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狂犬病的实验室诊断(17)

已有 234 次阅读 2026-5-27 05:30 |个人分类:狂犬病防治|系统分类:科普集锦

狂犬病的实验室诊断(17)

前记:

目前国际上关于狂犬病研究最权威最全面的大型学术专著是《狂犬病：科学基础和管控（RABIES: SCIENTIFIC BASIS OF THE DISEASE AND ITS MANAGEMENT）》，简称《狂犬病(RABIES)》。该书最新版（第４版）已于2020年5月面世。

该书共有22章，其中第12章是《Laboratory diagnosis of rabies(狂犬病的实验室诊断）》。现将此章的内容全文翻译成中文供参考。

第12章狂犬病的实验室诊断(17)

(Laboratory diagnosis of rabies)

4. 病毒RNA检测的分子生物学方法(续)

(Molecular methods of viral RNA detection)

4.4 检测丽莎病毒属病毒的实时RT-PCR方法(续)

（Real-time RT-PCRs for lyssavirus detection）

4.4.1 5’核酸酶检测法（The 5’ nuclease assay）

该检测方法的化学原理最初称为TaqMan，采用双标记探针（DLP）作为反应的关键组成部分。该探针由合成寡核苷酸组成，能够结合至扩增子一条链上的内部序列，并在其5'端和3'端均进行标记。DLP的5'端共价连接一个报告染料，该染料在特定波长激发下会发出荧光。一个淬灭基团共价连接于DLP的3'端，从而有效淬灭报告染料发出的荧光。当PCR反应中存在目标序列时，会产生特异性产物，并且在退火步骤中，DLP会结合至其互补序列，随后从其中一个PCR引物开始进行链延伸。在DNA合成过程中，DNA聚合酶的5'核酸酶活性会降解探针，使得报告染料与淬灭基团相互分离，PCR产物的存在通过报告染料在特定波长下发出的荧光来检测。

在反应过程中，该信号水平不断上升，直到反应中的试剂耗尽并达到平台期。如果在PCR过程中未产生扩增子，未结合的DLP保持完整，则不会记录到荧光信号的增加，样本将被判定为阴性。

表12.3 用于丽沙病毒检测的实时RT-PCR检测方法

检测基因

靶标与形式

引物

/探针

序列

（5'-3'）

在基因组中

的位置/方向

参考文献

a. 狂犬病基于巴斯德病毒参考毒株（GenBank登录号 M13215）的序列。更多检测方法（包括更具物种特异性的方法）可参见 Fooks 等人（2009）的文献。

+. LN34探针中的+号表示LNA（锁定核苷酸）碱基。

尽管这种方法提供了极高的检测特异性，但由于丽沙病毒属内不同成员之间的核苷酸序列存在差异，设计具有广泛交叉反应性的引物和探针可能具有挑战性。根据错配的位置和频率，目标序列与引物/探针序列之间的碱基错配可能显著降低检测灵敏度，甚至完全阻碍检测。基于探针的检测方法的优势在于，通过使用耦合到不同荧光团（这些荧光团具有不同且易于区分的发射波长）的探针，可以在单个反应中容纳多个目标（多重检测）。

在一项相对早期的研究中，Black、Lowings、Smith、Heaton 和 McElhinney（2002）报告了一项雄心勃勃的研究，旨在使用TaqMan技术检测并区分丽沙病毒基因1-6型。作者报告称，使用这些试剂成功检测并鉴定了106株丽沙病毒，且与18株非丽沙病毒分离株无交叉反应。另一种基于hnRT-PCR方法中使用的引物（用于检测所有非洲丽沙病毒）的检测方法，通过添加探针转换为实时PCR形式，并被证明能够检测代表该群体多样性的有限队列中的所有成员（Coertse et al., 2010）。事实证明，该检测方法的实时PCR形式在诊断严重腐败组织时，比标准RT-PCR更为灵敏（Markotter et al., 2015）。

一项源自Black等人（2002）研究的简化方案，用于检测和区分基因1型、5型和6型丽沙病毒（RABV、EBLV-1和EBLV-2），采用引物JW12和N165-146产生111 bp的扩增子，并通过三种不同的基因分型探针（每种探针标记有不同的报告染料）进行区分（Wakeley et al., 2005）。在该方法评估的62株丽沙病毒中，除了一株美洲蝙蝠狂犬病病毒仅被微弱检测到（可能是由于该分离株的狂犬病病毒探针与目标序列之间存在3个错配）外，其余所有病毒均被顺利检测并分型。