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狂犬病的实验室诊断(18)

已有 316 次阅读 2026-5-27 11:13 |个人分类:狂犬病防治|系统分类:科普集锦

狂犬病的实验室诊断(18)

前记:

目前国际上关于狂犬病研究最权威最全面的大型学术专著是《狂犬病：科学基础和管控（RABIES: SCIENTIFIC BASIS OF THE DISEASE AND ITS MANAGEMENT）》，简称《狂犬病(RABIES)》。该书最新版（第４版）已于2020年5月面世。

该书共有22章，其中第12章是《Laboratory diagnosis of rabies(狂犬病的实验室诊断）》。现将此章的内容全文翻译成中文供参考。

第12章狂犬病的实验室诊断(18)

(Laboratory diagnosis of rabies)

4. 病毒RNA检测的分子生物学方法(续)

(Molecular methods of viral RNA detection)

4.4 检测丽莎病毒属病毒的实时RT-PCR方法(续)

（Real-time RT-PCRs for lyssavirus detection）

4.4.1 5’核酸酶检测法（The 5’ nuclease assay）(续)

在美洲，应用TaqMan技术检测北美宿主动物中循环的狂犬病毒的努力，最初凸显了由于病毒遗传多样性而设计此类检测所面临的挑战 (Hughes, Smith, Hanlon, & Rupprecht, 2004)。随后，研究人员探索了三种不同检测方法的实用性，这些方法分别靶向N基因的不同区域，以检测美洲的所有狂犬病毒 (Nadin-Davis et al., 2009)。其中一种检测方法 (RABVD1) 采用了Wakeley等人 (2005) 描述的检测方法的修改版，成功检测了代表全球循环的所有主要狂犬病毒谱系的203个样本；少数样本出现的高CT值是由于通过 β-肌动蛋白内参检测（β-actin internal control assay）测得的 RNA 样本完整性较差所致。该检测方法的一个变体已在纽约州针对常规狂犬病诊断进行了广泛评估，发现其结果与 DFA 测试（DFA test）相当 (Dupuis, Brunt, Appler, Davis, & Rudd, 2015)，并且能够从一小部分最初被DFA测试判定为不适合检测的送检动物中鉴定出狂犬病毒 (Appler et al., 2019)。另一种专门识别浣熊型狂犬病毒变种的 TaqMan 检测方法，可与RABVD1实时 RT-PCR 联合使用（即多重检测），应用于北美该病毒类型流行的区域 (Nadin-Davis, 2019) (图 12.2)。

另一项旨在开发一种能检测所有狂犬病毒的TaqMan检测方法的研究，采用了Wakeley等人 (2005) 描述的方法，以及另一种靶向N基因ORF内稍下游序列的检测方法 (Hoffmann et al., 2010)。虽然这两种检测方法单独均无法检测到研究小组中全部93种病毒，但两者联合使用的成功率达到100%。Faye 等人 (2017) 描述了另一种同时靶向N和L序列的TaqMan检测方法，该方法能稳定检测所有非洲狂犬病毒，但与测试的其他任何丽沙病毒物种均无交叉反应；然而，对该方法的进一步评估确实表明，N 基因检测未能检测出全球其他地区流行的某些狂犬病毒谱系。

图 12.2 TaqMan多重实时RT-PCR 示例，靶向三种不同序列：RABVD1，一种使用FAM标记探针检测的通用狂犬病毒序列；RRV，一种使用 Cy3 标记探针检测的浣熊型狂犬病毒变体特异性序列；β-ACTIN，一种使用 Cy5 标记探针检测的作为内参的持家基因 β-肌动蛋白 mRNA 的序列。使用从感染了浣熊型狂犬病毒变体的样本中提取的总 RNA 进行十倍连续稀释，以生成这些标准曲线。

其他靶向特定丽沙病毒群的TaqMan 检测方法也有报道。其中一种方法使用两个生物型特异性正向引物、一个通用反向引物和两个不同的DLP，来检测并区分ABLV的狐蝠型和食虫蝠型 (Smith, Northill, Harrower, & Smith, 2002)。该方法后来的优化版本对 ABLV 具有特异性，与其他丽沙病毒无交叉反应 (Foord et al., 2006)。有研究报道了用于检测和区分波兰各地样本中狂犬病毒和EBLV-1的检测方法 (Orlowska, Smreczak, Trebas, & Zmudzinski, 2008)，而用于检测和区分欧亚蝙蝠丽沙病毒的检测方法仅应用于实验阶段 (Hughes et al., 2006)。一种靶向N基因开放阅读框 (ORF) 3' 末端附近序列的 TaqMan 检测方法，是基于泰国一项全国性调查中多年积累的狂犬病毒 N 基因序列数据开发的。虽然该方法能检测来自泰国和其他几个亚洲国家的多种现场分离株 (Wacharapluesadee et al., 2008)，但由于探针与靶标序列存在显著错配，它未能检测到攻击病毒标准株（Challenge Virus Standard, CVS）。该研究探讨了试剂与靶标之间序列错配的影响，结果表明 TaqMan 检测方法允许存在多个错配，尽管会对反应效率和灵敏度产生一定影响。

最近，一种名为 LN34 的泛丽沙病毒 TaqMan 实时 RT-PCR (Wadhwa et al., 2017) 采用了简并引物和探针的混合物，已在14个实验室进行了广泛验证，据报道其在检测所有受试丽沙病毒方面都非常有效 (Gigante et al., 2018)。

多项研究报道，TaqMan 检测方法的灵敏度甚至比以前使用的 hnRT-PCR 方法高出100倍 (Foord et al., 2006; Markotter et al., 2015; Nadin-Davis et al., 2009; Orlowska et al., 2008; Smith et al., 2002)。在直接比较实时RT-PCR方法与DFA测试灵敏度的研究中，分子方法与之相当或更优，尤其是对于自溶样本 (Dupuis et al., 2015)。

（未完待续）

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