进入三维超分辨：GB-STED

席鹏

2016-01-14

前面的博文里面我讲过了STED这一诺奖技术。该技术的核心是，用一束光制造一个空心光环----老外叫做”甜甜圈donut“（老外咋那么多吃货呢）。有了这个donut光，将它套在原来的高斯PSF上，利用受激辐射作为擦除机制，即可实现把荧光的PSF缩小，也就提高了分辨率。

问题是，要想实现空心光环，特别是要越小越好的空心光环，绝非易事。目前，通常的做法是用一个0-2π的位相调制器，结合圆偏振光进行。这样的话：(1)对于光学上来说，2π的位相调制就回到了0，因此是一个螺旋式上升的连续结构；(2)这一位相调制无论从哪个角度剖开，都是一个0-π的台阶。

由于从透镜前端到焦点刚好是一个傅里叶变换： $F(u,v)=\iint f(x,y)e^{-i2\pi(ux+vy)}dxdy$

我们可以看到，当u=0,v=0时，中心就是对于所有这些复振幅的积分或求和。由于 $e^{i0}=1$ , $e^{i\pi}=-1$ ,这两者刚好相互抵消，因此中间的极大值变成了极小值，形成了非常美丽的面包圈结构。

图1 STED通常0-2π采用涡旋位相光栅实现donut。

这一看似美丽的数学解有一个脆弱的地方：对于生物成像，样品会带来新的位相调制。由于生物细胞中，所有细胞器的折射率分布变化大和散射特性不同，导致它们对每一个角度的位相都会产生影响。这个扰动一旦变大，donut中心就不再为零，STED将会擦除PSF的中心地带，导致分辨率不但不能有效提升，甚至可能会变差。一句话，donut 不零，STED不灵。这也是为什么大家看到很多漂亮的STED的成像结果，但都是二维图像的原因。

而另一方面，人们研究了一些抗干扰的光束，如Bessel光，Airy光等，并将其应用在光片成像、OCT等领域。Bessel光的核心是，通过一个axicon对高斯光束进行调制，可以实现一个针状的光分布，且这一针状光斑经过样品时，不会受到样品折射率变化的干扰。

图2 Bessel光束调制原理。中心区域通过干涉增强实现了抗干扰的Bessel光。

由于STED最怕干扰的是中空donut，在此条件下，我们把axicon和涡旋位相波片结合起来，实现了一个中空的竹子状光束。这一光束同样具有self healing的效果。

图3 Gaussian-Bessel STED焦点分布示意图。

接下来的工作就豁然开朗了：我们在琼脂样品上测试分辨率，发现在155微米的深度，我们能够达到和表面同样的分辨率。我们尝试了折射率失配的PDMS样品，发现能够达到100微米深度的超分辨。最后，我们制作了一个类脑白质的仿体，发现能够达到100微米的穿透深度，实现超分辨。

在过去，很多超分辨的工作受限于样品散射等因素，被局限在二维世界；能研究的样品只有一些细胞，和非常浅层的脑成像。我们希望通过这一技术，实现深层的组织超分辨成像。

相关成果被Laser& Photonics Reviews作为2016年1月的封面文章发表。北京大学物理学院施可彬课题组的于文韬同学为本文第一作者，施可彬研究员和席鹏研究员为共同通讯作者。该工作得到了973国家重点基础研究发展计划和国家自然科学基金委的支持。

Wentao Yu et al, Super-resolution deep imaging with hollow Bessel beamSTED microscopy, Laser & Photonics Reviews, 10, 147–152,  2016.

相关链接：

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/lpor.201500151/abstract