我国低效甾体C11b-羟基化发酵工艺改革难点在哪里？

 

          杨顺楷      四川  成都

 

 

美国先令公司合成化学家对糖皮质甾体激素合成工艺中C11b-羟基化发酵（2001）如是说：“Although 11b hydroxylation by fermentation has been documented in the literature, it has turned out to be fruitless to attempt introduction of C11b-OH on the corresponding C-11 deoxy substrate through biotransformation.”（译文：虽然众多文献报道了C11b-羟基化发酵，但是试图在相应的C11-脱氧底物经由生物转化引入11b-羟基，其结果表明仍然是令人沮丧的。）看来他们对生物催化甾体C11b-羟基化发酵持悲观论。

 

甾体羟基化反应，特别是C11b-羟基化在甾体工业生物技术中是最有意义的工艺过程。因为它涉及制造有效抗过敏抗炎甾体治疗剂。为了向孕甾烷系列引进C11b-羟基，优先采用半知菌纲的真菌新月弯孢霉（Curvularia lunata）进行研究。伴随着C11b-羟基化的主流生物转化，该菌菌丝体同时还有副反应发生，生成C11a-和C14a-羟基化产物，其强度取决于所采用选择的菌株，甾体底物的结构和转化反应的条件。迄今为止积累的研究资料，尚不足以实现较理想的生物羟基化反应，即对此问题尚不能得出一个包括新月弯孢霉在内，真菌羟基化究竟是怎样的生理作用过程的确切答案。

 

细菌甾体生物转化的9a-和26-羟基化反应（以及推断的C14a-羟基化）是解构甾体为CO2和H2O的中间阶段，且尚未发现直接依赖生长条件和转化之间的相关性。借助真菌实现羟基化涉及的反应速度和方向，以及立体取向都依赖于微生物的种属特异性，转化底物类型，以及一系列物理化学因素。新月弯孢霉的C11b-羟基化起作用的影响因素有转化温度，溶解氧浓度，pH和培养基组成。

 

现在已经广泛了解作为丝孢真菌的新月弯孢霉（Curvularia lunata）或者它的有性型世代（Cochliobolus lunatus）能够向孕烷甾体化合物C11b-位引入羟基，已知成为最有效的生物催化剂菌种之一，且活性菌丝生物转化底物RS和RSA C11b-羟化酶比活性分别为21um/g.h和7.1um/g.h。显然选择RS作为转化底物进行C11b-羟化反应速度比之RSA快得多。

 

近年，俄罗斯学者开展了对新月弯孢霉菌丝体羟基化甾体活性的研究，指出其对数生长期的菌丝体在磷酸缓冲液的微结晶悬浮介质体系中呈现对RS有最大的11-羟化活性；而在真菌生长的较晚时期收获的菌丝体转化甾体就呈现14-羟基化酶活性，这就必然产生14-OH-AD；伴随着RS的主流转化，还研究了各种工艺操作条件对转化的影响，内容包括底物添加到反应混合物中的不同方式，菌丝浓度及菌龄，真菌纯系物作为生物催化剂对重金属盐赖受程度（0.35-0.5%），以除去14-OH副反应的影响。

 

近年，我们实验室在开展针对我国传统基本糖皮质激素之一——氢化可的松生产线的瓶颈工段霉菌氧化进行技术改造研发，拟采用新月弯孢霉（Curvularia lunata）AS 3.4381替代1963年选出投产至今还在使用的蓝色犁头霉菌种（Absidia coerulea）AS 3.65。实验室研发已经达到的技术水平是：采用新菌种新月弯孢霉生长培养好的活性菌丝，在磷酸缓冲液介质体系中顺次连续两批次生物转化RS制氢化可的松重量收率已达到国际先进水平（55-60%）（见下表制备实验结果）；此外，尚有可达20%的该小型丝孢真菌新月弯孢霉含有副产物14ɑ-羟基-RS甾体产物可资利用。，

 

 

批次	日期	发酵罐型及转化方式	HC收率 （％）	备    注
1	2003.5	2L玻璃罐，菌丝缓冲液转化RSA	44.7	蓝色犁头霉 AS3.65
				2L玻璃罐，菌丝缓冲液转化RS	61.9	新月弯孢霉 AS 3.4381
2	2005.3	2L玻璃罐，菌丝缓冲液双轮序列转化RS	57.6	新月弯孢霉
3	2005.6	2L玻璃罐，菌丝缓冲液，批式转化RS-b-CD	57.8	新月弯孢霉
4	2006.4	10L玻璃罐，菌丝缓冲液，批式转化RS	51.8	新月弯孢霉
5	2006.4	10L玻璃罐，菌丝缓冲液，批式转化RS	56.4	新月弯孢霉
6	2006.5	10L玻璃罐，菌丝缓冲液双轮序列转化RS	58.8	新月弯孢霉
7	2009.12	5L玻璃自控罐，菌丝缓冲液批式转化RS	61.0	新月弯孢霉
统计分析			均值＝57.9％    SD＝3.30    n=7

由此可见，我国氢化可的松生产高效甾体C11beta-羟基化新月弯孢霉活性菌丝发酵新工艺改革的难点在于企业缺乏技改的创新精神，固守传统的“一步转化”法。这在我国氢化可的松生产近100t/a产出的情况下，实在是对宝贵薯蓣皂素资源的低效利用；加之，伴随着植物甾醇发酵降解工业生产4AD的成功，由4AD化学法生产RS（A），再到氢化可的松生产也指日可待。因此，企业同科研院所的紧密合作实属必要，实现 我国氢化可的松生产高效新月弯孢霉甾体C11beta-羟基化发酵新工艺改革指日可待的，不能再久拖不决了。

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