甾体微生物转化：甾醇代谢工程时代的机遇与挑战

        杨顺楷     四川    成都

概要

2021年，全球甾体医药市场已经达到1400亿美元，它是经次于抗生素的第二大类药品。甾体药物现有400种，在销售量前 200 名的药物中，甾体药物就占据 13 种，销量总额高达近 200 亿美元。未来市场对甾体药物的需求量仍将持续增长。跨国药企，如辉瑞制药、葛兰素史克、拜尔、赛诺非-安万特等仍将掌控国际市场。由于我国甾药生产原料的价格优势以及研发水平和生产工艺的优化提升，近年来全球甾体药物行业出现产业向国内转移的趋势，中国将逐步成为全球甾体药物的生产中心。

2021 年我国甾体药物的市场规模就达到 800 多亿元人民币，并已成为全球甾药原料APIs的主要供应国。目前，我国有40多家企业生产甾体APIs 产品，涉及品种有40多个，其中皮质类激素原料药的产能已居世界第一，但是均属于低端低值产品。显然，这就是存在的差距。

正如标题所述，“甾体微生物转化：甾醇代谢工程时代的机遇与挑战”是客观存在的现实。尽管甾体微生物转化已经证明在不断前进，但是仍然存在对未来研发工作的不断挑战。表现在工业菌株相对低的产能，其转化工艺常常是低效率。许多情况下实验室表征的结果，对于工业应用仍然仅存在有潜在的吸引力。

实际上，工业过程的技术经济成本效率，要求至少每升数克的有效产能，否则很难投入工业实用化。为了改进生物转化工艺过程，应当解决的问题诸如甾体低的溶解度，较低的底物利用度，甚至在有些情况下须得弱化甾体底物/产物对微生物细胞的毒性。对发酵介质的理性设计，甾体生物转化参数优化的物理-化学层面考究，建立疏水甾体传输体系，均是为了推动上下游生产工艺过程的优化。

总之，基于“微生物细胞工厂”概念上的甾体工业生产API 药物产品，当今时代可以预言有革命性的进展；然而现实是尚有很长的路要走，虽然已经在这个方向上迈出了可喜的第一步，但还是任重道远。

摘要 本微综述报告甾体微生物转化进入甾醇代谢工程时代的新近R&D 进展。基于对胆固醇分解代谢研究获得较大进展基础上，借助对两株放线菌，即红球菌和分枝杆菌编码基因和相关生物降解甾醇关键酶3-酮甾体-D1-脱氢酶（KSTD）组菌株，实现对多种甾体底物的C1,2-脱氢。在首次揭示红球菌和结核分枝杆菌两者同源的KSTD3(3-酮-5a-甾体-D1-脱氢酶)和3-酮甾体-9a-羟基化酶 (KshAB,)的功能和高特异性，并以新近鉴定2个甾体代谢中间体5a-T 和5a-AD与此类酶密切相关；这有利于开发我国南方蕃剑麻皂素饱和化中间体的A环生物C1,4 脱氢。已知结核分枝杆菌（Mtb）贯穿整个胆固醇降解感染周期。胆固醇环降解酶具有对侧链降解中间体，较侧链全降解化合物有较高的活性；胆固醇的侧链和环的降解同时发生。这些认知对于了解细菌胆固醇分解代谢，促进设计新型治疗剂和高值甾体化合物的生产有利。这也就为利用植物甾醇和分枝杆菌遗传重组菌的细胞工厂，建立C19/C22甾体中间体生物技术，发展甾体激素药物工业提供可靠的技术基础。总之，在进入甾醇代谢工程时代，机遇与挑战并存，还有许多R&D工作要做。

关键词 胆固醇分解代谢；分枝杆菌生物降解植物甾醇；相关酶类的遗传重组；C19/C22 中间体产品

Mcrobial transformations of steroids:opportunity and challenges of sterol biodegradation during the metabolic engineering

YANG Shunkai

Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences,Chengdu 610041,China

Abstract In this minireview， author  reported current state on the studies of biodegraded sterols . A considerable progress in sterol bioconversion studies was achieved due to cholesterol catabolism by two strain of actinomycete ,Rhodococcus and Mycobacterium tuberculosis，as being in the orthologue .Now We have known that M.tuberculosis(Mtb)degrades cholesterol through its infection cycle，and its ring-degrading enzymes have higher activities with side chain degradation intermediates than with compounds with fully degraded side chain as cholesterol side chain and ring degradation occur simultaneously. so those are of significance for understanding bacteria cholesterol catabolism facilitates the design of novel drugs and the production of high value steroids. Thereafter through DNA molecular cloning and genetic engineer, it was found that a 3-ketosteroid-D 1-dehydrogenas(KstDs)[EC 1.3.99.4],which is one of the key enzymes in microbial steroid catabolism ,which catalyzes D 1-dehydrogenation of A ring of 3-ketosteroid substrate. Interestingly ,among those involved the D 1-KSTD3 has a clear preference for 3-ketosteroid with a saturated A-ring, displaying highest activity on 5a-AD(5a-androstan-3,17-dione) and 5a-T(5a-testosterone;also known   as 17b-hydroxy-5a-androstane-3-one),and this kind of KSTD3 and 9a-hydroxylase (KshAB) biocatalysts are available for the development of the plat resource of agave sapogenin in south China, with its intermediate in the A ring without C4-C5 double bond,and made a product of A ring with D1,4-dehydrogenation by a mean of bioconversion. As mentioned above, this research work is important for production of C19/C22 steroid intermediate from phytosterol in application of steroid drug industry in China. Up to-date, we face both of opportunity and challenges in microbial degradation of phytosterol in a new era of sterol metabolic engineering for production  of C19/C22 steroid intermediate ,and there are many things to be done.

Key words:cholesterol catabolism with two strains of actinomyceds with   Rhodococcus and Mycobacterium;Biodegratation of Phytosterol;  DNA molecular clonig and genetic engineering for Relative enzymes;C19/C22 steroid intermediate.

1. 引言

代谢就是生物转化的同义语。 我国作为甾体激素药物原料药及中间体(API)工业生产大国，基本实现从原有的薯蓣皂素-双烯半合成路线，合理整合我国半个多世纪以来，在甾体激素制药产业发展的化学与生物半合成技术与产业管理方面的优势，较为成功转型到由植物甾醇生物降解产物雄甾-4-烯-3,17二酮（AD),雄甾-1,4二烯-3,17-二-酮（ADD）,9a- 羟基-AD(9OHAD)，21-羟基-20-甲基-孕甾-4-烯-3-酮（双降醇，4-HP），二酮酸(A环降解产物）等激素前体物质，替代生产各种甾体激素药物，成为世界甾体药物API生产第一大国。

甾醇侧链降解，获取具有利用价值的中间体，经由传统工业微生物方法，筛选目标放线菌种；再对野生型菌株进行理化诱变选育，摇瓶转化底物甾醇；借助生物液体药物分析，取样分析鉴定所需中间体；优选生产所需具有工业应用价值的C19和C22 甾体中间体,作为制造甾体激素药物半合成路线的原料[1]。

新世纪初，我国南北方企业，利用引进2条生产线，二次开发利用植物甾醇发酵降解，生产前述甾体API产品，菌种属于放线菌目的分枝杆菌属（Mycobacterium）。国内已有数家优秀企业开发生产这类产品，已经达到工业规模生产水平，产能达千吨级水平。

利用植物甾醇生物降解生产具有价值的中间体C19 和C22 产品，明显的优势在于工艺流程较短，加工工艺成本较低，对环境友好。但是存在较低产能，菌种的选择性尚不够令人满意。主要缺点是工业菌种分枝杆菌存在较多的酶促过程，而累积副产物。这些因素构成了植物甾醇生物降解工艺路线的复杂性[1]。

迄今为止，对胆固醇和植物甾醇生物转化研究，聚焦于微生物生产菌种放线菌。但是有关对甾醇氧化的酶类尚未进行完整鉴定，以及生物催化反应机理方面，,根本性基础机研究尚显薄弱。以Van Der Geize 等首次揭示红球菌和结核分枝杆菌在胆固醇分解代谢功能研究的重大进展算起，使用DNA 分子克隆和遗传工程技术，重组甾醇降解酶类菌株作为生物催化剂，生物降解植物甾醇生产C19,C22产品，也才仅有过去20多年的时光[2,3]。下面将近年国内外具有代表性的研究工作介绍如下。

2. 研究工作进展

2.1 两株放线菌对胆固醇分解代谢比较研究发现高特异性功能酶类[3-6]

 KSTD(3-酮甾体-D1-脱氢酶)[4-烯-3-氧甾体：（受体）-1-烯-氧化还原酶；EC 1.3.99.4] 是一个由黄素蛋白催化，从多环3-酮甾体结构化合物A环的反式-轴向直接消除C1a-位 和C2b-位氢原子功能酶类。引入双键有利于提高甾体药物药理活性,降低副作用。3-酮甾体脱氢酶（KSTD）是一个微生物催化胆固醇分解代谢，打开B环的关键酶。已经在放线菌发现各种 KSTDs酶活性，如节杆菌（Arthrobacter）,分枝杆菌（Mycobacterium），红球菌（Rhodococcus）,以及假单孢杆菌（Pseudomonas）。

Van Der Geize 等在胆固醇分解代谢功能研究基础上，首次揭示红球菌SQ1的KSTD3(3酮5a-甾体-D1-脱氢酶)，与结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）H37Rv 高度特异性酶类定向进化同源和种系发生研究结果。首先，进行对红球菌SQ1的kstD3基因克隆，异源表达，和对KSTD3甾体脱氢酶的生物化学表征。在kstD3基因上游发现一个开放读码框，类似于D4-KSTD(3酮-5a-甾体-D4-脱氢酶),推定为kstD4 。生物化学分析发现KSTD3具有明显偏好底物具有饱和A 环3-酮甾体化合物，呈现对5a-AD（5a-雄甾烷-3,17-二酮）和5a-T(5a- 睾丸酮；也称为17b- 羟基-5a- 雄甾烷-3-酮）的最高活性。另一方面，KSTD1 和KSTD2 明显偏好（9a-OH-)4-雄甾烯-3,17-二酮(9OHAD)作为底物。对已知和推论的KSTDs 氨基酸序列显示，R.erythropolis KSTDs 蛋白簇分为不同的四组[3]。

引人注意的是，红球菌SQ1的D1-KSTD3,伴同Rv3537,仅存于结核分枝杆菌H37Rv的D1-KSTD 同簇；该酶蛋白涉及胆固醇分解代谢及其结核病病原性。

异源表达Rv3537酶的底物范围，几乎与D1-KSTD3完全一致，表明这些就是同源酶。这就意味着5a-AD和5a-T 是胆固醇分解代谢途径新近鉴定的甾体中间体。显然，作为可在人体宿主巨噬细胞长期存活，依赖胆固醇作为碳源和能源的结核分枝杆菌病原性相关甾体化合物，具有分子药理和病理方面重要性。此前，一度认为结核分枝杆菌不能利用胆固醇作为碳原和能源。这类以专有存在的细菌KSTD酶，与人体宿主未知同源酶，可开拓一个抗结核病新型靶向药物研究新方向[3]。

红球菌SQ1 含有降解甾醇、甾体化合物DNA片段7.4kb。依据上述基因提出的代谢途径，由胆固醇作为底物起始，启动的数步反应开始断侧链。经由胆固醇氧化酶（ChoG）和二烯酰水合酶（Hsd4B) 催化，生成饱和化的5a-T;以它作为中间体，经由羟酰辅酶A脱氢酶（Hsd4A,）催化C17- 羟基脱氢，生成饱和化的5a-AD 中间体；继之经由KSTD3 脱氢酶转化，成为C1,2 位引入非饱和化的双键甾体中间体1-（5a)-AD 产物；以此为底物，经D4-KSTD脱氢酶脱氢，成为雄甾-1,4-二烯-3.20-二酮（ADD）；ADD 再经过数步反应，最终代谢成为丙酰辅酶A和丙酮酸[3]。

2.2 红球菌（R.ruber）Chol-4菌株三个3-酮甾体D1-脱氢酶同工酶的分子表征[7]

  通常大部分红球菌属菌种均是好气性分解代谢多样性的土壤细菌。细胞有高含量GC和外膜脂类的枝菌酸成分，具有一种特异性降解广谱有机化合物能力，包括难降解的污染物和有毒化合物。由此它们被广泛用于生物修复和生物催化方面的模式菌株。已知红球菌也能够降解多种甾体化合物，如胆固醇和植物甾醇这种三萜类天然产物。

近期胆固醇分解代谢途径的研究进展，已经在分枝杆菌和红球菌的DNA 分子克隆和遗传工程框架水平予以阐明。2007年Van Der Geize 等在红球菌和结核分枝杆菌，首次发现胆固醇降解基因簇。该基因簇由223个基因组成，其中分布着51个与降解能力高度相关的基因。这为理解微生物对甾醇分解代谢机制，以及通过理性的代谢工程改造，开发高效转化甾醇的细胞工厂铺平了道路。尽管许多相互作用酶类的生理作用仍然还在继续研究之中。胆固醇及其衍生物经历一个侧链断裂过程，与此同时发生甾体环的降解，或者是不被降解(R.josttil RHA1)的种属特异性。从而积累产生C19中间体（AD 和ADD,继之转化AD 成为9a-OHAD,或9aOHADD。）该过程经由3-酮甾体-D1-脱氢酶（KSTD）和3-酮甾体-9a-羟基化酶（KshAB，氧化酶组份和还原酶组份）完成。

红球菌（R.ruber）Chol-4菌株是分离自污泥样本的胆固醇降解菌，能在补加甾体化合物的基础培养基上生长。呈现宽泛的分解代谢能力。它可利用胆固醇，胆甾酮，睾丸素，AD,ADD，孕甾烯醇酮，孕甾酮，雄甾酮，和二氢雄甾酮作为唯一碳原和能源。以此作为模式菌株，研究涉及分解代谢的酶类。对Chol-4菌株分析了454个基因组数据，并进而搜寻推定KSTD酶类。分析它们在甾体代谢中可能具有不同的作用。

表征了红球菌（R.ruber）Chol-4菌株KSTD脱氢酶三个同工酶。该菌株基因组不含有任何3-酮-5a-甾体-D4- 脱氢酶（kst4d 或Test） 同源性；这种同源性却出现在红球菌（R.erythropolis) SQ1和 假单胞菌（Pseudomonas testosteroni）的基因组 。

该菌株的突变体KstD2生长实验研究。无论是单一，双重，或三重KstD1,

KstD2,KstD3 突变体，表明KstD2 是专司转化AD成为ADD,,以及转化9OHAD成为9OHADD 。R.ruber KstD2,3 ，和KstD1,2,3 突变体（两者缺失KstD2 和KstD3）在以胆固醇为唯一碳源的基础培养基上不生长，证明KstD2 和KstD3涉及胆固醇的降解。与之相反，KstD1的突变，并不改变生长实验可检测到细菌在有甾体组份培养基上生长，可见该蛋白的作用仍不清楚。该菌株在所有情况下缺失功能性的KstD2，可诱发累积9OHAD。作为支路代谢产物，可能借助3-酮甾体-9a-羟化酶（KshAB）在AD 分子上起作用。因此KstD2 是一个红球菌（R.ruber）Chol-4对AD 分解代谢途径的关键酶，同时KstD3专司对胆固醇的分解代谢。KstD1 不具有对AD 或胆固醇降解的直接效能[7]。

2.3 对新金黄分枝杆菌（Mycobacterium neoaurum）DSM1381生产甾体合成子和菌株3-酮甾体-D1 脱氢酶（KSTD）同工酶鉴定功能及其应用[8]

当全基因组序列和转录组序列可以提供更多可能性，这就增高了鉴定放线菌编码关键酶基因的研究兴趣。事实上，许多突变株，如新金黄分枝杆菌“Mycobacterium neoaurum”DSM1381,VKM Ac-1815D已经提供了有价值的基因数据资料，可供作为实验手段构建新菌株，有效满足甾体药物工业需求[1]。

在化学修饰甾体激素方面，KSTDs 是一个关键酶。迄今为止，仅有少数KSTD s被生物化学表征，并应用于生产甾体激素药物中间体。开展对新金黄分枝杆菌DSM1381三个3-酮甾体-D1- 脱氢酶同工酶KstD1,KstD2,KstD3, 并对KstD3进行鉴定。它们分别同先前报道的KSTD氨基酸序列相似性有99,85，和97%。本文考察了新金黄分枝杆菌DSM1381的KSTDs , 并举例评估在工业甾体转化的应用潜力。

结果表明重组枯草杆菌KstD2菌株，在以AD和22-羟基-23,24-二降胆甾-4- 烯-3-酮(4HP,，双降醇）作为底物，呈现较高活性；比活力分别达到22.40和9.19Umg-1。

但是，利用枯草杆菌和E.coli 构建的重组菌株KstD1 和KstD3 ，也分别加入AD 和4HP 作底物，具有显著低的比活性；利用E.coli  重组的KstD2菌株BL21 -克隆，在AD8g/L(w/v) 底物浓度下，转化15h,获得99%转化率的ADD产物。加之，作者利用新金黄分枝杆菌DSM1381缺失KstD1， 获得突变菌株利用植物甾醇20g/L，转化发酵168h, 生成4HP( 双降醇）产物14.18g/L 。可见新金黄分枝杆菌DSM1381 ，易于在E.coli 和枯草杆菌异源表达，重组子BL-21 KSTD2 是一株工业应用很有潜力的菌种；DSM1381D1-KstD1 菌株能利用植物甾醇为原料生产4HP(双降醇,C22甾体中间体）。

2.4 具有快生长特性的偶发分枝分枝杆菌发酵断甾醇侧链积累9a-羟基雄烯二酮(9OHAD)[5]

 杨顺楷等利用常规微生物定向II级液体发酵培养方法，选择偶发分枝杆菌(Mycobacterium forfortuitum)CICC20179(=ATCC35855)定向筛选。选出具有较高甾醇降解活性的菌株，借助TLC 法开展多批次的生物降解实验过程研究，并重点对积累9a-羟基雄烯二酮（9OHAD)化合物菌株稳定性及转化过程进行考察。在此基础上对选出的22号菌株，分别进行底物为胆固醇和植物甾醇的半微量制备实验。结果分离的样品具有高纯度，HPLC分析为95.7%；TLC，HPLC,MS,1HNMR.13CNMR.i.r. 等光谱数据分析，结构确证其为9OHAD；半微量制备实验以胆固醇或植物甾醇为底物，9OHAD重量收得率分别可达34.0和30.8%。本研究可,为高效含卤（氟，氯）糖皮质激素药物工业生产提供一种有用的中间体。

2.5 一种新的高活性宽泛底物谱的3-酮甾体-D1-脱氢酶有效转化氢化可的松

[9]。

吴洽庆等选择具有高活性生物催化甾体-1-位脱氢相关菌株，并对其酶类进行鉴定及生物化学表征。对该芽孢杆菌等细菌菌株进行分子遗传操作，提高了KstD 编码基因的表达。构建的重组菌具有更好的甾体-1-位脱氢效能。

3-酮-甾体-D1-脱氢酶（KSTD）催化甾体化合物D1-脱氢，引入C1,2-双键，是一类对皮质甾体药物（可的松，泼尼松；氢化可的松，泼尼松龙）生物转化很重要的酶，对于提高药物抗炎活性，有利于降低滞盐水副作用。

作者设计从不同来源，选择9个推定kstD 基因，并且在Ecoli BL21(DE3)进行异源表达。这些重组酶催化多种非饱和化甾体化合物D1-脱氢。其中，丙酸菌的3-酮甾体-D1-脱氢酶(PrKstD)呈现最高的比活性，和宽泛的底物谱。详细的PrKstD催化表征表明，它能转化众多带有多样性取代基3-酮甾体化合物。范围从C9,C10,C11, 以及C17位取代基，直到催化C4,5无双键的底物,即5a-T生成5a-AD中间体。对先前C6 取代基甾体底物无活性，如11b,17- 二羟基-6-a-甲基孕甾-4-烯3,20-二酮，如今却发现对此底物有转化活性。此外，在对氢化可的松的生物转化实验研究中，对反应条件，即pH,温度，辅溶剂，以及电子受体优化，使用50g/L含有PrKstD酶的E.coli湿菌体细胞作生物催化剂，在6h期间，转化底物浓度80g/L氢化可的松成为波尼松龙（基础糖皮质激素药物产品），转化率92.5%。这一转化时间/空间效率数据，较之过去已经报道的结果高得很多。

2.6 对偶发分枝杆菌实施缺失3-酮甾体D1-脱氢酶和多基因修饰改进利用植物甾醇生产9OHAD[10]

张保国等开展了如标题所示的实验研究。已知9OHAD是一个合成糖皮质激素药物重要的中间体。但是在利用植物甾醇生物转化制造9OHAD的工艺过程，由于存在对目标产物降解，副产物比例高，这就限制了9OHAD的产出量。

本工作构建了一株稳定的高产菌株。经考察设计一个阻断D1-脱氢和调控代谢流的组合研究策略方案。

作者利用具有快生长特性的偶发分枝杆菌(Mycobacter forfortuitum)ATCC 35855鉴定出五个3-酮甾体-D1- 脱氢酶（KstD）。其中.KstD2呈现出对3-酮甾体最高的催化活性。继之分别考察了.KstD3，.KstD1，KstD4和.KstD5的催化活性，尤其是.KstD2具有对C9- 羟基化甾体较之C9- 非羟基化甾体高得多的催化活性。.KstD3反而显示出与之相反的特征。

缺失KstDs 表明KstD2 和KstD3是9OHAD降解的主要原因。同野生型的偶发分枝杆菌ATCC 35855比较，五个KstDs 缺陷菌株改造，实现对9OHAD 稳定积累，其产率提高到42.5%；敲除双功能还原酶（oppccr), 或者单独高效表达羟酰辅酶A脱氢酶（Hsd4A）, 不能够降低C22 代谢途径的代谢流。基于敲除oppccr 野生株，同时高表达Hsd4A，可显著降低副产物9OHHP 的含量。失活酰基辅酶A 脱氢酶（FadE2829）, 大量积累不完全的侧链降解产物。因此，Hsd4A和FadE2829 在修饰菌株的共表达，成功地消除了两个副产物。同野生株KstD比较，9OHAD的纯度从80.24%提高到90.14% 最终9OHAD 产物达到12.21g/L,(摩尔产率83.74% ）；9OHAD 产能由底物浓度20g/L 植物甾醇，得到产物累积速率0.0927g/h/L。结果表明KstD2 和KstD3是导致9OHAD 降解的主要脱氢酶。Hsd4A 和oppccr 是调控C19 和C22 途径代谢流的关键酶。高表达fadeE829 能降低侧链不完全降解产物的积累。

基于上述发现，构建成功的MF-FA5020转化子，为植物甾醇快速转化累积9OHAD 产物奠定基础。这些结果对致力于了解放线菌对甾体分解代谢调控的多样性和复杂性，深入优化工业微生物提供了理论基础。

2.7 对分枝杆菌的多重基因修饰生产21-羟基-20甲基-孕甾-1,4-二烯-3-酮[11]

  张保国等基于对生产C22 甾体开发进程够不满意，开展了如标题所示的研究。C22 甾体药物中间体非常适合皮质甾体药物的合成。但是由于甾体代谢的复杂性，长期以来生产工艺研发进展缓慢。其中，21-羟基-20-甲基-孕甾-1,4-二烯-3-酮（1,4-HP）适合用于D1- 脱氢甾体药物合成，如波尼松龙。本工作构建起一株理想的1,4-HP生产菌株。借助敲除3-酮甾体-9a- 羟基化酶（KsgA）基因和17b- 羟基甾体脱氢酶（Hsd4A）基因，就阻断了分枝杆菌（Mycolicibacterium neoaurum）对甾核的降解，并不累积C19甾体产物。从而使得突变体菌株能够转化植物甾醇成为1,4-HP产物；而21-羟基-20-甲基-孕甾-4-二烯-3-酮（双降醇）是副产物。继后，借助增高3-酮甾体-D 1- 脱氢酶（KSTD）活性，改进了1,4-HP产物纯度，达到95.2% 。结合高表达NADH氧化酶（NOX）和过氧化氢酶，得以改进1,4-HP产物的生产过程。结果1,4-HP产率达到10.5g/L，摩尔产率和纯度是迄今为止已经报道的最优数据。这就为甾体药物工业提供了一种新的1，4-HP中间体 。

2.8 酰基-CoA 脱氢酶的功能分析及其在C22 甾体生产的应用[12].

 张保国等的报道涉及酰基-CoA 脱氢酶（ChsE）的甾体侧链降解过程，但是其体内的功能仍然不清楚。该研究针对分枝杆菌（Mycolicibacterium neoaurum） 设计的三组脱氢酶:ChsE,ChsE1-ChsE2,ChsE3,和ChsE4-ChsE5 进行鉴定，并对体内功能进行研究；同时与结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis） 进行体外试验比较研究。利用基因敲除，互补和生物转化植物甾醇试验，阐明了ChsE的功能。ChsE4-ChsE5 能在体内利用C27，C24, 和C22甾体。并构建成一株累积C22 甾体，3-氧-4,17-孕甾二烯-20-羧酸侧链甲酯（PDCE）产物生产菌株，兼具有ChsE的高表达。该研究增进了对生物转化途径的了解，并提出一个生产一种新型C22 甾体的新方法。

2.9 新金分枝杆菌DSM1381 的全基因组分析及证实两个关键酶在甾醇代谢积累C22甾体中间体的影响[13]

张保国等利用新金分枝杆菌（Mycobacterium neoaurum）DSM1381（源于ATCC25790）的突变筛选程序，选择具有降解植物甾醇，并积累重要C22甾体中间体化合物的菌株。包括22-羟基-23,24-降胆甾-4-烯-3-酮（4-HP, 双降醇），和22-羟基-23,24-降胆甾-1，4-烯-3-酮（HPD) 。但是对新金分枝杆菌DSM1381的C22 甾体产物代谢机理仍然未知。以此，对DSM1381及其母本ATCC25790的全基因组序列进行比较基因组分析，提出其作用机理。结果发现在两个菌株间存在28个非同义单一核苷酸变异体（SNVs）,17个编码区IndeLs,和8个非编码区IndeLs 。当野生株型3-酮甾体-9a-羟化酶亚基AI(KshA1) 和b- 羟酰-辅酶A脱氢酶（Hsd4A) 在DSM1381高表达，甾体化合物被转化为C19中间体AD 和ADD,而不是C22 中间体。该结果表明KshA1的173N,和Hsd4A的71K 分别均是对维持活性必不可少。氨基酸序列的比对分析表明，在KshA1的173D，和Hsd4A的K171E 均是保守位置。借助SWISS-MODEL模型手段对这些酶的3D 结构进行预测，以及a-折叠（AlphaFold2），以便了解两个酶的失活。

这些结果表明，Hsd4A的K171E可能破坏NAD+与NH3 和KshA1的N173D之间的失活，并可破坏底物催化结构域结合的丢失。提出DSM1381菌株积累C22甾体中间体的机理，其中Hsd4A的K171E 导致酶失活，这就中断C19 次生途径，并加速C22次生途径的代谢活力，以及导致在KshA1的N173D酶的失活，从而阻断C22中间体的降解。结论：该研究解释了在DSM1381 菌株可积累C22 甾体中间体的原因，或探讨两个酶失活机理。

2.10 3-甾酮-9a-羟基化酶基因在分枝杆菌中的异源表达与9a-羟基雄烯二酮的制备[14]

李维团队开展了3-甾酮-9a羟基化酶（KSH）能够转化雄烯二同（AD）产生9a-羟基-雄烯二酮（9-OHAD）。该酶由两个亚基（KshA/KshB）组成。为获得高效积累9-OHAD的重组菌株，该研究选择耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）mc2’155 和戈登氏菌（Gordonia noefelifaecis）NRRL B-59395,对其在以胆固醇为唯一碳源条件下，表达明显上调的KshA/KshB候选基因进行克隆，插入到分枝杆菌表达载体pNIT 中，构建共表达质粒，并将它们导入分枝杆菌Mycobacterium sp. NRRL B-3805 获得重组菌株。利用重组菌株分别对植物甾醇胆固醇和谷甾醇进行生物转化，分离纯化转化产物，采用光谱学方法鉴定化学结构，确证该转化产物是9-OHAD。这就表明该分枝杆菌（Mycobacterium sp.）NRRL B-3805由积累AD变成为积累9-OHAD；进而证明导入的候选基因KshA/KshB确实为有功能的基因。生物转化实验表明，与胆固醇谷甾醇相比，植物甾醇作为底物更易于转化；而用来源于耻垢分枝杆菌的KshA/KshB构建的重组菌转化率可高达90%。该研究对KSH编码基因的异源表达，成功地进行了分枝杆菌生物转化特性的改造，为探索各种甾体药物中间体的工业生产奠定了基础。

2.10 关于生物化学短链脱氢酶-还原酶结构研究[15]

  当今短链脱氢酶-还原酶（SDR）已经构成了一组相当数量功能性异源蛋白家簇。尽管在不同类型之间鉴定为低序列，但其有3D结构呈现高度类似的，以b片层为中心a 螺旋-b折叠模式特征，按照不同序列基序功能归类，是可能构建起一个通用的术语体系。近来突变和结构研究极大地拓展了有关一般反应机理研究知识，从而导致建立起一个残基催化四联体。该四联体可能形成一个质子依赖框架结构，包括烟酰胺核糖的2’-OH，类似于在马肝发现的醇脱氢酶（ADH）。依据其细胞功能，若干个SDR 酶可能提供含SDR酶家簇的分子改造手段，含氧化还原酶，裂合酶，异构酶的大部分。许多这类酶具有不同的底物特异性，如作用于甾体化合物，前列腺素，脂肪醇和外生化合物（化学法合成药物）。例如，在红球菌的胆固醇代谢途径中，侧链经由类似b-氧化断侧链，保留母核，经由胆固醇氧化酶（ChoG）和二烯酰水合酶（Hsd4B) 催化，生成饱和化的5a-T;以它作为中间体，经由羟酰辅酶A脱氢酶（Hsd4A,）催化C17- 羟基脱氢，生成饱和化的5a-AD 中间体。该过程就含有SDR 对17b-羟基甾体脱氢酶的作用。

3. 分析与讨论

3.1依据红球菌与结核分枝杆菌5a-AD和5a-T 是胆固醇分解代谢途径新近鉴定的甾体中间体，表明二者存在分解代谢相关基因簇的同源性，如异源表达KSTD3,可应用在甾体A 环饱和化底物的C1,4-脱氢；国内利用藩麻皂素生产地塞米松的瓶颈就是D1,4-微生物脱氢（国内转化率40-45%，国外60-65%）;剑麻皂素作为我国战略储备甾体皂素资源开发，同样适用于该KSTD3的生物酶法C1,4-脱氢。另一方面，提供了可开发抗结核病新药酶方向的新型靶点。

3.2 红球菌存在相关酶类的种属特异性，具有复杂的代谢特征。在对红球菌Chol-4菌株的KSTD脱氢酶三个同工酶研究中，该菌株基因组不含有任何3-酮-5a-甾体-D4- 脱氢酶（kst4d 或Test）的 同源性；而该同源性却出现在红球菌 SQ1和 假单胞菌的基因组 。KstD2 是一个红球菌Chol-4对AD 分解代谢途径的关键酶，同时KstD3专司对胆固醇的分解代谢。KstD1  不具有对AD 或胆固醇降解的直接效能，其功能尚不清楚，有待继续深入研究。

3.3 新金黄分枝杆菌DSM1381三个3-酮甾体-D1- 脱氢酶同工酶KstD1,KstD2,KstD3, 和对,KSTD3进行鉴定研究，同先前报道的KSTD氨基酸序列相似性有99,85，和97%；考察了新金分枝杆菌DSM1381的KSTDs , 利用枯草杆菌和E.coli 构建重组菌株KstD1 和KstD3 ；E.coli  重组的KstD2菌株BL21 -克隆，在AD8g/L(w/v) 底物浓度下，转化15h,获得99%转化率的ADD产物。加之，作者利用新金分枝杆菌DSM1381缺失KstD1， 获得突变菌株利用植物甾醇20g/L，转化发酵168h, 生成4HP( 双降醇）产物14.18g/L 。新金黄分枝杆菌DSM1381 易于在E.coli 和枯草杆菌异源表达，重组子BL-21KSTD2 是一株工业应用很有潜力的菌种；DSM1381D1-KstD1 菌株能利用植物甾醇为原料生产C22产品4-HP(双降醇）具有工业应用价值。

3.4 偶发分枝杆菌(Mycobacterium forfortuitum)CICC20179(=ATCC35855)定向筛选，和对偶发分枝杆菌实施缺失3-酮甾体D1-脱氢酶和多基因修饰改进利用植物甾醇生产9OHAD。

这两个实验研究工作具有比较的意义，体现利用同一个来源菌种，应用传统与现代方法，开展甾体微生物转化植物甾醇制9OHAD是可行的。前者对于筛选出鲁棒性好的菌株，以及生物转化过程参数优化具有优势；后者对于应用现代分子细胞生物学手段，定向改造目标菌株，构建重组菌株，从根本上改进生物催化过程，提高目标产物产率，降低副产物具有显著优势。选择获得的菌株用于生物转化，制备实验（微量或克量级）是必不可少的，得到产物的精准数据，有利于中试放大实验。

3.5 “ 一种新的高活性宽泛底物谱的3-酮甾体-D1-脱氢酶有效转化氢化可的松”是一项较完整的实验研究工作。经由重组菌手段，选择出PrKstD对底物 高生物C1,2-位脱氢活性生物催化剂，实现对氢化可的松高效转化成为泼尼松龙产品。这一结果证明这一新型的KstD重组酶具有极大的应用潜力。例如对C6 取代基甾体底物：11b,17- 二羟基-6-a-甲基孕甾-4-烯3,20-二酮作为底物，被此PrKstD酶所转化C1-脱氢，可得产品是甲基泼尼松龙，是一种国内外市场畅销的中效抗炎糖皮质激素产品。

以此泼尼松龙为中间体，借助甾体药物化学的D环改造，开发高值高档高效低毒副作用的抗炎糖皮质激素产品，如奈德系列，丙酸氟替卡松等。此外，PrKstD催化C4,5无双键的底物,即5a-T生成5a-AD中间体，对于开发我国藩剑麻皂素路线中的A环饱和甾体底物的C1,4-生物脱氢，具有重要应用前景。。

3.6 张保国等同年（2023）发表的4篇论文[10-13]，表明该团队在利用植物甾醇开发C19（9OHAD）,C22(4-HP,HPD)甾体中间体产品;借助分子生物学遗传重组手段，已经取得应用基础研究成果。如构建成一株C22 甾体，3-氧-4,17-孕甾二烯-20-羧酸侧链甲酯（PDCE）生产菌株，兼具有ChsE的高表达。该研究增进了对生物转化途径的了解，并提出一个生产一种新型C22 甾体的新方法。利用的底盘细胞株均属于2株分枝杆菌：Mycobacterium forfortuitum ，Mycolicibacterium neoaurum 。这些研究工作成果对生产C19,C22 甾体中间体产品的开发进程具有促进作用，特别是多年来国内开发C22中间体工业生物技术进展缓慢。

3.7 李维等的“3-甾酮-9a-羟基化酶基因在分枝杆菌中的异源表达与9a-羟基雄烯二酮的制备”的实验研究，报道为开发9a-OHAD 这一生产含鹵糖皮质激素药物中间体，采用具有对3-甾酮-9a-羟基化酶（KSH）编码基因（KshAB）的异源表达，构建的重组菌株进行分枝杆菌生物转化特性的改造；构建的重组菌株较为成功地实现对以植物甾醇等的生物转化，所得到的目标产物经光谱学鉴定为9a-OHAD，表明这一酶基因克隆与遗传重组是可行的技术途径。须得指出，应用的戈登氏菌（Gordonia noefelifaecis）NRRL B-59395是作者从成都动物园云豹粪便样品中分离出的野生株（属放线菌类），经筛选获得的菌株，具有将胆固醇底物高转化率(87.2%)，积累ADD产物的能力[4]。

4. 提示和建议

 4.1微生物工业生物技术筛选获得的菌株（含重组菌）不能够产生足够多量的靶产物，是由于酶具有有限的周转率或较差的表达，因此蛋白质工程定向进化，在酶水平改进代谢工程最有力，并已经是被广泛使用的手段。

 拓展植物甾醇生物转化工艺，由于涉及甾醇侧链降解机制极为复杂，编码相关降解基因存在多个同功酶，有“菌种多样性，菌株多样性”之说，故实验研究难度大。

 4.2现行实验研究都是在实验室摇瓶机上进行，转化试验样品菌液介质浓度（底物/产物浓）维持在mg/ml或更低水平；生物液体分析过程检测目标产物的生成，较底物浓度的降低更有价值。

 4.3注重对异源表达重组菌株在工艺过程鲁棒性的考察。重组菌也可以结合传统工业微物育种手段，进行筛选研究。甾醇生物降解累积C19或C22目标产物技术途径可行后，须得进行实验室发酵罐的克量级制备实验，为中试提供可靠数据资料。

 4.4基于胆固醇分解代谢新近鉴定的中间体5a-AD(5a-雄甾烷-3,17-二酮)和5a-T（17b羟基-5a-雄甾烷-3-酮），涉及的D1KSTD3-脱氢酶（3-酮-5a-甾体-D1-脱氢酶），具有对饱和A环实现1,4-脱氢的能力（3-酮-a-甾体-D4-脱氢酶，KST4D）；虽然KSTD3和KST4D已经发现在100个细菌样本中仅24个样本具有两者酶的同源性。仍然很有必要深入研究，因为全基因组序列和转录组序列研究手段可提供更多可能性。它对于开发我国南方蕃剑麻薯蓣（A环饱和化）战略资源具有重要性。

胆固醇分解代谢图示

参考文献[References]

[1] Donova MV,Egrova OV.Microbial steroid transformation:current state and prospects[J].Appl Microbiol Biotechnol,2012,94:1423-1447

[2] Van der Geize R,Yam K,Heuser T.A gene cluster encoding cholesterol catabolism in soil actinomycete provides insight into Mycobacterium tuberculosis survival in macrophage[J].PNAS,2007,104(6):1947-1952

[3]  Knol J,Bodewits K,Hessels G.3-keto-5a-steroid-D1-dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis SQ1 and its orthologue in Mycobacterium tuberculosis H37Rv are highly specific enzymes that function in cholesterol catabolism[J].Biochem J,2008,410,339-346

[4] Capyk JK,Casabon I,Gruninger R.Activity of 3-ketosteroid 9a-hydroxylase(KshAB)indicates cholesterol side chain and ring degradation occur simultaneously in Mycobacterium tuberculisis[J].J Biol Chem. 2011,1286(47):40717-40724

[5] 杨亚力，杨顺楷，吴忠柳.偶发分枝杆菌发酵断甾醇侧链积累9a- 羟基雄烯二酮[J].应用与环境生物学报，2015,21（2）：256-262

[Yang YL,Yang SK,Wu ZH. Development of 9a-hydroxy-andronst-4-ene-3,17-dione (9a-OH-AD)through cleaving sterol side chain by fermentation of Mycobacterium fortuitum [J].Chin J Appl Environ Biol.2015,21(2):256-262]

[6] 杨顺楷.放线菌目2菌株胆固醇分解代谢研究新进展及其工业应用前景 [EB/OL].中国科学网，2023-6-14[Yang SK.A nove advance of cholesterol catabolism for two strains of actinomycete and its prospects of industrial application[EB/OL].blog.sciencenet.cn,2023,-6-14].

[7] Fernander DH,Van der Geize R,Drzyz GA.Molecular characterization of the three 3-ketosteroid-D1-dehydrogenase isoenzymes of Rhodococcus ruber strain Cholo-4[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2012,132,(3-5):271-281

[8] Zhang R,Liu X,Wang Y. Identification of function and application of 3-ketosteroid D1-dehydrogenase isozymes in Mycobacteriu neoaurum DSM 1381 for the production of steroidic synthons[J].Microb Cell Fact,2018,17(1):77-

[9] Yu W, Rui Z, Jinhui F,Qiaqing Wu.A new 3-ketosteroid-D1-dehydrogenase with high activity and broad substrate scop for efficient transformation of hydrocortisone at high substrate concentration{J}.Microorganisms,2022,10,508.hppts//doi.org./10.3390//micriorganisms 10030508

[10] Liu XC, Zhang JX, Yuan CY. Improving the production of 9a-hydroxy-4-androst-4-ene-3,20-diene from phytosterol by 3-ketosteroid D1-dehydrogenase deletions and mutiple genetic modifications in Mycobacterium fortuitum [J].Microb Cell Fact,2023,22:53

[11] Yuan CY,Ma ZG,Li YX. Production of 21-hydroxy-20-methyl-pregna-1,4-diene-3-one by modifying multiple genes in Mycobacterium[J].Appl Microb Biotechnol,2023,107(5-6):1563-1574

[12] Yuan CY,Li YX,Han XW. Functional analysis of acyl-CoA dehydrogenases and their application to C22 steroid production[J].Appl Microb Biotechnol,2023,107:3419-3428

[13] ZhangJX,Zhang RJ,Song SK.Whole-Genome analysis of Mycobacteriu neoaurum DSM 1381 and validation of two key enzymes affecting C22 steroid intermediates in sterol metabolism [J].Int J Mol Sci,2023,24:6148

[14]袁家代，陈贵英，程世君，葛方兰，王琼，李维，李江. 3-甾酮-9a-羟基化酶基因在分枝杆菌中的异源表达与9a-羟基雄烯二酮的制备[J]. 生物工程学报，2015，31（4）:523-533

[Yuan JD, Chen GY, Cheng SJ, Ge FL, Wang Q, Li W*,and Li J. Accumulation of 9a-hydroxy-4-androstene-3,17-dione by co-expresion kshA and KshB  enconding compolent of 3-ketosteroid-9a-hydroxylase in Mycobacterium sp. NRRL B-3805[J].Chin J Biotech,2015,31(4):523-533

[15].Oppermann U,Filling M. Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR):the 2002- update[J].Chemico-Biological Interactions,2003,143-144:247-253

2023-08-29 初稿于成都磨子桥

2024/2/08 修改稿于华西坝园区

附件；胆固醇分解代谢图示