氢气抗氧化作用之人体试验证据【FRBM2024】

这是重量级证据，有三个原因：一是人体试验的证据，研究对37名受试者氢气吸入后立刻和24小时后血液中氧化应激指标进行分析。二是研究结果发表在国际自由基生物医学的会刊《自由基生物医学》杂志上。三是受试者属于平均年龄33岁的健康人（虽然是针对氧化应激相对高的受试者）。虽然氢气抗氧化已经研究了17年，但专门针对人类受试者进行专门分析的研究真不多，一般都是在进行其他研究中附带进行。

作者单位

阿拉伯联合酋长国阿吉奥米克斯医疗实验室

塞浦路斯国际大学医学院

阿拉伯联合酋长国精密健康临床实验室

研究亮点

1. 进行了氢气吸入对血液活性氧(活性氧)水平影响的评价。

2. 招募了37名参与者进行研究，并分成测试组和对照组。

3. 治疗后立即测量活性氧水平，并在24小时后再次测量。

4. 测试组显示出血液中活性氧水平的显著降低。

5. 研究结果表明，氢气吸入在减少氧化应激方面是有效的。

活性氧物种（活性氧）在生理过程中扮演关键角色。然而，活性氧与抗氧化剂之间的失衡倾向于前者会导致与多种病理状态相关的氧化应激。由于其独特的属性，包括卓越的渗透性和选择性抗氧化能力，氢气（H2）已成为一种重要的治疗剂。氢气吸入疗法（HIT）作为对抗氧化应激的有希望的策略而受到关注。

在这项随机对照研究中，我们旨在评估HIT在降低血液中活性氧水平的有效性。招募了37名活性氧水平升高（d-ROMs值>350 U.CARR）的参与者参加研究。参与者被分为测试组和对照组。测试组参与者接受了氢气吸入疗法，然后在治疗后立即以及24小时后测量他们的血液活性氧水平。他们的结果与未接受氢气吸入疗法的对照组参与者的结果进行了比较。测试组在治疗后显示出血液中活性氧水平的显著降低。这些发现表明氢气吸入疗法在减少氧化应激方面的有效性。

氢气吸入：每分钟供气量1447毫升氢气/723毫升氧气混合气，pem氢气发生器技术制备的氢气氧气混合气吸入机。吸入时间为60分钟。分别在吸入前，吸入后和吸入后24小时对受试者血液中氧化应激指标进行分析。

以下为全文，供类专业读者阅读。

1. 前言

氢气，作为宇宙中最丰富的元素之一，因其独特的特性而作为一种吸引人的治疗选择受到了广泛关注。作为最小和最轻的分子，氢气（H₂）表现出了显著的渗透性，能够轻松穿透细胞膜进入线粒体和细胞核等亚细胞结构。其高扩散性使得氢气能在各种组织和器官中发挥治疗作用。

活性氧物种（活性氧）是细胞代谢的自然副产品，包括超氧阴离子自由基（O₂•⁻）、过氧化氢（H₂O₂）和羟基自由基（•OH）。活性氧在许多生物过程中扮演着关键角色。我们的身体通过消耗抗氧化剂来对抗活性氧，以维持生理所需的活性氧量。在氧化应激条件下，活性氧与抗氧化剂之间出现失衡，被认为是许多病理状态的根本原因，包括哮喘、心血管疾病、炎症和某些精神健康障碍。长期的氧化应激可以诱导细胞和DNA损伤，可能导致器官功能障碍和疾病进展，最终导致细胞死亡。反应性氧代谢物衍生物（d-ROMs）测试越来越被认为是评估氧化应激标记的首选方法，特别是血浆有机过氧化物。

氢气被视为一种选择性抗氧化剂，能够清除有害的活性氧。氢气可以通过多种途径给药，如吸入氢气、口服摄入富含氢气的水、静脉注射富含氢气的盐水、氢气水浴或滴眼液。在这些给药途径中，吸入被发现是一种有效且快速的方法，特别是针对急性氧化应激。因此，氢气吸入疗法（HIT）正迅速成为一种新颖有效的治疗氧化应激影响的方法。氢气的影响在气体从系统中移除后可以持续更长时间。没有已知的酶能有效中和•OH。因此，•OH会非选择性地与生物分子反应。氢气充当还原剂，可以穿透细胞膜并中和对身体有害的活性氧，如•OH和过氧亚硝酸盐（ONOO−），同时对O₂•−和H₂O₂几乎无影响，从而保持它们的生理功能和内环境稳定性。文献回顾揭示了氢气疗法克服氧化应激的潜力。此外，HIT的效果已在许多疾病模型中得到证实，包括神经系统疾病、眼部疾病、肺部疾病和癌症。然而，这些研究集中在评估HIT对各种参数的影响，而不是血液活性氧水平。

因此，本研究的目的是评估HIT对血液活性氧水平的影响。参与者接受了筛查以确定他们的活性氧水平，只有那些表现出高水平活性氧（d-ROMs值大于350 U.CARR）的个体被纳入研究。

材料和方法

参与者和研究设计：在这项随机对照研究中，共有67名候选人接受了活性氧水平评估。在这些候选人中，30名d-ROMs值低于350 U.CARR的个体被排除在外。因此，剩余的37名d-ROMs值超过350 U.CARR的参与者被纳入研究，并随机分配到两个组：18名参与者组成了研究组（氢气组），而19名参与者组成了对照组。

由于缺乏安慰剂设备，该研究未能完全按照盲法协议执行。尽管如此，数据的收集和分析是在盲态条件下进行的。为了在这些程序中保持盲性，实验室技术人员和其他涉及过程的工作人员不知道参与者的组别。

该研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行，并获得了塞浦路斯国际大学伦理审查委员会的伦理批准（批准号：EKK23-24/008/11）。

2.2 氢气吸入治疗

分配到氢气组的参与者使用分子氢吸入设备H-2000（由韩国Hue Light Co. Ltd.制造）进行了一小时的氢气吸入治疗。根据制造商的规格，该设备每分钟产生1447毫升分子氢和723毫升氧气，纯度超过99.99%，压力为1巴。该设备通过聚电解质系统操作，利用质子交换膜（PEM）分离无菌蒸馏水并生成氢气。每位参与者使用新的无菌鼻导管进行吸入。相反，对照组没有接受任何氢气吸入治疗。

2.3 活性氧水平评估

氢气组的参与者在三个时间点测量了他们的活性氧水平：在一小时氢气吸入治疗前、治疗后立即以及治疗后24小时。同样地，未接受氢气吸入治疗的对照组参与者也在初始、一小时后和24小时后进行了活性氧水平评估。

使用FRAS5 -自由基分析系统和d-ROMs试剂盒（意大利H&D srl.）按照制造商的说明评估了活性氧水平。通过手指刺血收集约200微升血液样本，并测量血浆过氧化物水平。

d-ROMs测试基于Fenton反应，这是一个两步过程。首先，血浆样本中的氢过氧化物（ROOH）与反应介质中的铁离子（Fe2+, Fe3+）在酸性缓冲液中反应，生成烷氧基（RO•）和过氧基（ROO•）自由基。随后，这些自由基氧化反应介质中的烷基取代芳香胺，形成N,N-二乙基-对苯二胺自由基阳离子，其特征是粉红色。这种自由基阳离子的吸光度在505 nm处测量，与样本中的ROM浓度成正比。

d-ROMs结果以Carratelli单位（U.CARR）表示，其中1 U.CARR对应于0.08 mg的H2O2/100 mL。d-ROMs测试因其简单、快速、成本效益高、实用性和易于设置而被认可。

2.4 统计分析

所有统计分析均使用R软件（版本4.3.1）进行，这是一个开源的统计计算和图形环境。该软件由R统计计算基金会开发。

3 研究结果

3.1 参与者

氢气组参与者的平均年龄为33岁，年龄范围从25到45岁。相比之下，对照组个体的平均年龄为35.8岁，范围从22到48岁。这些差异在统计学上不显著，因为独立t检验得出的p值为0.247，超过了0.05的阈值。氢气组包括14名男性和4名女性，而对照组包括9名男性和10名女性。这些性别差异预计不会影响d-ROMs结果。

3.2 d-ROMs测试结果

氢气组和对照组的d-ROMs测试结果分别呈现在图1和图2中。数据清楚地显示，与吸入治疗前（T0）相比，氢气组参与者在氢气吸入治疗后1小时（T1）和治疗后24小时（T24）的d-ROMs值都显著降低。相比之下，对照组在一小时或24小时后的d-ROMs值没有显著变化。

图1. 氢气组在进行HIT前后的d-ROMs测试结果

图2. 对照组的d-ROMs测试结果

图3展示了氢气组参与者在一小时氢气吸入治疗结束后（R1）和治疗后24小时（R24）与基线d-ROMs水平相比的百分比降低情况。一小时氢气吸入治疗后记录的平均降低为15.0%，范围从-8.8%到39.7%，而24小时后记录的平均降低为23.3%，范围从4.5%到43.8%。观察到的24小时后的降低表明，氢气可能在停止气体暴露后对减少参与者的活性氧水平有持久效果。

图3. 氢气组d-ROMs的百分比降低

3.3 统计分析

图4展示了氢气组参与者在T0、T1和T24时间点氢气吸入治疗前后的交互箱形图d-ROMs值。

图4. 氢气组参与者的交互箱形图d-ROMs值

进行了配对样本t检验，比较了氢气组参与者在（T0 vs T1）和（T0 vs T24）的d-ROMs值，结果分别为（t统计量：3.79，p值：0.001458）和（t统计量：6.49，p值：0.000006）。两个p值都远低于0.05的阈值。这些发现表明，氢气吸入治疗后，活性氧水平有统计学上的显著降低，且在24小时点的降低比1小时点更明显。因此，这表明氢气吸入治疗可能对降低H2参与者的活性氧水平有显著且持久的效果。

进行了ANOVA测试，以比较氢气组和对照组在每个时间点（T0H2 vs T0Control）、（T1H2 vs T1Control）和（T24H2 vs T24 Control）的d-ROMs值，结果分别为（F统计量 = 7.61，p值 = 0.0092），（F统计量 = 0.05，p值 = 0.8196），和（F统计量 = 6.57，p值 = 0.0149）。这些发现表明，在氢气治疗前和治疗后24小时，氢气组和对照组之间的d-ROMs值存在统计学上的显著差异。然而，在氢气治疗后1小时未观察到显著差异。这表明氢气治疗对活性氧水平的影响在24小时后变得显著。

4. 讨论

在这项研究中，我们展示了氢气在降低血液活性氧水平方面的有效性。氢气减少活性氧的机制涉及多个过程。氢气可以通过气态扩散渗透细胞膜并到达胞浆、细胞核和线粒体，中和细胞结构内的有害活性氧如•OH和ONOO−。氢气作为有害活性氧分子的电子供体。例如，它通过以下化学反应清除•OH：

H₂ + •OH → H₂O + •H

•H + O₂⁻ → HO₂⁻

由于高激活能，氢气与•OH之间的反应速率相当低。尽管如此，中国学者Jin等人指出，血红蛋白中的铁卟啉催化了体内与氢气相关的反应。还有人提出，氢气选择性地清除•OH而不是其他活性氧，归因于•OH与其他活性氧相比体积较小。较小的体积促进了•OH和氢气穿透血红蛋白蛋白的多孔通道并与其中的铁卟啉发生反应。另一方面，Liu等人提出，氢气选择性地与最强氧化剂如•OH和ONOO−相互作用，这是因为它们与其他活性氧相比具有更高的反应性。

我们的研究展示了氢气对活性氧水平的影响在气体暴露停止后24小时变得显著。这种持续效应也在高氢水的管理中观察到，其中氢气对氧化应激的影响即使在患者停止饮用高氢水4周的洗脱期期间也依然存在。此外，Sano等人报告说，在猪身上单次吸入氢气一小时后，在静脉血中仍可检测到氢气。在气体暴露停止后系统中氢气的持续存在可能导致在24小时相比早期时间点出现更明显的累积效应。

这项研究受到了一些限制。参与者数量限于37人，将研究扩展到更大的样本量将提供更全面的数据。另一个限制是没有安慰剂装置；虽然呼吸空气的设备将是理想的，但无法获得与氢气吸入设备形状相同的类似设备。此外，由于成本限制，氢气吸入次数相对较少。尽管存在这些限制，研究仍然取得了统计学上的显著结果。然而，未来的研究应考虑进行更大参与者群体的研究，整合安慰剂设备，并增加吸入次数。

5.研究结论

这项随机对照研究表明，氢气吸入治疗（HIT）有效地减轻了氢气组参与者的活性氧水平。结果显示，治疗后24小时活性氧水平显著降低。这些发现表明，氢气吸入治疗是对抗氧化应激及其相关病理条件的有希望的治疗选择。