JAK-STAT signaling pathway(II)

George R. Stark是蛋白化学和酶学领域出身，后面他对细胞生物学和遗传学很感兴趣，是因为一个他们合成了一个天冬氨酸氨甲酰基转移酶（aspartate transcarbamylase）的小分子抑制剂（PALA），能够阻止哺乳动物细胞中嘧啶核苷酸的合成。在筛选的过程中，他们发现有一些经过突变的细胞，能够补偿这种抑制效应，并且发现了其中关键性的蛋白或酶。有一次他的朋友Ian Kerr和他聊起了IFN相关的研究，正是利用这个技术揭开了许多秘密。二人在1964年相识，一个是助理教授，一个是新入站的博士后。Ian在1970s中期发现了2',5'-oligoadenylates (2-5A)是在干扰素通路中的一个关键的第二信使，在病毒感染的细胞中通过降解RNA来抑制病毒的感染（Kerr, I.M. et al., 1977, Nature 268）。他们曾在一起工作有一年之久，共同研究关注这个神秘的2-5A系统。后来Stark回到自己的实验也曾坚持过一段时间，但更让他感兴趣的是细胞如何应答IFN的刺激。

突破传统，总是需要一些关键的人物和事件。这次出场的是Richard Friedman，当时他还是一名研究生，利用λ噬菌体文库技术分析了经IFN诱导表达的基因，利用cDNA探针筛选出一些ISGs，他也分析了基因上游的启动子区域，也看到了保守的ISRE，并且通过功能分析验证该区域的重要性。之后Stark与Ian开着了更为密切的合作，接下来的九年他们逐步揭示了这条依赖IFN的信号通路。第一个被关注的是IFN诱导的E因子，他可以结合在ISRE上。他们还发现E因子起初静静的待在细胞质中，经IFN-α刺激后，便快速的转移到细胞核中。这其中隐含着哪些分子机制？E因子是如何被激活的？历史总是惊人的一致，与前不久CRISPR的发现过程太相像了，因为这个时候Darnell利用生化的方法发现ISG3，而且这个“E factor=ISG3=STAT1+STAT2+IRF9（这个新成员算是现代科技的产物，发现的比较晚）”！怎么样？若在当时，应该是很令人激动的！

接下来Stark决定利用基因突变的办法筛选依赖IFN的信号通路中关键基因或因子，曾经抵抗PALA抑制的实验给他提供了许多经验，发现在有一些细胞经IFN的诱导后是发生死亡的，这样就可以通过打破这条通路，筛选活下来的细胞，再分析哪里发生了变化。可是具体的实验要如何进行呢？如何突变细胞中的等位基因？如何筛选突变后的克隆？在实验开始之前，他们做了一组预实验，发现这种随即突变的频率仅有10^-8，若是假设这条通路中有10个关键基因，那么能存活的细胞比率约为10^-7，还是比较低。他们想到一个报告基因的办法，将鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（guanine phosphoribosyltransferase, GPT）连接在ISRE的后面，这样就会方便的筛选出发生关键突变的克隆（实验设计在当时是很有趣的）。另一个博士后，Sandra Pellegrini用大量的事实证明了这个方法的可行性，只是需要长达数月的不懈努力才能筛选10⁸个克隆，对一位女士来说还是相当困难的！不过她坚持了下来，完成博士后，在Pasteur Insititue她继续了这项工作，最终在1992年7月发现了TYK2是这条通路中的一员。（Varinou,L., et al., 2003, Immunity）。

其实此时人们已经知道TYK2是酪氨酸激酶（tyrosine kinase, TYK）的另一个新的成员，但还不清楚她的底物究竟是什么。Andrew Wilks等人曾经在1989年和1991年相继发现两个TYK，这些蛋白与以往的激酶不太一样，他意识到这个蛋白有两个结构域，一个是正常的酶的激活结构域，另一个结构域也与激酶非常相似，只是在预测的酶活性结构中心发生了一个氨基酸的改变，曾让人误以为这个区域没有酶活性。正是这两个“奇怪的”结构域，有些像罗马神话中的两面神“Janus”，Wilks给这两个TYK起名为“Janus Kinase 1和2”，更有趣的是JAK也有双关的解释“Just Another Kinase”。

到了这里，后面的进展就比较快了，比如ISG3的活化是依赖JAK的，并且确定了STAT的“底物角色”。IFN-α刺激后，JAK1/2可以磷酸化STAT1/2，IFN-γ刺激后，JAK1/2可以磷酸化STAT1。（Muller, M. et al., 1993, Nature）很自然的人们会想到JAK可以非共价的结合在IFN的受体并且可以发生自身磷酸化，之后磷酸化并激活STAT。

大概一年的时间，截止到1994年人们已经发现了4个JAK和5个STAT（如今已发现7个成员）。比如Darnelllaboratory的团队用淋巴细胞cDNA文库克隆了STAT3和4，发现IL-6和EGF刺激后使得STAT3发生磷酸化，IL-2可以活化STAT4；几乎是同一时间，Tadamistsu Kishimoto的团队发现IL-6可活化STAT3，并且发现STAT3可结合到GAS元件；后面David Levy等人发现STAT3和STAT1算得上是“亲戚”，比较相近；Jim Ihle等人也同样克隆到STAT4等等，这就像是一片新领域，一次次被人们盯上，之后就会有接连不断的人力投入其中，直到最后没有太多新鲜而言，人们的开放才会有所放缓。

（From Annu. Rev. Med. 2015, 66:311-28）

后面人们围绕着JAK和STAT深入研究，发现了许多关键性的位点，已经知道具体发生磷酸化的酪氨酸，也开发出许多特异的实验技术和方法，也有人尝试该通路是否与其他通路相关联。对于其中太详细的信息我就没有兴趣再去纠结了，只是感觉做着做着就回到了分子水平，再到结构生物学上彻底解析其工作原理，现在我比较想知道是这条通路是如何和疾病联系起来的呢？如何能吸引众多制药公司的亲睐？比如Pfizer的JAK抑制剂Xeljanz上个月申请治疗类风湿性关节炎（RA）正在被EMA受理，口服JAK抑制剂Tofacitinib治疗溃疡性结肠炎的两个PhIII试验都获得了成功。在此领域Gilead和Lilly也参与了JAK抑制剂研制的角逐，去年年底Gilead宣布以20亿美元高价收购Galapagos公司JAK抑制剂filgotinib，Lilly的抗RA的药物baricitinib也顺利结束PhIII的试验等等。

（From Annu. Rev. Med. 2015, 66:311-28）

看着这套“简单”的信号转导通路，犹然觉得“简单”也是一种值得赞扬的生活态度，太多事情都是有诸多“简单”拼凑而成，而复杂也源自这些“简单”。起初IFN帮助人们发现了这套通路，如今已经知道她与多样的细胞因子、生长因子、集落刺激因子、激素等都有着密切的关系。通俗地说，这套通路影响着细胞的生长、增殖、分化，以及对环境的感知和应答。（是不是有种“基石”的感觉？）这也就理解为何她们与人类的疾病，尤其是癌症和免疫相关的疾病相关，临床上的现象和基因敲除等实验引导着一些力量关注这一新型的治疗靶点，她们就是JAKs和STATs。

JAKs and STATs with associated cytokines and phenotypes

（From Annu. Rev. Med. 2015, 66:311-28）

许多疾病与JAK/STAT的异常活性有关，首次发现她组成型激活的现象是在恶性肿瘤细胞中（Leonard WJ, O’Shea JJ. 1998. Annu.Rev. Immunol）。其实这套通路可以被许多因素激活，包括自分泌和旁分泌的细胞因子，激活突变的手提，JAKs或者其他上游能反相激活STAT的癌基因和本身可发生自激活突变的STAT等。比如骨髓增殖性疾病（myeloproliferative diseases,MPDs）（一般表现为红细胞增多Polycythemia vera、原发性血小板增多essential thrombocytosis和原发性骨髓纤维化primarymyelofibrosis）在1950s被报道，后来的基因序列分析发现在JAK2蛋白中发生了V617F的突变，这种突变在几乎所有患者中都有发生。这个突变发生在Pseudokinase Domain，而靶向此区域的JAK抑制剂便可缓解MPDs的症状；再如STAT3的SH2结构域中发生突变在40%的大颗粒淋巴细胞白血病（large granular leukemias）的患者中，30%的NK细胞淋巴增生性障碍（lymphoproliferativedisorders）的发生率；也有文章显示慢性骨髓白血病（Chronic myeloid leukemia）中的致癌基因BCR-Abl可导致组成型激活的TK。（虽说一些文章报道了STAT与疾病的发生有关，也有一些数据显示她也有预防疾病的作用）

Tofacitinib是首个被测试的JAK小分子化合物抑制剂（JAK inhibitors, Jakinibs），后来获得了FDA的批准，他选择性的抑制JAK3，有利于治疗免疫相关的疾病。因为JAK3比较有趣，JAK3缺陷并不影响与免疫不相关的器官和组织。（后来的研究显示她对JAK1也有抑制作用，对JAK2的影响并不大）Tofacitinib在临床上是实验对RA的安全性和效用是可以接受的，并且显示她在自身免疫系统混乱的疾病中的应用前景，比如牛皮癣（psoriasis）、银屑病性关节炎（psoriatic arthritis）、器官抑制排斥等疾病。Ruxolitinib是首个获得FDA批准的Jakinb，可抑制JAK1和2，Oclacitinib是光谱抑制JAK的抑制剂，前不久获得批准用于治疗犬类的过敏性皮炎（atopic dermatitis），虽说至今还没有应用于人类的研究，但他治疗炎症的效果却是不错，或许日后会有人用的药物上市。

JAK structure and inhibitor

（From Annu. Rev. Med. 2015, 66:311-28）

回首JAK/STAT通路，在发现之初我想没有人会想到如今关于她的应用如此广泛，对研究来说仅仅三十年多年的时间，对于一个人来说就是一辈子的研究。不过这里依然有很多疑问有待解决，如此保守的通路是如何调节细胞的生长和分化呢？这里面有很多细节需要被揭示，在临床试验中的结果预示着需要更为清楚的机制去研制Jakinibs。这让我想起了小分子抑制剂在科研中的另一个神奇的应用，就是Necroptosis的研究，记得2005年发现Nec-1的时候，是她开启了这片领域研究，是她让人们发现下游的RIP1， RIP3和MLKL等蛋白，是她补充了TNF受体的新功能，是她让人们看到细胞死亡的方式又多了一种。我想不久以后一样会看到更多关于JAK/STAT的新发现。上个月有篇文章介绍一个通路：CytoR/JAK/STAT/SOCS（CytoR, Cytokine Receptor；SOCS, Suppressor ofCytokine Signaling），本质是一条负反馈的信号调节，只是近期的研究也显示了她与一些疾病相关联，才渐渐的引起人们的重视，有人分析了该通路中各个成员的基因序列，提出这条通路可能在进化；FEBS也刊登了一篇揭示JAK/STAT在体内平衡作用的综述，越来越多的临床数据显示打破该平衡后有诱发肥胖和糖尿病中的风险，文章描述了Leptin与该通路之间的关系，让人不得不感叹科学为人类健康带来的好处，也不得不佩服搞基础研究的科学家一次次提出新鲜的分子机制。

这样的信号转导图已不在那样让我头疼，这就好比下班带孩子出门溜达：带上不同的食物、穿上不同的衣服、拿着不同的玩具，大概就知道这是溜达去公园、小区、超市、学校，这不过是一连串的“反应”。曾经我还觉得很神奇，为何抑制剂阻止如此通用的通路后对正常的组织和器官没有影响？其实这就是临床试验上需要分析的一个方面，首先要说明几个地方：通用，没错！只是疾病和正常的组织内使用的方式和频率不同，只是不同浓度的抑制剂所能表现的效果不同，只是有时不得不忍受一些毒副作用来换取延长的生命。

TJ Pharmaron

2016年4月19日星期二