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蛋白质纯化

已有 4409 次阅读 2013-6-15 12:09 |个人分类:评论|系统分类:科研笔记| 蛋白质

蛋白可以根据溶解度,尺寸大小,性特点和特使的合度的不同而化。所以如果你有一个要研究的新蛋白,首先通过DNA测序知道他的氨基酸序列,将序列输入到expasy在线扎炸眨服务器中选择Protpara (protein paramter),系统会自动回复该蛋白的所有物理化学参数,如质量,有多少个正电荷的氨基酸,多少个负电荷的氨基酸,pI是多少,根据这些参数我们才能设计离子交换色谱是用阴离子交换还是阳离子交换,通过调解buffer的pH值,我们也可以认为的改变分子的代电性质。如果这些初步的分析,我们才可以开始蛋白质的纯化。当然另一类方法是通过基因工程的方法的基因上加一个小的tag,这个小tag可以结合到什么东西上帮助纯化,但这些小tag往往需要切掉,虽然我们argue他们不会影响蛋白质功能,但谁能说得准呢。有些蛋白不用tag很难纯化,这是我们也必须走这个弯路。


      绝大多数蛋白需要一定的盐浓度才能溶解,而同在高盐浓度下又会沉淀下来,个效叫做程。析是因为盐离子和蛋白分子水的争而保持蛋白溶于溶液中。不同蛋白沉淀所需要的盐浓度是不同的,因此可以通过盐程来行初步分离, 常用的有硫酸胺等。

      凝胶过滤法,又称尺寸排阻色法,可以根据蛋白尺寸大小行分离。品注射到由不溶聚合物的多空珠子成的分离柱上,分子量小的可以些柱子而分子量大的不能。因此,分子量大的将通过较短的途径到达柱子的底端而先流出来,分子量小的要通过长的,迂回的途径,将在后面流出来。通常跑个柱子需要很长时间,~12小

      离子交柱根据蛋白性特征行分离。如果蛋白质带荷,可以它和带负电酸基的珠子合。然,带负电荷的蛋白质则不能和分离柱合。通增加冲液的盐浓度与柱子合的荷的蛋白就被施放出来了。因为盐中的正离子可以和蛋白中的荷基团竞争与柱子的合。同道理,带负电荷的蛋白可以用荷的离子交行分离,同增加冲液的盐浓度,可以洗脱出先前合到柱子上的蛋白来。

       镍亲合分离柱是一个有利的化蛋白的方法。我先通分子生物学学的方法,在目蛋白的末段增加多个氨酸残基(通常是六个)。这样的目蛋白镍亲合分离柱有很高的特异性合能力,而其它蛋白质则没有或者只有一些弱的非特异性合。些非目蛋白很容易被洗脱下来。而目蛋白可以通度的咪溶液洗脱下来。

      为得高度的蛋白质样品,我一般情况下用以上方法中的两种或更多种。很少的情况下,我只用其中一种就可以得高度的蛋白质样品,但通常我没有么幸运。

分离的效果如何?我可以通跑凝胶泳的方法来检测

一个带电分子在电场中会移象叫做泳。蛋白的距离和速度取决于电场强度,蛋白净电荷(随泳液的PH化),和蛋白的形状。泳分离通常是在胶(如聚丙烯酰胺)中行的,因胶可以作分子而提高分离效率。蛋白通常可以在十二基硫酸SDS)的溶液中,通分子量的大小在泳中被分离。负电荷的SDS可以使的蛋白质变性,而且SDS性的蛋白以固定的比例合,即一个SDS分子与蛋白中的两个氨基酸合。如此多的SDS分子与蛋白质结合,弱化了蛋白本身的性,使得所有的蛋白分子得同荷/量比例,所以在种情况下,蛋白的区只在它的分子量的大小。试剂基乙醇加到泳液中,原二硫,使得蛋白分子完全线性化。我SDS-蛋白复合物束后,胶上蛋白可以通染色的方法而显现出来,我可以看到一些斑,小分子的蛋白分子在胶的底端,而大分子的蛋白分子留在胶的上端。通过观察胶上斑弱,一个有经验的研究者大致就知道了化的效率和率。当然,我仍然要运用光法甚至是质谱法来确定蛋白质纯化的效率和率。




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