氢气加维生素E对心脏辐射损伤的保护作用机制

本文内容来自欧洲学者Jan等的新书《氢气在健康疾病中作用》第九章，内容来自主编小组，和第八章都是关于氢气治疗辐射心脏损伤，八章属于综述，本章则是观察探讨了氢气和维生素E对心脏辐射损伤保护作用机制的研究。

点评：使用动物辐射心脏损伤模型，观察了氢气和维生素E治疗的保护作用，研究观察到氢气对辐射损伤的保护作用，维生素E作用类似，联合两种治疗也同样获得类似效果。但是该研究并无态度新意，氢气和维生素E作用类似，都可以影响碱性磷酸酶和蛋白磷酸化效应。那么，氢气有什么特异性价值？

本研究旨在探究抗氧化剂氢气和维生素E补充是否会影响辐射和非辐射大鼠心脏左室组织中的间隙连接通道蛋白connexin-43。实验使用3个月大的雄性Wistar大鼠，随机分为6组：(1)完整大鼠；(2)用氢气处理的完整大鼠（吸入室中4% 氢气，每天3次，每次30分钟）；(3)补充维生素E的完整大鼠（体重30mg/kg）；(4)单次接受10Gy剂量照射后的辐射大鼠；(5)用氢气治疗的辐射大鼠；(6)用维生素E治疗的辐射大鼠。在辐射后9天使用左心室心肌进行分析。结果表明，氢气和维生素E的治疗不仅在辐射大鼠中，而且在完整大鼠的心脏中都上调了connexin-43和PKCε。未来的研究需要阐明这些机制。

普遍接受的是，氧化应激和炎症是危害心血管健康的关键因素[1,2,3]，它们可以增加心脏对恶性心律失常的敏感性[4, 5]。氧化还原紊乱和活性氧（ROS）水平升高会改变心肌离子通道和间隙连接connexin通道的功能，并扰乱Ca2+的处理。因此，心脏的电稳定性降低，更容易在结构重塑导致的心律失常基质存在的情况下发展成恶性心律失常。

另一方面，应该强调的是，许多具有抗心律失常特性的心脏保护化合物也是有效的抗氧化和/或抗炎剂[6]。这与有效针对线粒体的抗氧化疗法来对抗心律失常的概念相吻合[7]。因此，确定ROS下游影响心律失常的目标，例如connexin-43 (Cx43)，可能会产生有效的抗心律失常疗法[5,6,7]。

主要的心脏间隙连接Cx43通道确保了心肌细胞之间的耦合，以便快速传播电气和分子信号，这是同步化心脏功能的基础[5, 8]。而在多种病理状态下（通常伴随着氧化应激和炎症），Cx43的下调或其异常的心肌拓扑恶化了耦合，增加了心脏对危及生命的心律失常的敏感性[5, 6, 9, 10]。

减少心血管病变或放射损伤后的氧化应激和炎症的有希望的候选者之一是分子氢（H2）[11,12,13]。而α-生育酚（维生素E）调节炎症信号通路[14, 15]，减弱细胞膜的脂质过氧化，并提供心肌保护以对抗缺血再灌注损伤[16]。然而，一些干预性临床实验中使用的维生素补充剂提供了不确定的结果，主要是由于剂量不当和缺乏评估维生素数量的药代动力学。

在这项初步研究中，我们旨在探究氢气或维生素E补充是否会影响辐射后大鼠心脏左室组织中Cx43的蛋白质水平和/或拓扑。此外，我们还检查了辐射和治疗后静脉和动脉毛细管网的反应。

材料和方法

该实验由实验医学研究所动物护理和使用委员会批准，符合欧洲议会关于保护用于科学目的的动物的2010/63/EU指令制定的指导方针和实践。动物在标准条件下饲养，温度为22±1°C，光照/黑暗周期为12小时，有充足的大鼠饲料和自来水。

使用完整大鼠（n=15）和胸部区域单次接受10 Gy剂量照射的辐射大鼠（n=15）。辐射后的第二天，完整（n=10）和辐射（n=10）动物分别用氢气（吸入4% 氢气，每天3次，每次30分钟）或维生素E（Jamieson，每天一次，以30 mg/kg体重剂量的载体饼干形式给予）治疗9天，并与未治疗的对照组（n=10）进行比较。安乐死后（Thiopental VUAB 1.0 g，60 mg/kg i.p.），打开鼠胸并取出心脏置于冰冷生理盐水中。接着进行心脏重量登记和心脏组织取样。所有样本存储在-80°C的冰箱中待分析。

使用左心室冷冻组织制备10μm厚的冰冻切片。对苏木精-伊红（HE）染色的心肌组织切片进行光学显微镜检查以评估结构。

此外，对冰冻切片进行原位酶组织化学检测以评估心肌毛细血管功能和密度。检测碱性磷酸酶（AlP）活性，这是特定于毛细管网动脉部分[17]，以及二肽基肽酶-4（DPP4）活性，这是特定于毛细管网静脉部分[18]。同时，AlP或DPP4阳性的毛细血管指出心肌毛细血管密度。进行定量显微图像分析，如先前报道[6]，以评估实验组之间的差异。

使用冰冻切片进行心肌Cx43的免疫荧光标记（1:500, MAB3068, CHEMICON International, Inc., Temecula, CA, USA）以展示Cx43的拓扑，同时进行西方印迹分析以定量总Cx43蛋白水平（1:5000, C6219, Sigma-Aldrich, Missouri, USA）及其丝氨酸368磷酸化形式（1:1000, sc-101660, Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA）。同时，还测定了PKCε的蛋白水平（1:1000, sc-214, Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA），它负责Cx43丝氨酸368的磷酸化并调节Cx43通道的功能。所有这些方法都按照先前的报道[19]执行。

统计学处理

不同组之间的差异是通过单因素方差分析（ANOVA）和Bonferroni多重比较检验来评估的。使用Kolmogorov-Smirnov正态性检验来检查变量是否呈正态分布。数据以均值±标准差（SD）表示；p < 0.05被认为具有显著性。

结果

如图9.1所示，在辐射后9天，光镜检查未发现左心室心肌细胞明显的结构损伤或多形核白细胞浸润增强，后者有炎症发生。

图9.1实验大鼠左心室代表性组织学图像，经过HE染色。与完整对照大鼠心脏相比，无论是对辐射的反应还是治疗，心肌细胞或细胞外间隙的结构均无明显改变。C - 完整对照组，H - 氢气治疗组，E - 维生素E治疗组，IR - 辐射组，IR H - 辐射加氢气治疗组，IR E - 辐射加维生素E治疗组。比例尺代表100 μm。

然而，辐射后的大鼠心脏显示出碱性磷酸酶活性以及动脉毛细管网密度的显著降低，如图9.2所示。用氢气治疗辐射后的大鼠增加了毛细管密度并保持了碱性磷酸酶活性，而维生素E则没有这种效果。

图9.2实验大鼠左心室动脉毛细管中碱性磷酸酶活性的代表性显微图像。与完整对照大鼠心脏相比，辐射后明显降低了活性，而氢气治疗后有增加的趋势。C - 完整对照组，H - 氢气治疗组，E - 维生素E治疗组，IR - 辐射组，IR H - 辐射加氢气治疗组，IR E - 辐射加维生素E治疗组。比例尺代表100 μm。此外，如图9.3所示，辐射后导致静脉部分毛细管网中二肽基肽酶-4活性显著下降。用氢气或维生素E治疗完整和辐射后的大鼠均不影响二肽基肽酶-4的活性。

图 9.3代表性显微图像展示了实验大鼠左心室静脉毛细管中二肽基肽酶-4的活性。与完整对照大鼠心脏相比，辐射导致酶活性显著降低，而治疗并未对此产生影响。C - 完整对照组，H - 氢气治疗组，E - 维生素E治疗组，IR - 辐射组，IR H - 辐射加氢气治疗组，IR E - 辐射加维生素E治疗组。比例尺代表100 μm。

图9.4展示了Cx43拓扑的代表性免疫荧光图像。无论实验组如何，Cx43在横纹盘处有明显的极性分布，在心肌细胞的侧面分布较少。然而，辐射和氢气处理似乎增强了Cx43的阳性标记。

图9.4实验大鼠左心室Cx43拓扑结构的代表性免疫荧光图像。注意Cx43在横纹盘（长箭头）的普遍分布，而在心肌细胞的侧面（短箭头）则不那么频繁，这在完整大鼠中是显而易见的。在辐射后的大鼠心脏中，Cx43的免疫标记增强，但在治疗过的大鼠中程度较小。C - 完整对照组，H - 氢气治疗组，E - 维生素E治疗组，I - 辐射组，IH - 辐射加氢气治疗组，IE - 辐射加维生素E治疗组。比例尺代表100 μm。

图9.5展示了实验大鼠左心室组织中总Cx43蛋白及其功能性磷酸化形式的定量西方印迹分析。辐射后9天，Cx43蛋白水平没有显著变化。令人惊讶的是，无论是氢气还是维生素E的治疗都显著提高了辐射和非辐射大鼠心脏中的Cx43蛋白水平。

图9.5实验大鼠左心室总Cx43蛋白（A）及其在丝氨酸368上磷酸化形式（B）的代表性西方印迹。定量评估的柱状图显示，在辐射及完整大鼠心脏的处理后，总Cx43蛋白水平显著增加。C - 完整对照组，H - 氢气治疗组，E - 维生素E治疗组，IR - 辐射组，IR H - 辐射加氢气治疗组，IR E - 辐射加维生素E治疗组。

图9.6展示了实验大鼠左心室中PKCε蛋白水平的代表性西方印迹，该酶负责在丝氨酸368上磷酸化Cx43。辐射后9天，PKCε的蛋白水平没有变化，但在用氢气或维生素E处理非辐射大鼠心脏后，其显著增加。

图9.6实验大鼠左心室PKCε的代表性西方印迹。在完整大鼠心脏的处理后，PKCε蛋白水平显著增加。C - 完整对照组，H - 氢气治疗组，E - 维生素E治疗组，IR - 辐射组，IR H - 辐射加氢气治疗组，IR E - 辐射加维生素E治疗组。

讨论

这项初步研究调查了在单次10 Gy剂量辐射后9天，使用心脏保护剂如氢气和维生素E治疗是否对辐射后的大鼠心脏产生影响。

显微镜检查并未揭示辐射后大鼠左心室心肌细胞或细胞外空间的明显结构变化。然而，辐射后大鼠动脉毛细管中的碱性磷酸酶活性显著降低。阳性酶毛细管的密度也有所减少。这些发现指出辐射后大鼠心脏的心肌动脉毛细血管化减少。相比之下，氢气的治疗减轻了辐射的有害影响并增强了动脉毛细管网。后者曾在用ω-3脂肪酸治疗的老龄高血压大鼠中报道[20]，或在大鼠对冷适应的反应中报道[21]。另一方面，氢气或维生素E的治疗并未影响辐射后大鼠心脏静脉毛细管网中二肽基肽酶-4活性的降低。该酶参与胶原蛋白的代谢和合成以及内皮毛细血管涂层，并且在血管活性肽的降解中起作用[18]。

Cx43的免疫标记并未显示任何实验组中心肌细胞分布异常。在横纹盘的间隙连接处普遍存在Cx43的免疫阳性，而在心肌细胞的侧面则较少见。这种模式既不受辐射也不受治疗的影响。在早期阶段（9天）检查的辐射后大鼠心脏中，Cx43蛋白水平及其磷酸化状态没有变化。这些发现不同于我们之前的研究报告[22, 23]，其中显示在辐射后6周检查的大鼠心脏中Cx43蛋白表达及其磷酸化增加。这表明单个有害信号可能在适应期间诱导Cx43的上调。

值得注意的是，氢气或维生素E的治疗增强了辐射后以及完整大鼠心脏中的Cx43蛋白水平。这一发现挑战了调查潜在机制，因为抗氧化剂可能会影响心肌Cx43表达[6]。在这方面，氢气以及维生素E显著提高了完整大鼠心脏中的PKCε蛋白水平，并在辐射后大鼠中有适度提高是有趣的事实。Cx43是PKCε磷酸化的下游靶标，与调节Cx43通道功能和细胞保护有关[24]。尽管我们在辐射后6周证明PKCε的上调，但在辐射后9天我们并未检测到任何变化[22, 23]。

总之，这项初步研究的发现激发了进一步研究以阐明氢气和维生素E在Cx43和PKCε上调中的作用机制。

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