代谢学人

Nature Cell Biology：内质网要应激，相分离“搬救兵”

撰文 | 刘梓棋 郭钰涵 李姿萱 李章燕 周文豪 邱瑾

编辑 | 孟美瑶

校对 | 李姿萱

 背景介绍

为了应对破坏细胞蛋白稳态的外部威胁，真核细胞采用不同的应激反应机制来维持稳态。细胞内近三分之一的蛋白质在内质网 （ER）折叠和成熟（小编注：真核细胞中的蛋白质翻译加工主要有两条途径：一条是信号肽引导的内质网-高尔基体途径，即分泌途径，也就是文中提到的途径；另一条是游离核糖体途径。前者包括分泌蛋白、膜蛋白和溶酶体蛋白，后者主要是胞浆蛋白、核蛋白和一些细胞器蛋白。分泌途径的加工主要在内质网完成，而另一条途径是在游离核糖体上完成翻译，然后被特异定位标签引导进入线粒体、过氧化物酶体及细胞核等处，没有标签的就留在胞浆。一般认为，游离核糖体与内质网上的核糖体并无不同，只是新生肽链中没有信号肽，不能被信号识别颗粒引导到内质网），未折叠/错误折叠的蛋白在内质网腔内过度积累会引发内质网应激，激活未折叠蛋白反应(UPR)。UPR主要通过三个信号蛋白发挥作用，即IRE1α（肌醇需求蛋白-1α）、PERK（蛋白激酶RNA样ER激酶）和ATF6（激活转录因子6）。PERK和ATF6通过与内质网常驻伴侣蛋白BiP结合以调节UPR，而IRE1α则直接与未折叠蛋白结合而被激活，从而激活UPR，维持内质网功能和细胞代谢稳态。IRE1α是一种跨膜蛋白，具有Ser/Thr蛋白激酶和核糖核酸内切酶（RNase）活性。内质网中未折叠蛋白的累积促使IRE1α在内质网膜上发生二聚化，并通过自身磷酸化激活其RNase活性。IRE1α的RNase活性可以催化XBP-1（X-box 结合蛋白-1）mRNA的剪接，生成具有活性的转录因子XBP-1s。研究发现内质网应激状态下，IRE1α被激活并诱导胞浆中的XBP-1 mRNA形成剪接形式的XBP-1s，通过直接与ERSE（内质网应激响应元件）相互结合，进一步增强内质网伴侣蛋白基因的转录，以应对内质网应激；另外，其RNase活性还可选择性降解mRNA，这一过程称为RIDD（IRE1α依赖性调节降解）。 

有研究表明，内质网应激可促进IRE1α活化，并诱导IRE1α形成大型凝聚物结构。而最近的超分辨率显微镜研究清楚地发现，IRE1α形成的凝聚物具有复杂的拓扑结构，既不对称也不均匀，并且团簇中央还有约束其扩张的核心，这表明IRE1α形成的凝聚物可能不是经典的相分离结构。有文献表明，当内质网产生应激时，细胞内就会产生小的IRE1α凝聚物，随后便通过融合产生更大的凝聚物，此外IRE1α形成的凝聚物移动能力很强（小编注：可以利用光漂白-恢复实验 （FRAP）去证明其移动能力。FRAP实验原理是在显微镜的选择区域中采用脉冲的高强度激光将该区域漂白，然后观测该区域随时间推移荧光恢复的动力学过程），而移动能力与凝聚物的大小无关，这表明IRE1α凝聚物可能与其他亚细胞结构之间具有相互作用。此外，有研究表明，内源性的人IRE1α在正常条件下以二聚体的形式存在，在内质网应激的情况下会形成小的凝聚物，但不会进一步形成大型凝聚物。因此，大型IRE1α凝聚物的组装是否受到细胞内特定应激信号通路调节，目前还不清楚。 

细胞内生物分子凝聚物的组装通常通过液-液相分离(LLPS)形成，在控制RNA代谢、基因调控和细胞内信号传导等多种生化过程起着重要作用。应激颗粒(SGs)为信使核糖核蛋白(RNP)颗粒，是典型的细胞质凝聚物，可以通过LLPS快速组装以响应内质网应激、热休克(HS)、氧化应激或渗透应激等蛋白质毒性环境。当细胞处于应激状态时，eIF2α被磷酸化，从而抑制翻译的起始，进而启动SG的组装。组装过程主要涉及无核糖体结合的mRNAs和RNA结合蛋白之间的相互作用。在高分辨显微镜下的SGs具有层状结构，中央是稳定的核心结构，周围是动态的相分离壳。值得注意的是，在诸如SGs此类的RNP颗粒中观察到了大量含有内在无序区域(IDR)的蛋白质，可以为相分离提供分子间的多价相互作用。IDR通常富含极性或带电氨基酸，如丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)或谷氨酸(E)。最近有研究表明，RNA结合蛋白G3BP1/G3BP2是SG核心结构的关键组成成分，G3BP1的三个不同的IDR构成了一个分子开关，用于触发SG成分的相分离。虽然SG的形成在调节应激反应和细胞适应性方面起着关键作用，但异常的SG组装和拆卸可能与蛋白质聚集性疾病（特别是神经退行性疾病）有关。 

本篇文章中，研究人员主要探究SG的形成与UPR（特别是与IRE1α大型凝聚物）之间的关系，发现SG的形成是IRE1α凝聚物成型的基础，提高了XBP1 mRNA剪接的效率和细胞处理应激状况的能力。

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UPR因子PERK和ATF6

PERK属于eIF2α蛋白激酶家族成员，和lRE1α类似，是位于ER的I型膜蛋白，N端感受ERstress信号。在内质网应激的过程中，BiP从PERK管腔结构域解离，PERK被活化，特异性地磷酸化eIF2α，抑制蛋白翻译而选择性的促进内质网应激相关基因的转录。

ATF6是位于ER的膜蛋白，以单体和二聚体的形式存在于内质网中，具有分子内和分子间的二硫键，与内质网伴侣BiP结合。内质网应激促进ATF6二硫化物的减少和BiP的解离，增加ATF6单体数量。之后，这些单体运输到高尔基体，在那里它们被位点1（S1P）和位点2（S2P）蛋白酶处理，使其定位于细胞核并诱导主要参与内质网质量控制系统（ERQC）的应激反应基因的表达。

参考文献：[1] Wiseman, R Luke et al. Molecular cell vol. 82,8 (2022): 1477-1491.

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SG层状结构图

SG结构主要包括蛋白质和RNA，核心结构蛋白和RNA浓度较高且稳定，而周围的浓度较低，下图是通过随机光学重建显微镜拍摄的SG结构，可以看到核心结构密度高而周围结构密度较低。

参考文献：[1] Jain, S. et al. Cell. 2016 Jan 28;164(3):487-98.

敲黑板啦！

1. IRE1α凝聚物可以在不同应激情况下与SG共定位 

2. IRE1α在ER处与SG动态结合 

3. IRE1α的细胞质连接结构和LD结构决定了IRE1α与SG的共定位 

4. SG的形成调控IRE1α的活性和凝聚能力 

5. SG凝聚体可提高IRE1α的调控效率肝源性EVs可增加葡萄糖耐受能力，并促进胰岛素分泌

研究结果

1. IRE1α凝聚物在不同应激情况下均可与SG共定位

为了探究IRE1α凝聚物与SG之间的关系， 研究人员使用内质网应激物毒胡萝卜素（Tg）处理Hela细胞并进行免疫荧光（IF）染色，发现ER应激的细胞中出现了0.5-5um大小的IRE1α凝聚物，含IRE1α凝聚物的细胞比例随着Tg处理时间的增加而增加，在Tg处理3小时之后达到了峰值（图1a，b，辅图1a）。值得注意的是，SG核心组分G3BP1与IRE1α的共染显示，SG和IRE1α凝聚物在细胞中的定位几乎完全一样（图1a，b）。

由于SG可以响应多种应激，为了进一步探究IRE1α和SG响应其他应激源的机制，研究人员使用了亚砷酸钠(SA)和HS（小编注：43℃处理1h）两种条件处理Hela细胞发现，在这两种应激情况下，IRE1α凝聚物的数量更多，并且IRE1α凝聚物和SG都能很好地共定位（辅图1b，图1c）（小编注：1c中箭头指示的直线的荧光强度对应图1c右侧荧光分布曲线图）。对不同应激条件下IRE1α凝聚物和SG共定位的情况进行定量发现，与Tg诱导的内质网应激相比，SA和HS处理的细胞中IRE1α凝聚物和IRE1α-SG共定位的百分比和数量都更高(图1e和辅图1b)。与此一致的是，使用SG的另外一种支架蛋白TIA1和IRE1α进行共染，也观察到了类似的结果（辅图2a-c）。此外，在这些应激情况下，其他细胞系如小鼠胚胎成纤维细胞和HEK293T细胞中也出现了IRE1α凝聚物和SG共定位的现象（辅图2d，e）。然而，在应激情况下，研究人员并未检测到PERK蛋白（不含IDR结构）和ATF6α（N端含有大量无序结构）与SG的共定位。以上结果表明，大型IRE1α凝聚物的组装与SG形成有关，并且这种现象在各个细胞中都存在。为了探究生理相关应激条件下IRE1α凝聚物和SG的功能，研究人员选择了缺氧和葡萄糖剥夺两种条件处理Hela细胞。结果发现，在缺氧条件下，研究人员并未观察到大型IRE1α凝聚物和SG的组装，而在葡萄糖剥夺的条件下，研究人员在细胞中检测到了IRE1α凝聚物和SG的共定位（辅图3b），并且在葡萄糖剥夺的前提下再加入糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）会进一步促进细胞中IRE1α凝聚物和SG的共定位（辅图3c）。这些数据表明，IRE1α凝聚物和SG的共定位也可以响应营养和代谢应激反应，这可能是由内质网蛋白折叠的扰动引起的（小编注：文献中提示缺氧会引起内质网应激，也会驱动UPR反应，其可能是通过直接促进XBP1表达介导的。Chen X, et al. Nature. 2014.）。

为了进一步寻找IRE1α和SG结合的证据，研究人员裂解了应激的细胞，并进行了差速离心，分离出了可溶性的细胞质溶解物和不溶的含有SG的RNP颗粒（图2a）。WB结果显示，与对照组相比，在应激细胞的RNP颗粒（RG）组分中，SG的标志物G3BP1、TIA1和eIF4E显著富集，IRE1α和RNA连接酶RtcB（小编注：RtcB是一种参与XBP1剪接的重要的RNA连接酶）也显著富集（图2b，c）。相比之下，研究人员并未在应激细胞的RG组分中检测到内质网管蛋白PDI、Ero-1L和内质网膜蛋白Sec61A的存在或富集（图2b）。在避免破坏SG完整性的温和条件下进行免疫共沉淀，结果显示与对照组相比，在三种应激状态下，IRE1α免疫共沉淀物中，G3BP1、TIA1和eIF4E蛋白的含量均显著增加，RtcB连接酶的含量也显著增加(图2d,e)。综上所述，在应激条件下，IRE1α与SG组分的相互作用更强，同时IRE1α中RtcB连接酶的富集程度更高。

图1. IRE1α可与SG共定位响应不同应激条件

图2. 应激条件下，IRE1α与SG组分的相互作用增强

辅图1. IRE1α在不同类型的应激反应中形成大凝聚物

辅图2. IRE1α凝聚物可在不同应激条件下与SG共定位

辅图3. 缺氧和葡萄糖剥夺对IRE1α凝聚物-SG共定位的影响

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 2. IRE1α在ER处与SG动态结合

为了研究应激Hela细胞中IRE1α凝聚物-SG共定位的动态特征和结构特点，研究人员通过免疫荧光实验发现，移除应激源之后，IRE1α凝聚物和SG的水平都降低（辅图4a-c），这表明IRE1α凝聚物和SG的解聚是动态相关的。此外，使用EGFP-Sec61β对内质网进行显色发现，在应激状态下，IRE1α凝聚物和SG共定位于内质网中，在细胞质中只有弥散的荧光信号（图3a）。通过对三种通道的荧光进行荧光线性分析发现，虽然IRE1α凝聚物-SG在内质网中共定位，但不与Sec61β共定位（图3a）。为了进一步探究IRE1α与核心SG支架蛋白的相互作用，研究人员使用二聚化依赖性荧光蛋白报告系统（小编注：即ddFP系统，该系统由基团A和基团B组成，其中基团A具有发色团，但只能够在与非荧光基团B结合时才能产生明亮的荧光）来检测不同实验组的荧光信号（图3b），结果发现，在应激状态下，G3BP1、TIA1能够结合在一起形成SG，并且形成的SG可以与IRE1α凝聚物共定位（图3c），进一步的实验表明，在应激状态下，G3BP1和TIA1也能够分别与IRE1α凝聚物共定位，以上结果表明，IRE1α凝聚物与SG之间的作用非常复杂。有趣的是，研究人员还发现在Tg诱导的内质网应激过程中，IRE1α凝聚物和G3BP1形成的复合物在不停地融合和分裂，这些结果表明，在内质网应激过程中，IRE1α凝聚物一直动态地与SGs结合在一起。

图3. IRE1α凝聚物与SG共定位的动态特性

辅图4. 应激恢复过程中IRE1α凝聚物与SG一同减少

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 3. IRE1α的细胞质连接结构和LD结构决定了IRE1α与SG的共定位

为了探究影响IRE1α与SG的共定位因素，研究人员构建了IRE1α不同结构突变体进行研究（图4a），结果发现，与对照组相比，在内质网应激的情况下，缺失细胞质连接结构的IRE1α_ΔL蛋白与SG蛋白的相互作用显著减弱，而缺失RNase的IRE1α_ΔR蛋白或激酶和RNase结构域二者都缺失的IRE1α_ΔKR蛋白与SG蛋白的相互作用没有发生改变(图4b)。研究人员使用ddFP实验发现，当IRE1α缺失细胞质连接结构时，IRE1α凝聚物与SG的共定位显著减少，而缺失其他结构则不影响IRE1α凝聚物与SG的共定位（图4c，d）。为了进一步证明IRE1α细胞质连接结构的重要性，研究人员构建了IRE1α-YFP和IRE1α_ΔL蛋白-YFP两种融合蛋白，并通过免疫荧光实验发现，当IRE1α缺失细胞质连接结构时，IRE1α凝聚物与SG的共定位显著减少（图4e）。以上结果共同表明，IRE1α的细胞质连接结构对IRE1α凝聚物与SG的共定位至关重要。有趣的是，IRE1α的细胞质连接结构具有IDR结构（图5a），富含大量谷氨酰胺（Q）和丝氨酸（S）残基，而这些残基在哺乳动物的IRE1α同源物中高度保守（图5b）。为了进一步确定该结构域在IRE1α相分离过程中发挥的作用，研究人员使用之前报道过的光遗传系统（小编注：之前的研究通过将目标蛋白IDR区域与光敏蛋白Cry2、mCherry（荧光指示作用）融合表达，Cry2在488nm蓝光刺激下会发生寡聚，提高融合蛋白的局部浓度，若目标蛋白的IDR有驱动相分离的能力，则会诱导融合蛋白在数秒内发生相分离。作者在先前的研究中，进行了固定optoIDR分子浓度改变蓝光功率，或固定蓝光功率改变optoIDR分子浓度的实验，观察相分离强度，得出了optoIDR 浓度是蓝光激活相分离形成的关键因素。Shin Y, Berry J, Pannucci N, Haataja MP, Toettcher JE, Brangwynne CP. Cell. 2017 Jan 12;168(1-2):159-171.e14.）进行了研究，发现在蓝光照射一分钟后，IRE1α _FL- mCh - CRY2在CRY2的寡聚化作用下可以形成小的凝聚物，而在蓝光照射三分钟后形成更大的凝聚物（图5d），而缺乏连接结构的IRE1α_ΔL-mCh-CRY2蛋白组装的小凝聚体和大凝聚体的数量显著减少（图5d）。这些结果表明，含有IDR的细胞质连接结构在IRE1α相分离过程中发挥了非常重要的作用。

之前有研究表明，IRE1α的LD结构域对IRE1α的寡聚化至关重要，为了探究LD结构域和IRE1α凝聚物与SG共定位之间的关系，研究人员构建了IRE1α_ΔLD-mCh-CRY2蛋白进行实验发现，与WT相比，缺失LD的IRE1α仍能聚集成凝聚物，但凝聚的速度较慢（辅图5a）。以上结果表明，即使缺失LD结构域，IRE1α的细胞质连接结构仍然可以在蓝光激活后驱动IRE1α产生相分离。接下来，研究人员通过ddFP实验发现，缺失LD的IRE1α与G3BP1的共定位水平显著降低（辅图5b），表明LD对IRE1α和G3BP1的结合非常重要。此外，研究人员发现，IRE1α中LD的缺失并不影响应激细胞中SG的形成（辅图5c）。这些结果表明，IRE1α的LD结构域对应激诱导的IRE1α寡聚化至关重要。

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IRE1功能结构域

IRE1是从酵母到哺乳动物中保存最古老的内质网应激传感器，具有一个N端18个氨基酸的信号序列（SS）、一个N末端内质网管腔结构域（NLD）（用于检测未折叠/错误折叠的蛋白质）、一个跨膜段（TM）、一个细胞质连接体、一个c端蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶（S/T）和一个核糖核酸内切酶(RNase)结构域。在内质网应激时，IRE1通过二聚化和自身反式磷酸化而被激活，导致其RNase活性被激活，从而催化XBP-1（X-box 结合蛋白-1）mRNA的剪接，生成具有活性的转录因子XBP-1s。其中 IRE1 N末端内质网管腔结构域（NLD）发挥了内质网应激传感器的作用，在正常情况下，IRE1通过NLD与内质网分子伴侣BiP（免疫球蛋白结合蛋白，也称为78 kDa葡萄糖调控蛋白Grp78）的相互作用以单体的形式存在，当内质网应激时，BiP会在未折叠蛋白质积累时与之解离，使NLD形成同源二聚体。NLD的二聚化反过来又会激活 IRE1 细胞膜结构域中的蛋白激酶和 RNase 活性。

参考文献：

[1] Siwecka N, Rozpędek-Kamińska W, Wawrzynkiewicz A, Pytel D, Diehl JA, Majsterek I.  Biomedicines. 2021 Feb 5;9(2):156. 

[2] Zhou J, Liu CY, Back SH, Clark RL, Peisach D, Xu Z, Kaufman RJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Sep 26;103(39):14343-8. 

图4. IRE1α的细胞质连接结构对IRE1α凝聚物与SG的共定位非常重要

图5. IRE1α的细胞质连接结构含有IDR，与IRE1α相分离有关。

辅图5. IRE1α的LD结构域也与IRE1α凝聚物的形成相关

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4. SG的形成调控IRE1α的活性和凝聚能力

为了研究IRE1α凝聚与SG形成之间的相互关系，研究人员使用不同应激条件处理Hela细胞发现，敲除IRE1α并不影响细胞中SG的形成（辅图6a）。此外，在敲除IRE1α的Hela细胞中进行ddFP报告实验发现，敲除IRE1α的Hela细胞中的SG与钙结合蛋白CaIN（小编注：CaIN为内质网标志蛋白）的共定位情况与WT细胞无显著差异（辅图6b），说明IRE1α的缺失既不会影响SG的形成，也不会影响SG与内质网的共定位。

为了进一步探究SG的形成与IRE1α凝聚的作用，研究人员使用环己亚胺（小编注：CHX，可以通过稳定多聚核糖体从而抑制SG的形成。SG是植物和动物细胞在受到环境应激时细胞质中出现的相致密颗粒，是由mRNA和RNA结合蛋白组成的无膜细胞器。细胞应激通常会引发核糖体停滞，触发核糖体质控系统，降解多聚核糖体，导致细胞质中出现无核糖体结合的游离的mRNA，进而形成 SG，因此抑制多聚体解体能够抑制 SG 的形成。另一方面，eIF2能够和GTP及起始密码子tRNA-MET形成异三聚体并结合至核糖体40S亚基上启始翻译，内质网应激会磷酸化eIF2α，eIF2α的磷酸化会抑制翻译的起始，使核糖体从 mRNA上脱落，同时在哺乳动物细胞中eIF2α 的磷酸化会启动SG 的组装，这些脱落的mRNA被募集到 SG 上。当mRNA离开SG时，翻译会重新启动。因此，细胞应激可从上述两个方面影响SG的形成。参考文献：Kedersha N, Cho MR, Li W, Yacono PW, Chen S, Gilks N, Golan DE, Anderson P.  J Cell Biol. 2000 Dec 11;151(6):1257-68. Mateju D, Eichenberger B, Voigt F, Eglinger J, Roth G, Chao JA. Cell. 2020 Dec 23;183(7):1801-1812.e13. ）处理细胞，发现抑制SG的形成能够显著抑制IRE1α的凝聚（图6a，b）。对分离出来的RG（小编注：RG是RNP granule，即核糖核蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）颗粒，RNP是细胞内的一类光镜下能看到的RNA-蛋白质组装体，一些RNP颗粒作为细胞的组成成分存在于细胞中，包括胞质处理体（P小体）、TIS小体、胞质U小核RNP（snRNP）体（U小体）、核Cajal小体、核仁、核小点（nuclear speckles）和核旁斑（paraspeckles）等，一些RNP颗粒在翻译抑制或者核糖体逃逸时形成，比如应激颗粒（SG）和P小体。参考文献：Ripin N, Parker R. Cell. 2023 Oct 26;186(22):4737-4756. ）进行WB实验显示，CHX处理293T细胞显著降低了RG中IRE1α和SG组分的含量（辅图7）。相比之下，嘌呤霉素（Puro）会抑制蛋白质的翻译，并通过破坏多聚核糖体来促进SG的形成，进而促进IRE1α的凝聚（辅图8a），而IRE1α抑制剂KIRA6和RNase抑制剂4μ8C（小编注：可抑制IRE1α的RNase活性）并不影响IRE1α凝聚物和SG的共定位（辅图8a）。随后，研究人员探究了IRE1α凝聚物与SG共定位对XRP1 mRNA剪接水平的影响，发现当CHX或吐根碱（小编注：作用与CHX类似，可通过稳定多聚核糖体抑制SG的形成）处理细胞后，细胞中IRE1α凝聚物与SG共定位减少，XBP1 mRNA剪接水平减少，而使用嘌呤霉素处理细胞后，细胞中IRE1α凝聚物与SG共定位增加，XBP1 mRNA剪接水平增加，但由于Puro抑制了蛋白质的翻译，所以XBP1的蛋白水平没有变化（辅图8b，c）。此外，使用综合应激反应抑制剂ISRIB处理细胞发现，不同应激条件下细胞中的SG水平、IRE1α凝聚物水平、IRE1α凝聚物和SG的共定位水平均显著降低（小编注： ISRIB处理会逆转 eIF2α 磷酸化进而抑制包括ERS在内的综合应激反应，这会导致SG形成减少；因此，ISRIB处理后即SG形成减少后，IRE1α凝聚物水平、IRE1α凝聚物和SG的共定位水平均显著降低，表明IRE1α凝聚物的形成受到SG的调控，与SG的形成有密切联系）（辅图8d，e）。综上所述，IRE1α凝聚物的形成受到SG的调控，与SG的形成有密切联系。（小编注： ISR是一种保守的反应网络，其作为信号中心调控网络，可以对发生在内质网和细胞浆中的应激作出反应，主要以控制蛋白质合成速率、停止新生蛋白质合成以促进起始应激的解决并恢复细胞内稳态，蛋白质稳态失调、营养缺乏、病毒感染和氧化还原失衡均可诱导ISR。ISR的核心是eIF2 α亚基的磷酸化，通过四种eIF2α激酶HRI（EIF2AK1）、PKR（EIF2AK2）、PERK（EIF2AK3）、GCN2（EIF2AK4）来调节eIF2α磷酸化，从而激活ISR，抑制整体的翻译，但增加了特定的转录因子的翻译，如CHOP、ATF4和ATF5。eIF2 α激酶被激活后均可引发ISR，eIF2 α发生磷酸化，多聚核糖体解体，导致细胞质中出现无核糖体结合的游离的 mRNA，促进 SG的形成。综合应激反应ISR包含了多种细胞应激情况，其中也包括ERS，如ERS可激活PERK，PERK是UPR三个信号转导因子之一，也是ISR的上游激酶。 ISRIB是一种有效的综合应激反应抑制剂，可有效逆转 eIF2α 磷酸化的作用，进而抑制综合应激反应，恢复mRNA翻译并诱导SG快速解体。Zhang G, Wang X, Rothermel BA, Lavandero S, Wang ZV. Cell Death Differ. 2022 Apr;29(4):750-757. ）

为了进一步探究SG的形成对IRE1α凝聚的影响，研究人员构建了两个G3BP1和G3BP2共敲除的细胞系，即G3BP1/2-dKO#1和G3BP1/2-dKO#2，并通过对SG另一个核心组分TIA1进行免疫荧光染色，证实了G3BP1/2-dKO的细胞系不能生成颗粒状的SG（辅图9a）。研究人员发现，在不同应激状态下，G3BP1/2-dKO细胞中都没有观察到SG和IRE1α凝聚物生成（图6c，d，辅图9b，c），这进一步证明了SG是IRE1α凝聚物形成的先决条件。

为了进一步探究SG形成对IRE1α功能的影响，研究人员使用Phos-tag凝胶（小编注：聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)技术，用于分离蛋白质和寡核苷酸。其中蛋白质分离最常用的是变性电泳，在电泳胶中加入离子表面活性剂和强还原剂（SDS，即十二烷基硫酸钠），故被称为SDS-PAGE。Phos-tag凝胶是在SDS-PAGE的基础上加入Phos-tag变为Phos-tag SDS-PAGE，而Phos-tag是一种专门捕获磷酸基团的功能分子。Phos-tag SDS-PAGE是一种磷酸亲和电泳技术，可使用常规SDS-PAGE程序分离磷酸化和非磷酸化蛋白质。该技术使用分离凝胶，其中丙烯酰胺与作为磷酸捕获分子的Phos-tag Acrylamide共聚。试剂、蛋白质样品制备和电泳操作与常规SDS-PAGE程序相似。由于磷酸化蛋白质在电泳过程中与固定在凝胶中的Phos-tag表现出可逆结合，因此它们的迁移速度比非磷酸化蛋白质的迁移速度更慢，从而导致磷酸化蛋白质的迁移率存在可检测的差异。Phos-tag SDS-PAGE不仅可以分析Ser-、Thr-和 Tyr-磷酸化蛋白，还可以分析参与双组分信号系统的不稳定His-和 Asp-磷酸化蛋白。因此，该技术适用于对具有不同磷酸化状态的蛋白质进行定量和定性分析的作用）对不同应激细胞中的蛋白进行分析发现，Tg和HS两种应激条件下，IRE1α的自磷酸化水平增加（图6e），IRE1α剪接XBP1 mRNA的效率提高（图6f）。而SA处理细胞既不会诱导IRE1α自磷酸化，也不会提升IRE1α剪接XBP1 mRNA的效率（图6e，f）。有趣的是，在Tg和HS条件下，与WT细胞相比，G3BP1/2-dKO细胞中IRE1α的自磷酸化水平没有受到影响（图6e），但XBP1 mRNA剪接水平(图6f)、XBP1蛋白量及其XBP1的靶基因表达水平(扩展数据图9d-f)都显著降低。为了进一步探究IRE1α凝聚物和SG共定位对应激状态下细胞存活的影响，研究人员对不同处理条件下的细胞进行了台盼蓝染色，发现与WT细胞相比，G3BP1/2-dKO细胞在三种应激状态下的死亡率都显著上升，而在Tg和HS两种应激条件下过表达XBP1可以降低G3BP1/2-dKO细胞的死亡率，但在SA条件下过表达XBP1对细胞存活率没有影响（图6g，辅图9g）。综上所述，SG的形成可以促进IRE1α的凝聚，并增强IRE1α的功能，提升细胞在各种应激条件下的存活率。（小编注：研究显示秀丽隐杆线虫的IRE-1在体内易被SA产生的ROS亚磺酰化（IRE-1：SOH），会抑制IRE-1磷酸化(参考文献：Hourihan JM, et al. Mol Cell. 2016;63(4):553-566.)；因此SA是促进IRE-1亚磺酰化，而TG/HS促进IRE-1磷酸化。这在Phos-tag SDS-PAGE中就表现为加入SA观察不到IRE1α自磷酸化。然而SA,TG，HS都会引起内质网应激，启动SG快速组装，进而IRE1也结合到SG上形成聚集簇，所以可以观察到三种处理下IRE1和SG的共定位增加（这因为SG增加所引起），且均会引起G3BP1/2-dKO细胞的死亡率增加， 但SA处理组过表达XBP1并未改善死亡率，表明SA处理并非通过磷酸化IRE1-XBP1通路介导应激反应）

为了排除G3BP1/2双敲除对细胞自身造成的其他非特异性影响，研究人员在用Tg处理 G3BP1/2-dKO细胞前，恢复了细胞中G3BP1和G3BP2的蛋白水平，发现恢复细胞G3BP1和G3BP2的蛋白水平之后，细胞中重新出现了IRE1α凝聚物和SG的共定位，XBP的蛋白水平也恢复了正常，细胞存活率显著增加（辅图10a-c）。有研究表明，UBAP2/UBAP2L可以调控G3BP1和G3BP2的表达，研究人员构建了UBAP2/UBAP2L-dKO的细胞，发现在不同应激条件下，IRE1α的凝聚功能明显受损（辅图10d，e）。之后，研究人员通过使用米托蒽醌（小编注： RNA 结合蛋白 TDP-43 与 mRNA 加工和从细胞核转运到细胞质相关。TDP-43 定位于细胞核，并在细胞质凝聚物（例如应激颗粒）中积累，有助于驱动生物分子凝聚物的形成，而米托蒽醌可以抑制活细胞SG中TDP-43的积累，从而抑制SG的形成。参考文献：Fang MY, et al. Neuron. 2019;103(5):802-819.e11. ）处理细胞，进一步证明了直接抑制SG的形成能够阻断IRE1α的凝聚，降低XBP1蛋白的水平（辅图10f-h）。以上结果表明，SG的形成调控了IRE1α的活性和凝聚能力。

拓展阅读

SG（应激颗粒）

应激颗粒 （SG）主要由mRNA、RNA结合蛋白等组成，是真核生物细胞内一种特殊的无膜聚集体，也是细胞内主要的mRNA核糖核蛋白颗粒（mRNA ribonucleoprotein，mRNP）。这些结构通过液-液相分离形成，具有多种功能，通常在初始应激得到缓解后迅速分解。如应激时期的转录后调控和mRNA的稳定，隔离特定信号分子抑制细胞死亡，抗病毒反应等。应激颗粒在细胞应激期间以高度协调的方式快速组装，然后在压力缓解后立即溶解。荧光显微镜发现SGs及其分子成分为TIA-1、TIAR和多聚腺苷酸化mRNA等，转录组学和蛋白质组学进一步分析显示SG包含数百种独特的蛋白质和数千种mRNA。细胞应激发生后，SG快速组装，具体为通过激活综合应激反应 （ISR） 进行mRNA翻译停滞，导致多聚核糖体分解，从而将大量未结合的 mRNA 释放到胞质中并动态掺入 SG，进而形成SG并维持其的稳定 。SG组装过程还会由新可用的mRNA与RNA结合蛋白（RBP）之间的许多弱多价相互作用的累积效应以及蛋白质-RNA相互作用而催化。应激缓解后，SG 走向分解途径，主要包括由解聚集酶以及自噬（ULK1/2、C9orf72 和 SQSTM1）、分子伴侣（例如HSPB8-BAG3-HSP70 复合物）及泛素化降解途径等参与。

参考文献：[1] Millar SR, et al. Chem Rev. 2023;123(14):9036-9064

图6. 抑制SG形成会阻断IRE1α的凝聚并降低其活性

辅图6. 缺失IRE1α不影响SG的形成以及SG与内质网的共定位关系

辅图7. CHX可以抑制SG的形成，并降低RG颗粒中的IRE1α水平

辅图8. Puro，IRE1α抑制剂，RNase抑制剂和ISR抑制剂对于IRE1α凝聚物和SG共定位的影响

辅图9. 抑制SG形成会阻断IRE1α的凝聚并降低其活性

辅图10. IRE1α的凝聚需要SG的形成，IRE1α凝聚可增强其RNase功能

5. SG凝聚体提升IRE1α的调控效率

为了探究IRE1α凝聚物和SG的共定位进一步促进IRE1α活性的分子机制，研究人员使用邻近标记技术，构建了C端融合抗坏血酸过氧化物酶2 (APEX2)模块的IRE1α分子，以标记可能与IRE1α相互作用的蛋白质（图7a）（小编注：在生物素-苯酚存在的情况下，使用过氧化氢处理活细胞1min，APEX可以催化生物素-苯酚氧化并释放出寿命极短的生物素-苯氧基自由基，该自由基可以共价结合APEX附近的蛋白质，随后可使用链霉亲和素珠富集蛋白质并通过质谱鉴定蛋白或进行其他实验）。链霉亲和素定向IF染色显示，在Tg条件下，WT细胞中生物素信号、IRE1α凝聚物和SG的共定位水平增强，而在G3BP1/2-dKO细胞中没有观察到这种现象（图7b）。使用链霉亲和素珠富集蛋白质之后进行WB实验发现，在应激情况下，G3BP1，TIA1和RtcB的生物素水平显著提高（图7c），表明这些蛋白在应激条件下与IRE1α存在共定位情况。此外，与WT细胞相比，在G3BP1/2-dKO细胞使用链霉亲和素珠富集的蛋白质中，RtcB蛋白水平显著减少（图7c）。有趣的是，在非应激状态下，在WT细胞使用链霉亲和素珠富集的蛋白质中也能检测到较高的G3BP1、TIA1和RtcB蛋白水平，即便是在G3BP1/2-dKO细胞中，也能检测到G3BP1/2-dKO细胞中较高的TIA1和RtcB蛋白水平。以上结果表明，在正常情况下，IRE1α和SG相关组分可能就存在相互作用，有利于IRE1α和SG相关组分在应激状态下快速形成共定位的大型凝聚物。此外，在Tg处理的条件下，与WT细胞相比，G3BP1/2-dKO细胞中EGFP-RtcB蛋白与IRE1α-SG大型凝聚物的共定位水平显著降低（图7d）。

为了进一步探究IRE1α-SG凝聚物是否能招募XBP1 mRNA进行剪接，研究人员通过qPCR实验发现，在应激状态下，与WT细胞相比，从G3BP1/2-dKO细胞分离的RNP颗粒中，总XBP1 mRNA、剪接的XBP1 mRNA以及与SG相关的Ago3 mRNA均显著富集（图7e）。

为了探究IRE1α敲除的情况下，向细胞中的SG直接递送IRE1α的KR结构域能否重新恢复IRE1α剪接XBP1 mRNA的功能，研究人员构建了NTF2L – KR重组质粒并将其导入到细胞中（小编注：NTF2L为G3BP1 N端结构域，G3BP1的N端结构域可以介导G3BP1的二聚化并促进SG的组装），免疫荧光显示在ER应激的情况下，IRE1α敲除细胞中NTF2L - KR融合蛋白与SG共定位（图8a）。而使用FKBPF36M-KR重组质粒去处理细胞发现，尽管FKBPF36M-KR可以形成凝聚物，但是无法与SG共定位（图8a）（小编注：含有FKBP结构域的蛋白能在雷帕霉素的作用下与含FRB结构域的蛋白结合形成异二聚体，而将FKBP点突变Phe-36 → Met之后，含有FKBP结构域的蛋白可以自二聚化形成可逆的二聚体。但FKBPF36M-KR可自发无SG结合域，故不能进一步和SG共定位。而NTF2L-KR中，NTF2L为G3BP1 N端结构域，G3BP1又是SG标志分子之一，应激条件下NTF2L-KR与SG的G3BP1结合，从而定位到SG。因此FKBPF36M-KR可作为NTF2L – KR的阴性对照组）。在Tg条件处理之后，NTF2L – KR组的RNP颗粒中XBP1 mRNA高度富集，而FKBPF36M-KR组与对照组没有差异（图8b），进一步证明了IRE1α与SG共定位可以促进IRE1α的功能。

图7. IRE1α-SG凝聚物中存在XBP1 mRNA剪接组分的富集

图8. IRE1α与SGs结合可以形成一个工作站，以更有效地处理内质网应激

 总结  

在内质网应激的过程中，IRE1会被激活，并对XBP1 mRNA进行剪接，启动UPR的一个关键分支反应通路。本篇文章主要研究在哺乳动物细胞中，内质网膜可以发生相分离事件，形成IRE1α凝聚物，这个过程与SG的组装耦合。在不同的应激条件下，IRE1α可以通过其细胞质连接结构的无序区域与SG动态地共定位。此外，抑制SG的形成有效地破坏了IRE1α的凝聚，并削弱了IRE1α剪接XBP1 mRNA的能力。在应激状态下，IRE1α-SG凝聚物中存在IRE1α - XBP1途径相关组分的富集。本篇研究揭示了IRE1α – SG共定位时组装的相变机制，该相变机制增强了IRE1α的活性，从而实现更强的应激处理能力。（小编注：本文发现在无应激条件下就存在IRE1α-SG 相关蛋白存在相互作用，应激状态则会快速形成大型凝聚物响应应激刺激。但本研究并未说明SG组装后具体如何促进IRE1凝聚物形成，本文的研究结果也只说明了SG增加促进IRE1凝聚物形成以及共定位的增加。由相分离发生的驱动力即分子间相互作用力可进行一定的推测：1）首先在正常条件下IRE1α与SG 相关蛋白间就存在相互作用，但因局部浓度不高，尚不足以发生相分离形成凝聚体；2）然而，在应激条件下，SG形成的驱动力增强（即相关蛋白、RNA等组分局部浓度增加）进而使得SG与IRE1α间的相关作用水平增加，最终达到相分离所需条件，形成凝聚复合体）

 原文链接：https://www.nature.com/articles/s41556-024-01418-7