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氢气是一种新型辐射防护剂【十章】

已有 1024 次阅读 2024-3-4 09:49 |个人分类:氢气效应基础|系统分类:科研笔记

氢气是一种新型辐射防护剂【十章】

辐射损伤被定义为离子辐射的暴露，导致在特定时间内一系列器官受到伤害。在这项研究中，我们调查了单次10 Gy剂量的纵隔辐射对Wistar雄性大鼠的影响，以及随后9天使用选定抗氧化剂（氢分子—氢气、维生素E、海带）治疗的效果。血桨生物标志物被分析以确定辐射对肾脏（肌酐、尿酸）、肝脏（丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶）、新陈代谢（总胆固醇、甘油三酯、葡萄糖）和细胞毒性（乳酸脱氢酶）的影响程度。大鼠血桨中标记物水平的增加表明，纵隔辐射后9天机体的整体状况恶化。使用选定化合物治疗后，血桨中选定参数的水平降低，这表明它们具有保护作用。我们的研究结果表明，在所选的抗氧化剂中，氢气在观察期间似乎是最有效的辐射防护剂。我们假设氢气可能代表一种新型的、临床上可用的抗辐射诱导毒性剂。

辐射伤害被定义为离子辐射的暴露，在特定时间内引发一系列器官伤害。器官伤害的严重程度取决于辐射剂量和辐射暴露的持续时间。急性辐射综合症通常包括DNA双链断裂、造血系统综合症、皮肤损伤、脑溢血和脾脏肿大，这些症状一般在辐射暴露后30天内出现[1]。纵隔区域的放射治疗有效治疗多种恶性肿瘤，如霍奇金淋巴瘤、肺癌或乳腺癌。众所周知，放射治疗会诱导血管内皮损伤，促进炎症，并加速动脉粥样硬化。此外，增加使用纵隔放射治疗来治疗各种胸部恶性肿瘤与多种心血管疾病的发生有关，这些疾病可能在放射治疗后多年发展[2]。与直接辐射暴露相关的健康风险已被广泛研究，然而，辐射风险的间接和延迟效应仍在考虑之中，需要更多的证据以获得全面了解。辐射具有广泛的生物学效应，这些效应不仅局限于其直接暴露，还包括许多间接和延迟效应[3, 4]。据文献记录，辐射处理的细胞条件培养基暴露主要减少细胞存活并增加凋亡[5]。相反，低剂量辐射暴露（小于0.5 Gy）可能导致先天免疫系统受抑，同时为适应性免疫细胞建立促炎环境。在外围器官和大脑中，低剂量辐射通常诱导DNA损伤和氧化应激，导致全身异常[6]。

辐射诱导的“旁观者效应”被定义为在细胞核未被直接照射的细胞中，辐射后表达的生物学效应。这些效应包括DNA损伤、染色体不稳定、突变和凋亡。有相当多的证据表明，电离辐射影响位于照射部位附近的细胞，这些细胞作为整体生物组织网络的一部分，单独和集体地做出响应。旁观者细胞中氧化代谢的上调表明，这些细胞中的生物学效应可能是氧化应激的后果。除了放疗诱导的活性氧和氮物种直接对细胞造成损伤外，辐射过的细胞还可能通过细胞信号分子诱导远处非辐射细胞的变化[7]。最初的研究证明，从辐射培养物中取出的细胞培养基可以转移到非辐射培养物中并诱导DNA损伤[7]。除了旁观者效应外，远隔效应是另一种现象，即在一个不同的解剖部位进行辐射时，会在全身诱导系统性反应[8, 9]。放疗引起的系统性氧化应激与正常组织的细胞毒性和致癌过程密切相关，抗氧化剂的自由基清除特性可以对抗这些过程[10]。作为对人类潜在健康风险的关注，电离辐射受到了广泛关注，抗辐射药物的研究变得越来越重要[11]。文献记录显示，多种抗氧化剂（N-乙酰-L-半胱氨酸、硫拉芬和白藜芦醇）可以消除过量的ROS水平，并可能减轻辐射诱导的旁观者效应造成的损伤[12]。

氢分子（H2）已被提出作为一种新型的辐射防护剂[13, 14]。氢气是一种有效的抗氧化剂，能快速穿过细胞膜，减少ROS如⋅OH和ONOO−，并抑制由氧化应激引起的各种器官损伤。此外，分子氢的有益效果可能是通过激活Nrf2途径实现的，该途径促进先天抗氧化剂的产生并减少凋亡以及炎症[15]。氢气对辐射诱导的心脏损伤的保护作用可能通过调节miRNA-1、-15b和-21来介导[16]。在小鼠中，对急性和慢性辐射诱导的肺损伤的氢气治疗，无论是吸入氢气气体（对急性损伤）还是饮用富含氢气的水（对慢性），都已显示出在培养的肺上皮细胞中的抗炎和抗凋亡效果[17]。维生素E是一种众所周知的抗氧化剂，能有效清除辐射暴露产生的自由基。长期以来，维生素E类似物（统称为生育酚）一直是作为放射防护剂在放疗患者中以及可能的辐射事故或恐怖主义情景中进行积极研究的[18]。维生素E对抗辐射的有害影响具有保护作用，毒性和副作用较小。因此，我们建议实施抗氧化保护剂作为预防措施，以便将来可以提高放射肿瘤治疗的治疗指数[19]。使用天然形式的维生素或补充剂可能有助于减少辐射对身体、器官和/或细胞的影响。十三种维生素中只有四种（A、C、D和E）被发现具有辐射防护特性，主要是维生素E，其次是维生素C、A和D[18, 20]。同样，各种藻类也展示了多种药理特性和生物功能，包括抗氧化和辐射防护效果[11, 21]。包括海带在内的藻类含有诸如褐藻糖胶、褐藻黄素或生物活性多糖等物质，这些物质已被证明具有抗氧化和防辐射特性[22, 23]。此外，褐藻糖胶已被证明可以在体外和体内保护免受辐射诱导的损伤[22]。

本研究的目的是找出纵隔照射对选定生化参数的破坏效应，作为辐射后9天大鼠健康状况的指标，并探讨使用不同抗氧化剂改善的可能性。

材料方法

实验动物

本研究中所有动物实验均符合斯洛伐克科学院心脏研究所伦理委员会的规定，实验方案已获得斯洛伐克共和国国家兽医与食品管理局的批准。动物的处理遵循《实验室动物的护理和使用指南》（第8版，国家学术出版社）。成年雄性Wistar大鼠（12周大，200-220克）由捷克共和国Velaz有限公司，Lysolaje提供。动物在标准环境条件下饲养和繁殖（12小时光照/黑暗周期，环境温度22-24°C，湿度45-65%）。在整个实验期间，食物和水都可以随意获取，并且每天监测其消耗量。实验结束时，通过过量麻醉剂（硫喷妥钠，60 mg/kg）和心脏摘除术使大鼠安乐死。所有收集的样本都存储在-80°C下直到分析。

实验模型

实验动物的辐射在斯洛伐克共和国布拉迪斯拉发Bory医院的放射科进行。对大鼠纵隔区域（宽19毫米）单次照射10 Gy剂量的辐射（4-5 Gy/min），使用脉冲式线性电子加速器Electra Harmony Pro，在腹腔内给予麻醉剂后进行（Zoletil 20 mg/kg, Domitor 0.4 mg/kg）。

动物分组

在这项研究中，大鼠被随机分为5组：非照射组：对照组大鼠（C），照射未治疗的大鼠（I），用氢气治疗的照射大鼠（IH，吸入室中4% 氢气，每天3次×30分钟），用海带（Laminaria digitata）处理的照射大鼠（IL，Thorverk—Island提供的Laminaria digitata粉末，以3%的浓度掺入饲料中随意摄取），以及用维生素E治疗的照射大鼠（IE，从Jamieson获得，剂量为100 mg/kg体重，每天一次）（各组也以相同的频率接受仅载体）。照射后，大鼠每天接受治疗9天，此时实验终止（图10.1）。这个时间代表亚慢性阶段，与适应机制相关的时期。

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图10.1动物模型分组示意图。雄性Wistar大鼠被分为5组（每组n=8）：非照射组：对照组（C），照射（10 Gy，纵隔）未治疗组（I），照射并用氢气管理治疗组（IH，吸入室内4% 氢气，每天3次×30分钟），照射并用Laminaria digitata管理治疗组（IL，Laminaria digitata粉末，以3%的浓度掺入饲料中随意摄取），照射并用维生素E治疗组（IE，每天100 mg/kg体重）

材料

血浆样本通过使用DRI-CHEM（FUJIFILM）干化学分析仪进行分析，该仪器可以执行临床化学的多个测试参数。我们使用了以下FUJI DRI-CHEM试剂条：葡萄糖（GLU—F15809528），肌酐（CRE—F15809475），乳酸脱氢酶（LDH—F15809607），总胆固醇（TCHO—F15809669），甘油三酯（TG—F15809671），尿酸（UA—F15809700），天门冬氨酸氨基转移酶（AST—F15809542），丙氨酸氨基转移酶（ALT—F15809554）。数据以均值±标准误差表示，各组间差异的统计学意义通过学生T检验分析。当p < 0.05时，差异被认为具有显著性。

研究结果

肝细胞损伤标志

在辐照后的9天内，与对照组相比，血浆中的ALT（丙氨酸氨基转移酶）和AST（天门冬氨酸氨基转移酶）水平升高。用氢气、海带和维生素E治疗辐照大鼠，这些参数降低至接近对照组水平（见图10.2）。

图10.2 纵隔辐照（10 Gy）以及持续9天用氢气、维生素E和海带治疗对肝功能指标的影响，包括血浆丙氨酸氨基转移酶（左）和天门冬氨酸氨基转移酶（右）。实验组：未辐照的对照组（C），辐照未治疗组（I），辐照并用氢气治疗组（IH），辐照并用海带治疗组（IL），辐照并用维生素E治疗组（IE）。结果以均值±标准误差表示。p值小于0.05认为具有显著性。

肾脏损伤标志物

与对照组相比，辐照未治疗组的CRE（肌酐）和UA（尿酸）水平有不显著的升高，而氢气在这些参数上的降低作用最为明显，相较于海带或维生素E（见图10.3）。

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图10.3 纵隔辐照（10 Gy）以及持续9天用氢气、维生素E和海带治疗对肾功能指标的影响，包括血浆尿酸（左）、肌酐（右）。实验组：未辐照的对照组（C），辐照未治疗组（I），辐照并用氢气治疗组（IH），辐照并用海带治疗组（IL），辐照并用维生素E治疗组（IE）。结果以均值±标准误差表示。p值小于0.05认为具有显著性。

代谢标志物

在纵隔辐照后的9天，TG（甘油三酯）和TCHO（总胆固醇）水平没有显著变化。然而，三种抗氧化剂的给药都降低了这些参数的水平，其中氢气的效果最为显著。在这些实验条件下，无论是辐照还是治疗都没有显著改变血糖水平（见图10.4）。

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图10.4 纵隔辐照（10 Gy）以及持续9天用氢气、维生素E和海带治疗对代谢指标的影响，包括血浆甘油三酯水平（A）、总胆固醇（B）和葡萄糖（C）。实验组：未辐照的对照组（C），辐照未治疗组（I），辐照并用氢气治疗组（IH），辐照并用海带治疗组（IL），辐照并用维生素E治疗组（IE）。结果以均值±标准误差表示。p值小于0.05认为具有显著性。

细胞毒性标志物

辐照后9天，乳酸脱氢酶活性显著增加。抗氧化剂的给药使其活性趋向于对照组水平，特别是氢气和维生素E（见图10.5）。

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图10.5 纵隔辐照（10 Gy）以及持续9天用氢气、维生素E和海带治疗对细胞毒性标志物乳酸脱氢酶的影响。实验组：未辐照的对照组（C），辐照未治疗组（I），辐照并用氢气治疗组（IH），辐照并用海带治疗组（IL），辐照并用维生素E治疗组（IE）。结果以均值±标准误差表示。p值小于0.05认为具有显著性。

讨论

电离辐射在医学领域如放射治疗、放射学和核医学中长期以来有着广泛的应用。辐射穿过生物组织时，会产生活性自由基，这些自由基与DNA和蛋白质等关键大分子相互作用，可能导致细胞损伤并引发细胞功能障碍和死亡。电离辐射有许多副作用，保护有机体免受辐射诱导的毒性非常重要[24]。纵隔放射治疗通常用于治疗各种恶性肿瘤，可能会对纵隔结构造成放射损伤，最重要的是心血管系统，这可能导致放射引起的心脏病[25]。据文献记载，大鼠局部心脏放射治疗会引起线粒体形态和功能的长期改变，这种改变在辐射暴露后数月内持续存在[26,27,28,29]。尽管辐射诱导的分子机制对于未直接受到辐射的器官的影响，即所谓的“远隔效应”，仍不清楚，但长期的证据表明，辐射诱导的炎症细胞因子是一种重要的信号因子。一般来说，细胞因子的激活与辐射的急性和延迟性远离效应有关，并伴随着巨噬细胞活化的增加以及随后维持在高水平的“细胞因子风暴”，直到放射治疗后16周[30]。炎症因子可能触发氧化应激，导致ROS和NO的增加[31, 32]。

放射防护剂已被证明具有两种主要功能：自由基清除和免疫刺激[22]。放射防护剂是用于保护暴露于辐射的生物系统的物质，无论是自然辐射还是辐射泄漏，它们可以保护癌症患者接受放射治疗时的正常细胞免受辐射损伤[33]。在这些具有保护作用的化合物中，抗氧化剂可以防止自由基引发的连锁反应的传播[34]。在这方面，许多天然抗氧化剂表现出长期保护作用，包括放射治疗后对致死性和突变性的保护[34]。为了最小化辐射诱导的毒性并提高患者生存率，有必要了解辐射诱导的器官疾病的机制，并开发新的治疗剂[35]。大多数现有的实验研究都是针对全身放射或仅检查直接受辐射的器官，只有少数研究涉及远离效应。在我们的研究中，我们监测了单次剂量为10 Gy的纵隔放射对选定血浆参数的影响，作为整体状况/状态的指标。此外，我们还证明了氢气、维生素E和海带（Laminaria digitata）等选定抗氧化剂对辐射诱导的毒性具有保护作用。我们的结果指向了纵隔放射对肝脏和肾脏的远离效应，这一点通过血浆分析结果得到了证实。肝细胞健康生物标志物ALT和AST在辐射后9天升高，表明肝脏受损。同样，在另一项研究中，腹部放射治疗后3天，ALT、AST和ALP水平也升高[36]。在放射后的急性期，肝脏似乎对ROS的产生更敏感，因为另一项研究表明，在对雄性WAG/RijCmcr大鼠进行10 Gy全身放射治疗后120天，肝脏并未受到影响[37]。此外，在10 Gy全身放射治疗的研究中，血清ALT活性在放射治疗后100-120天降低了21%，而AST活性在放射治疗后40-60天降低了15%[38]。

抗氧化剂的治疗可能对抗辐射有保护作用，这一点已有文献记录。腹腔注射维生素E（30mg）可逆转大鼠在1000-cGy放射治疗后3天的ALT、AST和ALP升高[36]。肝脏负责胆固醇和甘油三酯的合成，它们的水平升高是心脏病的风险因素。胆固醇和甘油三酯可以从饮食中获得，也可以从头合成。然而，在我们的实验中，放射治疗后9天，胆固醇和甘油三酯的水平并没有显著变化。这些结果与之前的研究一致，即全身或部分身体放射治疗后40天内，血浆总胆固醇和甘油三酯没有变化[37]。有趣的是，接受氢气、维生素E和海带治疗的辐射大鼠，这些参数的水平降低了，甘油三酯比总胆固醇降低得更明显。尽管没有关于10 Gy纵隔放射治疗和这些化合物治疗9天的研究，但氢气[39,40,41]、维生素E[42]和海带[43]对降低血脂谱的效果已得到证实。由于大鼠饮食中的胆固醇和甘油三酯水平是恒定的，因此在放射治疗和治疗后血液中这些参数浓度的降低可能是由于它们从肠道吸收减少、合成减少或胆固醇和甘油三酯从循环中清除增加所致。使用这些物质似乎是心脏保护性的，然而，放射治疗后的心脏毒性包括心肌缺血以及高血压、血管事件、瓣膜病、心肌病、心肌炎、心包疾病和心律失常[44]。此外，我们的结果没有显示放射治疗后血糖水平的显著变化，或者在使用选定化合物治疗后的变化。同样，过氧化物酶-葡萄糖氧化酶测试在低功率激光照射唾液腺区域一天后并未检测到对照辐射大鼠血液中葡萄糖浓度的任何变化，然而，与对照组相比，糖尿病大鼠的葡萄糖水平显著下降[45]。这个参数似乎会在更长的时间内发生变化，正如一项研究报告的那样，接受放射治疗的胃十二指肠惰性淋巴瘤患者HbA1c糖化血红蛋白水平升高，这反映了过去12周的平均血糖水平。他们得出结论，接受放射治疗的患者与未接受治疗的患者相比，糖尿病风险增加[46]。

如前所述，纵隔放射治疗可能会引起远隔效应，并对其他器官造成损害。根据一项研究[47]，对大脑和肾脏的远隔效应与直接照射的效果相当。据记录，即使在铅屏蔽的保护下，大鼠纵隔区域单次剂量（25 Gy）的照射也会在身体其他部位引起远程恶化效应[9]。在我们的样本中，我们能够检测到未经治疗的照射组与对照组相比，肌酐和尿酸水平升高，表明肾脏受损。此前，在25 Gy纵隔照射后6周仅观察到肌酐轻微增加[9]。肾脏是一个对辐射敏感的腹部器官，在接受放射治疗后易发生肾病，表现为高血压、蛋白尿和氮质血症[37, 48]。此外，据记录，肾脏是对远隔效应敏感的器官，正如一项研究所描述的，该研究旨在通过调查蛋白质二级结构的变化来研究全身、头部或下肢照射（剂量为2 Gy γ—0.5 Gy/min）后大鼠大脑、肺和肾脏中的蛋白质变形。结果显示，所有照射组的大脑和肾脏中α-螺旋光谱质量减少，与之相对应的是β-折叠和随机卷曲/环/转的增加[47]。此外，在一个双侧肾脏受累的弥漫性组织细胞淋巴瘤患者的病例报告中，仅对一侧肾脏进行了放射治疗，但两侧肾脏均显示出对放疗的反应[49]。此外，在我们的研究中，我们在纵隔照射后仅9天就观察到血浆中肌酐和尿酸水平的升高，表明肾脏损伤是非靶效应，由照射细胞释放的信号因子引起。在我们测试的物质中，我们记录了氢气的最佳效果，已知氢气在多项动物研究中保护肾脏，如肾结石、肾纤维化和药物诱导的肾毒性[50]。

乳酸脱氢酶在全身新陈代谢中扮演着非常重要的角色。不同的毒理学和病理学并发症会损害各种器官，最终导致这种酶在血清中的泄漏。因此，血清中不寻常的乳酸脱氢酶水平是不同疾病的重要生物标志物[51]。众所周知，辐射本身会导致血清中乳酸脱氢酶显著升高[52, 53]。同样，在我们的研究中，我们观察到纵隔照射后9天大鼠血浆中该酶活性升高。看来，我们选定的化合物治疗保护了机体免受放射细胞毒性的伤害。基于我们的研究结果，我们假设吸入氢气和维生素E在实验条件下最有效地降低了乳酸脱氢酶的活性。此外，另一项研究也观察到维生素E在辐射模型中的保护作用。腹腔注射维生素E（30 mg DL-α-生育酚醋酸酯）后，大鼠在腹部γ辐射（1000-cGy）后3天血清中乳酸脱氢酶活性降低[36]。针对乳酸脱氢酶、辐射和氢气的体内研究数量有限。另一方面，通过用氢气富集的PBS溶液处理肠道隐窝HIEC细胞，然后应用γ射线辐射的体外研究证明了氢气的放射保护效果。据记录，在γ射线辐射前用0.1-0.4 mmol/L 氢气预处理HIEC细胞，与仅接受辐射处理的细胞相比，测试剂量高达8 Gy时显著提高了细胞存活率。同时，氢气预处理显著减少了HIEC细胞的乳酸脱氢酶泄漏[54]。还有，体外缺血/再灌注损伤模型和给予H9C2细胞培养氢气丰富介质伴随着心肌细胞在低氧/复氧后的细胞活力改善和LDH释放减少[55]。基于我们的结果，我们建议氢气比维生素E或海带（Laminaria digitata）更有效地逆转辐射的有害影响。氢气的潜在机制，作为最小的分子，可能是它的抗氧化活性，这在许多以前的研究中得到证实[56,57,58]，但它也能够修改Keap1-Nrf2信号通路，该通路在保护细胞免受氧化和异物压力方面发挥核心作用[59]。此外，氢气的放射保护效果和讨论氢气的机制，还包括细胞内反应，包括抗炎、抗凋亡和基因表达调节[60]。可以假设，纵隔辐射后9天使用氢气清除过量的自由氧自由基，从而消除机体中的氧化应激。

结论

大鼠血浆中标记物的增加表明，纵隔以单次剂量10 Gy辐射后9天机体的整体状况恶化。给予氢气、维生素E和海带（Laminaria digitata）降低了血浆中选定参数，这表明它们具有防护辐射引起的毒性的效果。我们的结果显示，在选定的抗氧化剂中，氢气似乎是最有效的化合物，它最显著地抑制了由辐射引起的血浆变化。我们假设氢气可能代表一种新的且临床上可应用的防护剂，用于防止辐射引起的毒性。

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