最权威最全面的大型学术专著是《狂犬病：科学基础和管控（RABIES: SCIENTIFIC BASIS OF THE DISEASE AND ITS MANAGEMENT）》，简称《狂犬病(RABIES)》。该书最新版（第４版）已于2020年5月面世。

该书共有22章，其中第12章是《Laboratory diagnosis of rabies(狂犬病的实验室诊断）》。现将此章的内容全文翻译成中文供参考。

第12章狂犬病的实验室诊断(22)

(Laboratory diagnosis of rabies)

4. 病毒RNA检测的分子生物学方法(续)

(Molecular methods of viral RNA detection)

4.5 分子生物学方法在固定组织中的应用

(Application of molecular methods to fixed tissues)

新鲜脑组织是狂犬病诊断的理想样本，但在某些情况下，脑组织是在鉴别诊断中怀疑狂犬病之前就已固定的，这类标本偶尔也会被送检。虽然免疫组织化学方法已应用于此类样本的诊断，但利用标记的DNA或RNA探针在原位组织切片中检测病毒的技术也在先前方法的基础上得到了广泛发展。加拿大国家狂犬病参考中心描述了一种使用地高辛标记探针在福尔马林固定组织中检测和分型狂犬病病毒转录本的原位杂交方法（Nadin-Davis, Sheen, & Wandeler, 2003）。其他实验室也报告了原位杂交作为固定组织DFA分析确认试验的实用性（Warner, Whitfield, Fekadu, & Ho, 1997）。尽管有商业化的探针标记试剂盒，但没有针对狂犬病特异性探针或序列的商业来源。因此，探针必须在实验室内部自行开发，并适当注意狂犬病病毒的多样性对探针与其靶序列退火能力的影响。此外，由于需要多次孵育和封闭步骤，以及制备组织切片的初始时间，原位杂交方法非常耗费人力，因此这些程序仅在特殊情况下进行。

其他方法探索了RT-PCR方案在此类样本类型中用于病毒RNA检测的应用。在DFA试验和RT-PCR的比较中，Kulonen, Fekadu, Whitfield, and Warner (1999)报告，两种方法均能准确检测24份芬兰样本中的12份中的狂犬病病毒，这些样本经Carnoy固定液固定了1-24小时并包埋在石蜡中，前提是目标为非常短的RT-PCR产物（139 bp），而生成304 bp扩增子的RT-PCR仅检测到67%的阳性样本。相比之下，在福尔马林中固定1天至1周，然后在30°C下作为石蜡包埋组织保存1个月至16年的脑组织中，检测到了狂犬病病毒序列（Wacharapluesadee, Ruangvejvorachai, & Hemachudha, 2006）。该研究还指出，最高效的RT-PCR检测方法是检测最小产物（150 bp）的方法，并且任何样本都无法生成大于400 bp的产物。在一项使用斯里兰卡病理标本的研究中，使用新鲜脑样本通过IHC和分子方法检测狂犬病病毒的结果具有直接可比性。然而，直接对用于IHC的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本使用分子生物学方法效果很差，13个样本中只有2个通过TaqMan RT-PCR获得了阳性扩增，而hnRT-PCR则没有阳性结果（Beck et al., 2017）。这些研究清楚地表明，随着福尔马林固定时间的延长，生成RT-PCR产物变得越来越困难，并且只有短产物能够较频繁地生成。固定和石蜡包埋过程会导致组织中的RNA降解和修饰，并导致RNA与其他细胞组分交联，从而降低RNA提取效率并影响逆转录；这导致无法生成超过几百个碱基对的扩增子。

尽管存在这些挑战，该方法为对长期保存的FFPE样本进行回顾性狂犬病诊断提供了可能性。这需要在组织脱蜡和蛋白酶K处理后，小心地从组织切片中提取RNA。此外，为了获得最佳的靶标检测，需要扩增短扩增子，这使得这类组织成为使用实时RT-PCR技术进行评估的理想候选材料。目前，正在开展研究以评估此类方法在FFPE样本中检测狂犬病病毒的应用（Condori et al., 2020）。

（未完待续）

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