狂犬病的实验室诊断(4)

前记: 

目前国际上关于狂犬病研究最权威最全面的大型学术专著是《狂犬病：科学基础和管控（RABIES: SCIENTIFIC BASIS OF THE DISEASE AND ITS MANAGEMENT）》，简称《狂犬病(RABIES)》。该书最新版（第４版）已于2020年5月面世。

该书共有22章，其中第12章是《Laboratory diagnosis of rabies(狂犬病的实验室诊断）》。现将此章的内容全文翻译成中文供参考。

第12章 狂犬病的实验室诊断(4)

(Laboratory diagnosis of rabies)​

1. 基于实验室的狂犬病诊断检测（续）

(Laboratory-based rabies diagnostic testing )

1.3. 质量保证(Quality assurance)

有效的检测结果是所有狂犬病诊断、监测和贸易的基础。为确保报告结果的可靠性与可信度，越来越多的狂犬病实验室正在按照国际实验室检测标准(ISO/IEC 17025:2005或2017）进行认证，或正朝着该标准努力。《OIE手册 2018》专门设立了一个完整章节，阐述兽医检测实验室的质量保证（OIE, 2018a）。最终，为确保检测有效性的相互认可，必须由具备资质的人员在良好的样本管理体系下，使用适用的试剂、设施和设备，严格遵守经验证的程序。所采用的检测方法必须经过验证，并适用于所提交的样本及客户要求。

通过质量保证的实验室必须建立质量管理体系。这包括建立可靠的实验室信息管理系统（LIMS），用于记录样本提交数据、检测数据和报告信息，并覆盖从样本接收到报告发出的全流程。除LIMS外，实验室还应具备样本存储位置登记册、所有设备的校准与维护记录、人员培训与能力记录、试剂来源与有效性记录、书面操作规程，以及对体系各方面进行审核的计划。除了质量管理体系，所有检测必须在本地进行验证，以确保设备或试剂的差异不会不当影响检测的灵敏度和特异性。特异性检查尤为重要，因为大多数市售试剂主要仅针对有限数量的狂犬病病毒（RABV）毒株进行测试。实验室必须确保其试剂能够检测本地流行的 RABV 或其他丽沙病毒。在检测各种临床样本时（例如，在人类生前诊断中），实验室必须验证所采用的流程和检测方法对不同样本基质的适用性。试剂和对照材料必须经过适用性测试，并鼓励使用控制图。参考材料的控制图可轻松建立并定期（例如每季度）审查，以确保对照和检测保持高度一致性。批间检测对于确认任何新批次试剂（商业或自制）在使用本地方法和本地毒株时的质量至关重要。用于贸易（宠物流动）的狂犬病血清学检测需要使用控制图（OIE 参考血清、病毒滴定），而大多数通过质量保证的分子检测会定期要求审查检测不确定度数据，以确保对照在储存期间未发生劣化（参见实时 RT-PCR）。

建立方法性能指标还应提供证据，证明流程及相关试剂的准确性、精密度、分析灵敏度和分析特异性足以满足一些国家对人类检测和患者临床决策流程（例如，指导患者护理的动物检测）的监管要求。

OIE 详细描述的检测方法是已在许多实验室证明具有稳健性和高度可重复性的实例。首次在狂犬病实验室建立这些方法前，必须使用本地人员、设备、病毒和试剂确定其灵敏度和特异性。然而，OIE 手册（OIE, 2018b）中包含的狂犬病检测并非强制性规定，可以采用经验证的变体（例如，不同引物、替代检测系统）。获得ISO17025认证的实验室需要提供检测验证和适用性证据。对检测程序的任何修改必须有充分的验证数据和并行测试作为依据，以保持认证资格。但是，虽然所有EU NRL(国家参考实验室) 都持有狂犬病检测的ISO17025认证，但并非所有NRL都具备，并且（有意或无意的）修改可能未被察觉。未经全面验证就引入新试剂也可能不当影响检测的灵敏度或特异性。

自 1994 年以来，美国每年提供狂犬病诊断能力验证计划供自愿参加。在参加该计划的诊断实验室中，对强阳性和阴性样本的表现通常可接受；但在极弱阳性样本上可能出现差异（Powell, 1997）。然而，对于那些在这些挑战性样本上表现可能不佳的实验室，没有强制性的补救培训或评估。如果程序被“实验室修改”——即任何可能影响其灵敏度、特异性、准确性、精密度等性能指标的变更——这些修改可以进行，但目前未受监管，在非认证实验室中也不受监督。可能影响性能指标的实验室修改包括但不限于：（1）样本处理说明的变更；（2）孵育时间或温度；（3）样本或试剂稀释度的变更（每个实验室内部决定）；（4）使用不同的阳性和阴性对照材料（每个实验室内部决定）；（5）使用不同的抗体试剂（即单克隆与多克隆，自制与商业）（每个实验室内部决定）；（6）程序步骤的变更或删除（例如，单个读片员与建议的两个读片员——每个实验室内部决定）；（7）设备变更（缺乏校准或维护）；（8）人员变更（未经适当培训和能力检查维护）。如前所述，引入控制图来监控试剂将有助于发现与检测和操作员表现相关的问题。

自 2009 年起，欧盟参考实验室(European Union Reference Laboratory)希望评估其狂犬病检测能力的实验室组织了一项国际实验室间比对计划（Robardet, Picard-Meyer, Andrieu, Servat, & Cliquet, 2011）。这些比对目前每两年进行一次，包括评估实验室在 DFA 检测、RTCIT、RT-PCR 和实时 RT-PCR 方面能力的样本组。但需注意，除了经典狂犬病病毒，样本组还包括其他丽沙病毒，如澳大利亚蝙蝠丽沙病毒（ABLV）以及欧洲丽沙病毒，如 EBLV-1、EBLV-2 和 BBLV。能力验证结果显示，参与实验室的一致性和标准化水平在不断提高，报告存在差异的实验室相对较少。在 2019 年的实验室间比对中，45 个参与实验室中只有2个记录了总体不一致的结果（来源：EURL ANSES 狂犬病诊断实验室间测试——报告 10-2019）。在连续四轮比对中，常规RT-PCR未观察到不一致结果，而实时RT-PCR的不一致结果往往与受限的特异性（无法检测所有丽沙病毒）有关。尽管该计划可能未针对全球用户进行优化，但参与的实验室可以说明其所用方法能够和不能检测的丽沙病毒种类，因此结果会根据此信息进行解读。

一项针对拉丁美洲和加勒比地区狂犬病实验室的实验室间能力验证测试表明，实验室间采用的检测方法严重缺乏标准化，91%的实验室报告至少一个不一致结果（Clavijo et al., 2017）。相关问卷的回答指出了广泛存在的技术差异和质量保证体系薄弱的问题。此类能力验证计划是制定行动计划的强大工具，旨在提高地区和国家狂犬病诊断报告的可信度，并增强对新发威胁的应对能力。随着新的丽沙病毒不断被发现，以及人类和宠物旅行的大幅增加，参考实验室验证和建立泛丽沙病毒检测工具至关重要。

（未完待续）

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