Zoonoses 最新文章Recombinase Polymerase Amplification for Rapid Detection of Zoonotic Pathogens

重组酶扩增技术在人畜共患病病原体快速检测中的应用

作者： Ruichen Lv, Nianhong Lu, Junhu Wang, Yuexi Li, Yong Qi

体外核酸扩增（NAA），即遗传物质的人工复制，目前已经渗透到了生命科学和生物技术的几乎所有领域，如病原体检测、基因工程、合成生物学、健康监测等各个方面。在过去的几十年中，基于链式扩增反应（PCR）的病原体分子诊断工具的开发和应用显著增加，并被证明具有极高的特异性和敏感性。然而，昂贵的热循环设备、严格的热循环条件和熟练的操作人员等等条件始终阻碍了其在资源匮乏环境中的应用。而等温扩增的出现极大的简化了孵育条件，降低了对扩增设备的需求，缩短了扩增反应时间，为核酸扩增反应突破实验室界限并在现场检测中发挥作用提供了一条新的途径。

自20世纪90年代初以来，基于不同酶机制的等温扩增方法不断涌现，其中较为成熟的包括环介导等温扩增技术（LAMP）、滚环扩增技术（RCA）、依赖核酸序列扩增技术（NASBA)、解旋酶依赖性扩增技术(HDA)、链置换扩增技术(SDA) 和重组酶聚合酶扩增技术(RPA)等。这其中，重组酶聚合酶扩增技术(RPA)因其操作简单、特异性强以及灵敏度高的特点，在极短的时间里就取得了引人注目的发展。

RPA技术最初由英国剑桥ASM科学有限公司的Niall Armes等人于2006年开发。该技术的反应机制参照了T4噬菌体的DNA复制系统，不依赖与热变性和退火，反应系统中的核心为三种酶，即常温下可与单链核酸结合的重组酶（UvsX）、DNA单链结合蛋白 (SSB)和链置换DNA聚合酶。RPA反应起始于重组酶T4 UvsX蛋白在加载因子（T4 UvsY）的协助下与引物形成核蛋白丝。该复合物可以在双链DNA中寻找同源序列并结合侵入，形成D环结构。D环的一侧为引物与模版链杂交形成的双链结构，另一侧为解开的互补链，与SSB蛋白稳定结合。重组酶从核蛋白丝结构上解体后，引物的3'末端暴露出来并被链置换DNA聚合酶识别，进而引发聚合反应。正向和反向引物的结合，使得聚合反应可以同时冲两个方向上发生，并最终完成双链DNA的指数扩增。RPA扩增的反应步骤可在37~42℃条件下作用完成，不需要精准的温度控制，并且可以在20~40分钟内达到检测水平，同时反应试剂可以冻干的形式储存使用，是一种简单、灵敏、快速、高效的检测工具，目前已经广泛的应用于各类人畜共患病病原体的检测，而且还在不断的创新发展。

2022年3月26日，Zoonoses在线发表了华东医学生物技术研究所齐永、李越希研究团队的综述《Recombinase Polymerase Amplification for Rapid Detection of Zoonotic Pathogens》（重组酶扩增技术在人畜共患病病原体快速检测中的应用）。

该综述详细讨论了RPA技术的基本原理以及影响其反应效率的多种因素，阐述了RPA技术的优势和局限性。文章进一步介绍了RPA技术的衍生技术及其原理，并对其在人畜共患病原体检测中的应用进行了一个详尽的回顾，包括RPA耦合侧向流动检测（RPA-LF）、实时荧光RPA、CRISPR/Cas-RPA技术、电化学RPA以及絮凝RPA等。

最后，团队对于RPA在人畜共患病检测中的应用提出了展望。

（1）进一步促进RPA在现场检测的应用，将样品制备与RPA检测相结合，实现快速的“样品到结果”。

（2）微流体和微阵列技术与RPA检测的结合具有良好的前景，可以实现人畜共患病病原体的多重检测和高通量检测。

（3）利用其反应温度与人体体温接近的特点，将可穿戴设备与RPA技术相结合，彻底的改变检测诊断技术的应用场景，使自我诊断成为现实。

作者简介

吕瑞辰，博士，华东医学生物技术研究所助理研究员，现任江苏省医学会微生物与免疫学分会青年委员。主要从事媒介生物控制与虫媒传染病病原体致病机制、检测技术研究，近年来在国内外论文发表论文10余篇，参与发明专利10余项。

齐永，博士，华东医学生物技术研究所副研究员，中国药科大学兼职硕士生导师。现任中国医药生物技术协会基因检测分会委员、生物安全专委会委员，江苏省生化与分子生物学学会理事会理事及青委会委员，江苏省医学会微生物与免疫学分会委员，《Zoonoses》杂志青年编委。入选中国科协青年人才托举工程、中华预防医学会青年人才托举项目等。目前从事虫媒传染病病原体致病机制、检测技术、分子流行病学等研究。近年来发表论文30余篇，获发明专利20余项，获省部级等科技奖一等级4项，二等奖3项。

李越希，博士，华东医学生物技术研究所主任医师，中国药科大学、南京医科大学博士生导师，博士后导师，享受国务院特殊津贴，国家“863"计划疫苗项目总体组专家。江苏省医学领军人才、江苏省重点学科带头人、江苏省创新争先奖章获得者、“江苏省有突出贡献的中青年专家”、“江苏省优秀医学重点人才”。长期从事传染病疫苗、诊断试剂及检测技术研究，承担国家"863"、重大专项、自然基金等项目30多项，获国家医疗器械证书60余项，省部级奖20余项，发明专利30多项，培养研究生30多名。

原文链接：（点击下方阅读原文可直达）

https://www.scienceopen.com/hosted-document?doi=10.15212/ZOONOSES-2022-0002