1.1 显微镜发展的萌芽期

   记得几年前在中科院物理所听报告时，何祚庥院士曾做过一个宇宙之大粒子之小的报告，大与小确是当今科学的两个主流研究方向。生物学的很多问题只有深入到微观层次才能真正得到理解，显微镜的发展见证了人类认识生物学微观世界的历史。2500年前的《墨经》中就记载了能放大物体的凹面镜，然而凸透镜的发明却无从考证。16世纪末期，荷兰眼镜商詹森(Zaccharias Janssen)和他的儿子把两个凸透镜放到一个镜筒中，结果发现这个镜筒能放大物体，这就是显微镜的前身。如果一个凸透镜可以放大10倍，那两个凸透镜组就能放大100倍。1609年现代物理与天文学之父伽利略听说了他们的实验，伽利略从物理学的角度解释了透镜放大的原理，他因此做了一个聚焦更好的显微镜。

   此后，荷兰人列文虎克(Anthony Von Leeuwenhoek)(1632年10月24日-1723年4月26日，列文虎克是一个长寿之人)制造了放大倍数更高的显微镜，让世人大开眼界，他的显微镜放大倍数达300倍。列文虎克当时在一个干货仓库做学徒，在那里他们用放大镜来观察衣服上的线纹从而确定衣物质量。列文虎克发明了一个新的研磨与抛光薄透镜的方法，使透镜有完美的曲线，这样单一透镜的放大数就可以达到270倍。列文虎克用自制的显微镜发现了细菌，酵母，以及野生水滴中的多彩小生物。列文虎克一生发现了很多有趣的生命和非生命现象，并且将他的研究成果写成了100多篇论文递交到了英国与法国皇家科学院。

随后英国显微镜之父罗伯特﹒虎克仿制了一台与列文虎克一样的显微镜，并证实了虎克关于水滴中微小生物体的发现，罗伯特﹒虎克根据自己的设计将列文虎克的显微镜进行了很多改进，但罗伯特﹒虎克因为发现了弹性材料的弹性定律而更为人所知。1655年罗伯特﹒虎克应化学家罗伯特﹒波义耳的邀请到牛津大学进行科学研究，并成为了波义耳的助手。罗伯特﹒虎克1665年创作了《显微镜》一书，首次对细胞(Cell)一词命名。光本质的问题上，罗伯特﹒虎克与当时的科学巨匠牛顿产生了极大的分歧，牛顿认为光是粒子，而主张波动说的罗伯特﹒虎克认为光是波。由于牛顿在科学史上的伟大地位，罗伯特﹒虎克此后受到了打压，但罗伯特﹒虎克敢于挑战科学权威的勇气还是令人敬佩的。

1830年利斯忒(Joseph Jackson Lister，1786-1869)用几个有特定间距的透镜组减小了球面像差，进一步改进了显微镜。显微镜自发明之后一直因为像差问题困扰着当时的应用显微镜工作者，包括一些对显微镜感兴趣的业余爱好者如利斯忒。据传利斯忒是一个天才学生，但他正式的学习生涯在14岁时就结束了，后来他跟随父亲一起做生意。19世纪20年代中期，利斯忒开始研究透镜，他将透镜组合减小像差的成果整理成论文，然而直到1830年他的工作才在威廉﹒塔利的介绍下得到发表。这件事情在当今也许是无法理解的，因为一个顶级杂志可以发表一个高中生创作的论文，然而在那个科学启蒙阶段是可能的。

   1872年德国的天才数学家和物理学家Ernst Abbe对透镜的设   计进行了几个重要的改进，后来Abbe加入了Carl Zeisss成立的Zeiss显微镜工厂。Ernst Abbe生于一个贫苦家庭，他的父亲为养家糊口每天要工作16个小时，Abbe通过拿奖学金和在父亲老板的帮助下完成了学业。Abbe本科时在耶拿大学同时主修了数学和物理两个专业，然后进入哥延根大学获得了热动力学博士学位。1863年拿到了耶拿大学的教授职位，教授物理学。1866年Abbe遇到了Carl Zeiss,开始对光学显微镜产生了兴趣。Carl Zeiss在1846年成立蔡司工厂，于1861年首次设计出复合式显微镜，并在图林根州工业展示会上获一枚金牌，到1866年时Zeiss工厂已卖出1000台显微镜。

1872年Abbe将显微成像的波理论总结为阿贝正弦条件(Abbe Sine Condition): hNsinU = h'N'sinU', 这里h和h'是物体高度，U和U'是入射和出射的角度，N和N'是球形曲面像场介质的折射率。理论上阿贝正弦条件可以大大改善透镜品质，但当时他们没有符合要求的光学玻璃来测试这个学说。1881年Abbe遇到了玻璃化学家Otto Schott，Otto也是耶拿大学的博士，两个校友因对共同的成像问题一拍即合。两人的合作硕果累累，Abbe和Otto先后研制出了几种新的玻璃配方，他们改进了制造玻璃的混合与退火过程，从而可以生产出具有均一折射率的光学级玻璃。

由于色差存在，限制了物镜的放大倍数。1884年, Zeiss, Schott和Abbe三个人开了一个新公司，1886年他们开发出了复消色差透镜(apochromat)从而消除了色差的影响。1888年72岁的Carl Zeiss逝世，在遗嘱中他把股权转给了他的儿子Roderick，Roderick随后又将股权转给了Abbe。蔡司公司的保罗﹒鲁道夫1890年设计了第一个消像差透镜(Anastigmat),开创了蔡司镜头的新纪元。1896年鲁道夫又发明了普兰纳(Planar)双高斯结构镜头，对各种镜头像差都进行了出色的纠正。

此外Abbe还提出了因衍射限制显微镜所能达到的分辩率极限，这也是当今超分辩率显微镜领域亟需突破的理论极限。人们为了纪念他，在Abbe纪念碑的球面上刻下了他的分辩率极限公式(图1)。Abbe分辩率极限理论为后来的显微镜发展提供了理论基础：

                   R=λ/(n﹒sin(α))

这里R是分辩率，α是孔径张角(angular aperture)，λ是波长。n﹒sin(α)是数值孔径, n是折射率。

   图1：Ernst Abbe和他的纪念碑上的分辩率极限理论。

根据Abbe's理论，波长越短分辩率越高，蔡司公司的奥古斯特﹒科勒(August Köhler)1904年造出了第一个紫外显微镜。此外科勒发现如果用较短的紫外光激发某些物质会诱导长波长荧光的发射，奥斯卡﹒黑姆斯泰特(Oskar Heimstadt)1911年根据科勒的发现发明了第一台荧光显微镜。1929年德国药物学家飞利浦﹒埃林杰(Philipp Ellinger)和解剖学家奥古斯特﹒赫特(August Hurt)发明了落射荧光显微镜(epi-fluorescence microscopy)，然而直到1967年荷兰人约翰﹒塞巴斯蒂安﹒富勒姆(Johan Sebastiaan Ploem)发明二色滤光片后，大大降低了背景噪声，落射荧光显微镜才真正得到普及应用。

1.2 显微镜的早期应用

   19世纪由于显微镜的发明，植物解剖研究也得到复活。虎克，马尔比基，雷文雷克等都曾用显微镜观察到植物细胞，但他们对细胞的理解还没有上升到系统学说的程度。1831年一个伦敦医生发现植物细胞具有细胞核，捷克人浦肯野观察到了母鸡卵中胚核，但所有这些都没有得到足够多的认识。这些结果由耶拿大学的植物学家马提阿斯﹒施莱登总结为细胞学说，即细胞是一切植物的基本生命单位。奥多尔﹒施旺于1939年将细胞学说扩展到动物界，即细胞是一切生命的基本活动单位。细胞学说论证了整个生物界在结构上的统一性，以及在演化上的共同起源。这一学说推动了生物学的发展，并为辩证唯物论提供了自然科学的基础。细胞学说被恩克斯称为19世纪的三大发明之一，这里充分说明了显微镜作为研究手段对现代生物学和自然科学研究的推动作用。

染料的发现和广泛应用提高了显微镜的对比度，使原来看不到的生物结构在显微镜下变得清晰可见。细胞或组织结构本身多数是无色的，如果要让他们在显微镜下成色，我们就必须用可以结合到特定细胞结构或分子的染料分子，或者通过与染料结合的中间分子。约瑟夫﹒格拉克(Joseph Von Gerlach)最早在1858年用胭脂红(Carmine)溶液对脑组织染色，格拉克发现不同细胞组份对染料有不同吸收。1873年卡密罗﹒高尔基(Camillo Golgi，他不是苏联文学学家马克西姆﹒高尔基)开创了银染的方法，圣地牙哥﹒拉蒙-卡哈尔(Santiago Ramón y Cajal)用高尔基的染色方法开创了大脑微观结构的研究，卡哈尔精于素描，他的很多作品直到现在还在使用。

然而染料也有很大的局限性，比如对活体标本的毒性，且很难对某些组织特异染色。染料增加了对比度，改变了细胞结构的光吸收特性，但染料产生的对比度逐渐不能满足人们进行深入细致观察的要求。荧光染料的出现极大的提高了对比度，然而荧光显微镜的发展却落后于荧光染料，正如宝剑在手却苦于没有用剑的高手。1871年约翰﹒弗雷德里克﹒威廉﹒阿道夫﹒冯﹒拜尔（Johann Friedrich Wilhelm Adolf von Baeyer）首先分析出吲哚结构并合成荧光素(fluorescein)， 因此获1905年诺贝尔化学奖。1961年阿尔伯特﹒库恩斯(Albert Coons)将荧光素藕联到抗体上，抗体只结合特异性的抗原分子，不仅提高了标记的特异性，又因为荧光染料的应用提高了对比度，开创了免疫荧光显微镜的新纪元。

1962年Shimomura发现了绿色荧光蛋白，绿色荧光蛋白基因1992被Prasher克隆出来。由于绿色荧光蛋白的潜在应用，很多绿色荧光蛋白的突变体就逐渐被创造出来，1995年华裔诺贝尔奖得主钱永健发现了一个荧光更强，光稳定更好的突变体。钱永健是我国著名科学家钱学森的侄子，他的兄弟钱永佑是美国科学院院士，曾任斯坦福大学生理系主任。钱永健的突变体将激发光波长从紫外延展到了488nm的可见光区间，从1994年开始绿色荧光蛋白被广泛用于细胞内蛋白质的定位和表达。

1.3 显微镜在20世纪早期的发展

      1903年奥地利籍匈牙利裔化学家里夏德﹒阿道夫﹒席格蒙迪(Richard Adolf Zsigmondy)发明了超显微镜，超显微镜是基于光散射而非反射，用来观察气体或胶体中的粒子。席格蒙迪命名为超级，因为它可以研究尺度在波长以下的物体，超的意思就是超出了波长的限制，而不是超级的意思，并于1925年获得了诺贝尔化学奖。席格蒙迪1897年加入了由Abbe与肖特(Schott Glaswerke AG)成立的肖特玻璃制造厂，在该厂工作期间，席格蒙迪对茶色玻璃进来了研究，还发明了一种玻璃，命名为“Jenaer Milchglas”。1890年席格蒙迪辞职，与蔡司合作研制了狭缝超显微镜，席格蒙迪可以测出玻璃中4纳米的颗粒。1907年他进入格丁根大学，成为有机化学教授，直至1929年2月退休，席格蒙迪一生的主要成就在于确立了现代胶体化学的基础。

1932年弗里茨﹒塞尔尼克(Frits Zernike)发明了相位差显微镜来研究无色和透明的生物样品，这样细胞不再需要染色，塞尔尼克因此获得了1953年诺贝尔物理学奖。然而在相位差显微镜刚被发明时并没有得到足够多的重视，塞尔尼克与蔡司公司讨论过合作的可能性，但蔡司当时不敢兴趣。直到二次世界大战时塞尔尼克被纳粹党逮捕，媒体的报道将塞尔尼克再次推倒前台，相位差显微镜才得到重视。塞尔尼克的侄子Gerardus't Hooft也是著名的物理学家，Hooft解释了电弱相互作用的量子结构而获得1999年诺贝尔物理奖。

极化/偏振显微镜(polarization microscopy)也是一种非标记技术，由德国物理学家马克﹒贝雷克(Mark Berek)在二次世界大战前发明，具体年月不详。虽然当时人们已经开始使用荧光显微镜，但因为荧光显微镜的样品需要固定染色，所以荧光显微镜观察到的亚细胞结构存在很大争议，很多人认为那是染料造成的假象，非标记显微镜观察到的结构更容易获得认可。W.J.Schmid在1937年观察到了纺锤体的纤维状结构，但图像有些模糊不清。1953年Shinya Inoué用自制的改进型偏振显微镜证实了Schmid的发现，通过与荧光显微镜的结果比较，二者结果相似，这也在一定程度上推动了荧光显微镜的发展。

20世纪50年乔治﹒诺马尔斯基(Georges Nomarski)发明了微分干涉相衬显微镜(differential interference contrast)，微分干涉相衬显微镜可以用来研究非染色的活生物样品。微分干涉相衬显微镜要求透明样品的折射率与样品所处的介质环境相同，而且不能研究厚的或者有色素的样品，但微分干涉相衬显微镜的分辩率在合适的条件下可以比相位差显微镜更高。Allen1981年将摄像机(video camera)技术与微分干涉相衬显微镜整合成视频增强对比微分干涉相衬显微镜(Video-enhanced Contrast, Differential Interference Contrast (AVEC-DIC) microscopy)，当然摄像机也可以与偏振显微镜整合成视频增强对比偏振显微镜(Video-enhanced Contrast Polarization Microscopy)。

1940年西奥多﹒弗斯特(Theodor Föster)发现了荧光共振能量转移现象(fluorescence resonance envergy transfer, FRET)，弗斯特证实电子激发能量能够从荧光供体(donor fluorescence)转到荧光受体(acceptor chromophore),转移的效率与分子距离的六次方的倒数相关。FRET显微镜可以用来研究蛋白在体内的相互作用，1996年韩国学者Taekjip Ha首次实现了单分子FRET，目前单分子FRET可以在体外实时研究分子相互作用和分子动态变化。

1.4 电子显微镜的发展

电子显微镜虽然与本书的主题相去甚远，但电子显微镜的发展却是建立在光学显微镜的基础上，在现代科学发展的历史中，两个看似无关的学科互相融合往往产生意想不到的结构。受Abbe's分辩率极限理论限制，光在通过显微镜时要发生衍射，因此一个点在成像时就会变成一个放大的衍射光斑。如果两个衍射光斑靠得太近，即使分辩率再高，我们也无法分辩。可见光的分辩率极限是0.2微米，小于0.2微米的结构在普通光学显微镜下是无法识别的。提高显微镜分辨率的途径之一是设法减小光的波长，或者用电子束来代替光。根据德布罗意的物质波理论，运动的电子具有波动性，而且速度越快，“波长”就越短。如果能把电子的速度加到足够高，用磁场聚焦电子束，就有可能用电子束来放大物体。

1931年，德国的克诺尔和鲁斯卡，用冷阴极放电电子源和三个电子透镜改装了一台高压示波器，获得了放大十几倍的图象，证实了电子显微镜放大成像的可能性。1932年，经过鲁斯卡的改进，电子显微镜的分辨能力达到了50纳米，大概是当时光学显微镜分辨率的十倍，于是电子显微镜开始受到人们的重视。二十世纪40年代，美国人希尔用消像散器克服了电子透镜旋转不对称性的负面影响，使电子显微镜的分辨本领有了新的突破，逐步达到了现代电子显微镜的水平。电子显微镜发展初期正是新中国建设百废待兴的年代，我们国家的科研工作者高瞻远瞩紧跟世界科研潮流，在1958年成功研制出透射式电子显微镜，分辨本领为3纳米，1979年又制成分辨本领为0.3纳米的大型透射电子显微镜。由于分辨率太低而且电子束对样品损伤严重，此时的电子显微镜并不适合去观测单个分子。随着上世纪80年代扫描隧道显微镜和原子力显微镜的问世2,3，在表面上检测单个原子或分子终于成为可能。

1952年，英国工程师Charles Oatley制造出了第一台扫描电子显微镜(SEM)，电子显微镜被认为是20世纪最重要的发明之一。很多在可见光下看不见的物体——例如病毒——在电子显微镜下都现出了原形。用电子代替光，这或许是一个反常规的主意，但是还有更令人吃惊的发明。1983年，IBM公司苏黎世实验室的两位科学家Gerd Binnig和Heinrich Rohrer发明了扫描隧道显微镜(STM)。这种显微镜比电子显微镜更加激进，它完全失去了传统显微镜的概念。扫描隧道显微镜的工作原理是“隧道效应”。隧道扫描显微镜没有镜头，它使用一根探针。探针和物体之间加上电压，如果探针距离物体表面很近—大约在纳米级的距离上—隧道效应就会起作用。电子会穿过物体与探针之间的空隙，形成一股微弱的电流。如果探针与物体的距离发生变化，这股电流也会相应的改变。这样，通过测量电流我们就能知道物体表面的形状，分辨率可以达到单个原子的级别。因为这项奇妙的发明，Binnig和Rohrer获得了1986年诺贝尔物理学奖，电子显微镜的发明者Ruska在同一年与他们共享了诺贝尔物理学奖。

电子显微镜在细胞生物学中的应用奠定了现代细胞生物学的基础，很多细胞的超微结构都是在电子显微镜的帮助下实现的。20世纪后半段是电子显微镜发展的黄金期，比如罗马尼亚出生的美国细胞生物学家乔治﹒埃米尔﹒帕拉德(George Emil Palade)借助电子显微镜的帮助在1995年发现了核糖体，核糖体是细胞内蛋白质翻译的工厂，核糖体的发现对我们认识细胞功能迈出了重大的一步，因此帕拉德于1974年被授予诺贝尔医学奖。工欲善其事必先利其器，帕拉德的贡献就是拜电子显微镜所赐。

虽然电子显微镜的分辨本领早已远胜光学显微镜，但因为电子显微镜要在真空条件下工作，所以很难观察活生物，而且电子束照射会使生物样品受到辐照损伤。由于电子显微镜的明显劣势，即使电子显微镜分辩率更高，但它仍然不能替代光学显微镜，光学显微镜的发展仍然在默默进行着。时到今日，显微镜的种类与用途已包罗万象，新显微镜层出不穷，这已经远非本章可以概括，但笔者在此抛砖引玉，希望有志于显微镜研究的年轻才俊能够经过本书的点播，打开显微镜研究领域广阔的大门，在这个其乐无穷的世界里遨游探索。