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狂犬病的实验室诊断(15)

已有 886 次阅读 2026-5-23 02:47 |个人分类:狂犬病防治|系统分类:科普集锦

狂犬病的实验室诊断(15)

前记:

目前国际上关于狂犬病研究最权威最全面的大型学术专著是《狂犬病：科学基础和管控（RABIES: SCIENTIFIC BASIS OF THE DISEASE AND ITS MANAGEMENT）》，简称《狂犬病(RABIES)》。该书最新版（第４版）已于2020年5月面世。

该书共有22章，其中第12章是《Laboratory diagnosis of rabies(狂犬病的实验室诊断）》。现将此章的内容全文翻译成中文供参考。

第12章狂犬病的实验室诊断(15)

(Laboratory diagnosis of rabies)

4 病毒RNA检测的分子生物学方法(续)

(Molecular methods of viral RNA detection)

4.3 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法（续）

(Reverse transcription-polymerase chain reaction methods)

4.3.2 逆转录（Reverse transcription，RT）

RT-PCR的第一个关键步骤是将狂犬病病毒RNA复制为互补DNA(cDNA)链，这通过使用dNTP底物和逆转录酶来完成。该步骤可使用多种不同的商业酶制剂，范围从由逆转录病毒培养物制备的天然酶制剂到具有更高复制保真度和持续合成能力的高度工程化酶变体。对于稳健的诊断方法，尽管成本较高，但后者因其改进的性能而更受青睐。

初始退火步骤包括将引物和RNA混合物进行孵育，首先在短暂的变性温度（65–70°C）下，然后在适合引物与靶标结合的适当温度下进行短时间（5-10分钟）孵育。由于狂犬病病毒的生命周期包括产生其基因组的全长负义和正义拷贝，以及大量的mRNA，因此可以使用靶向正义（信使）或负义（基因组）序列或同时靶向两者的序列特异性引物来启动cDNA合成。或者，有时使用由6-8个碱基的随机序列寡核苷酸混合物组成的随机引物替代序列特异性引物进行退火步骤。它们的优势在于能够沿靶标序列的长度结合到多个位置，因此可以比序列特异性引物产生更广泛的拷贝。这可以提高灵敏度，特别是对于完整性较差的样本。由于随机引物也会启动宿主RNA的cDNA合成，因此会消耗更多的dNTP底物，并且可能需要延长延伸时间以确保病毒模板的cDNA拷贝最大化。所采用的退火温度必须考虑到该步骤所用引物的性质，因为随机引物的解链温度比序列特异性引物低得多。在一步法RT-PCR中，cDNA合成和PCR扩增整个过程中的所有试剂在反应开始时即已包含，因此在该阶段必须同时包含正向和反向引物，从而可用于cDNA启动。

生成cDNA的延伸阶段根据所用酶的最佳要求（范围在35至50°C之间）在固定温度下进行30分钟或更长时间。通常在扩增之前通过加热至70–95°C使酶失活来终止反应。

4.3.3 聚合酶链反应

（Polymerase chain reaction，PCR）

除引物和dNTP底物之外，一个关键组分是用于驱动合成的酶。早期的PCR方法使用耐热酶Taq DNA聚合酶，但现在市面上有多种其他耐热酶可供选择，其中许多经过工程化改造以提高复制保真度和持续合成能力。检测中使用的精确热循环条件将取决于引物的解链温度以及所用DNA聚合酶的特性。其他几个因素也会影响RT-PCR的灵敏度。虽然RT-PCR有可能产生数千碱基的产物，但由于逆转录和PCR阶段的限制，扩增效率会随着长度的增加而降低。因此，靶向丽沙病毒基因组小片段（通常在100至200 bp之间）的PCR对于病毒检测最为灵敏，特别是在检测严重降解的RNA时。进行的扩增循环次数也会显著影响检测灵敏度。在理想反应中，PCR产物的量在每个循环后加倍，因此增加循环次数会使产物产量呈指数增长。通常，采用25-40个PCR热循环。由于尽管使用了相对耐高温的耐热酶，DNA聚合酶的酶活性仍会逐渐丧失，并且反应组分耗尽，因此使用高于此数值的循环数通常不会提高产量。

嵌套式PCR是将第一轮PCR的产物使用针对第一轮引物内部位点的引物进行第二轮扩增，这是另一种用于提高检测灵敏度的方法(Kamolvarin et al., 1993)。半嵌套式PCR(hn PCR)在第二轮PCR中使用其中一个第一轮引物与一个内部引物组合(Heaton et al., 1997; Picard-Meyer et al., 2004)。嵌套式策略极大地提高了检测的灵敏度(Elmgren, Nadin-Davis, Muldoon, & Wandeler, 2002)，许多研究者报告了使用这种方法检测多种丽沙病毒种类(Coertse, Weyer, Nel, & Markotter, 2010; Vázquez-Morón et al., 2006)。然而，其代价是大大增加了假阳性结果的机会，除非采取严格的预防措施来防止样本的携带污染。