德国学者氢水细胞学研究

细胞学研究虽然不能等于在体实验，也不代表人体试验。但具有更直观更震撼的现象证据。2007年日本学者也是先在细胞研究发现氢气的神奇不可思议作用，才进一步进行动物疾病模型和后来的人体试验。当然氢气细胞研究存在诸多困难，最突出的问题就是氢气容易从培养体系释放的问题。这导致剂量控制存在难处。不过这不是关键问题，关键是氢气的作用足够强大。

作者Peter C. Dartsch单位：德国达奇科学有限公司，细胞生物学检测系统研究所，上安格街 1 号，邮编 D - 86911，德国阿默尔湖畔迪森

背景：氢气尚未在传统医学中得到广泛应用和认可。然而，最近的研究结果表明，氢具有多种药理作用，对多种疾病都有积极影响，其中包括肾脏疾病。在本研究中，我们采用细胞生物学检测方法，直接对比富氢水与未经处理的同一种自来水，探究富氢水在细胞层面是否具有有益作用。

实验：富氢水是由德国misterwaterGmbH公司的两种不同设备，根据操作说明，以当地初始自来水为原料制备而成。在产生氢气后，立即对制得的富氢水进行检测。将未经制氢设备处理的同一种自来水作为对照。实验使用了一种成熟的肾脏上皮细胞系（MDCK；马-达二氏犬肾细胞）。针对每个测试参数，至少进行了三个独立实验。使用双尾Wilcoxon-Mann-Whitney秩和检验对数据进行统计分析。

结果：与初始自来水相比，使用新鲜制备的富氢水对肾脏上皮细胞的细胞代谢具有统计学意义上的显著促进作用（p≤0.01）。在体积分数为20%（体积比，平均值±标准差）时，促进作用最为显著，达到21.4±7.4%。即使浓度更高的富氢水，其促进作用也显著增加，体积分数为30%时增加约16%，体积分数为40%时也有类似的显著提升。与初始自来水相比，富氢水可使细胞再生率提高31.5±4.7%（20%体积分数）和28.9±4.5%（40%体积分数）。在所有实验中，这种细胞再生方面的改善都具有统计学显著性（p≤0.01）。在外源活性氧诱导的氧化应激实验中，在所有测试的过氧化氢浓度下，富氢水组的细胞活力均优于初始自来水组，并且在过氧化氢浓度为2mM和5mM时，差异具有显著性（p≤0.01）。从形态学上也能明显看出富氢水的这种保护作用。

结论：定期饮用由mister water GmbH公司设备制备的新鲜富氢水，能够改善肾脏细胞的细胞代谢，在细胞受损时促进再生过程，并在氧化应激情况下为细胞提供更多保护。因此，富氢水可能对人类健康和生活态度也具有有益影响。

引言

氢气尚未在传统医学中得到广泛应用和认可。然而，近期研究结果表明，氢具有多种药理作用，如抗氧化、抗炎或抗凋亡特性[1]。与此同时，越来越多的研究致力于探究氢气在各种疾病治疗中的应用。氢气具有多项优势：它能够迅速穿透组织和细胞，且不干扰代谢氧化还原反应或活性氧（ROS），而活性氧在体内细胞信号传导中起着重要作用[2]。因此，正如一项关于致突变性、遗传毒性以及每日摄入高达每千克体重20毫升富氢水的亚慢性口服毒性研究所示，使用氢气应无不良影响[3]。

摄入氢的方法有多种，例如吸入氢气或饮用富氢水。水的优势在于其制备和使用都非常简便，并且在常温常压下，氢能够溶解在水中，浓度可达1.6ppm。与最初的预期相反，研究发现饮用富氢水的效果与吸入氢气类似[2]。

肾脏的主要功能是清除血液中的毒素和代谢废物，并调节人体的盐分和水平衡，这一过程通过排尿来实现。肾小管参与血液过滤以清除废物，其内部衬有一层上皮细胞。氧化应激可对肾脏和肾脏上皮细胞造成永久性损伤，因此，氢的使用为预防和治疗肾脏疾病提供了一种选择[1,4-6]。

在本研究中，我们运用细胞生物学检测方法，直接对比富氢水与未经处理的同一种当地初始自来水，旨在探究富氢水在细胞层面是否具有有益作用。鉴于用户所描述的积极效果，本研究仅针对培养的肾脏上皮细胞展开调查。

材料与方法

富氢水的制备与使用：在测试期间，使用德国misterwaterGmbH公司（地址：D-85540 Haar OT Salmdorf）的两种不同设备，按照操作说明，以当地自来水为原料制备富氢水。由于产生并溶解的氢气存在时间极短，制备完成后立即对所得的富氢水进行检测。同时，通过密封细胞培养皿，尽可能延长氢气对细胞培养物的作用时间。作为对照，使用未经制氢设备处理的同一种初始自来水。为避免渗透压诱导的细胞改变和细胞体积调节问题，初始水和富氢水添加到培养基或反应混合物中的最大体积分数为40%（体积比）。

肾脏上皮细胞：本研究使用马-达二氏犬肾（MDCK）细胞的亲代菌株[7]。这是一种哺乳动物肾脏上皮细胞系，于1958年从一只成年雌性犬的肾小管中分离得到[8]，目前在生物医学研究中广泛应用于多种细胞生物学研究，如蛋白质运输、细胞极性和细胞间接触等方面。该细胞系还可用于研究药物进入细胞以及在细胞内的运输过程[9]。科学文献中超过10万篇的相关出版物证明了该细胞系的重要性。

细胞以冷冻保存状态购自Sigma-Aldrich/ECACC（德国代森霍芬），解冻后常规培养于杜氏改良伊格尔培养基中，培养基含有10%的生长混合物和0.5%的庆大霉素，在37°C、5%二氧化碳、95%空气且湿度超过90%的气体培养箱中培养。细胞常规每周传代两次，经过几次传代后用于实验。实验持续了近6个月的时间。

基础细胞代谢：实验时，将处于80%-90%汇合度的细胞，以每孔50,000个细胞的密度接种于96孔培养板（每孔200微升培养基）中，孵育48小时，直至细胞完全贴壁、铺展且细胞代谢恢复正常。向细胞中加入反应混合物，该混合物由含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水、作为能量来源的5mM葡萄糖、适当测试浓度的新鲜制备的富氢水或当地初始自来水，以及水溶性四唑染料WST-1（4-[3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑]-1,3-苯二磺酸盐；德国代森霍芬Sigma-Aldrich公司）组成。

该染料的裂解及其导致的颜色变化与线粒体能量代谢和细胞活力直接相关[10-12]。使用酶标仪（BioTek Elx 808，配备Gen 5版本3.00软件）在特定时间点（最长120分钟）测量吸光度差值（∆OD =450–690nm）记录颜色变化，并使用Microsoft Excel进行分析。进行了四个独立的测试系列（n=4），每个系列设两个重复孔。

细胞再生：在该模型中，模拟了以细胞迁移和增殖来闭合损伤后缺损为特征的肉芽形成阶段[13-16]。将细胞以每毫升100,000个细胞的密度接种到硅胶四孔培养插入物（德国格拉费尔芬ibidi公司）的各个小室中。插入物的各个小室由一个500微米厚的硅胶条分隔，外部硅胶框架厚700微米。由于特殊的粘附区域，硅胶插入物牢固地粘附在培养皿底部，形成一个明显的无细胞区域（即“人工伤口”），细胞可通过迁移和增殖占据该区域。在细胞接种48小时后达到汇合度时，用镊子取出硅胶插入物，使各小室之间的无细胞区域边缘整齐。将体积分数为20%和40%的富氢水或初始当地自来水分别添加到不同培养皿的细胞中。让肾脏上皮细胞迁移和增殖12小时。最后，用100%甲醇固定细胞培养物，用吉姆萨氏天青伊红亚甲蓝溶液（德国达姆施塔特默克公司）染色，然后风干。在显微镜下的6个不同点检查细胞占据的区域，并使用奥地利格拉茨KML Vision公司的人工智能专业软件（IKOSA AI软件）进行计算。进行了三个独立的实验系列（n=3）。

外源诱导氧化应激后的细胞活力：本研究使用我们已建立的过氧化氢诱导的氧化应激（HP-IOS）测试系统。由3%的过氧化氢溶液（=880mM），通过用磷酸盐缓冲盐水进一步稀释，制备出后续细胞培养测试浓度10倍浓缩的过氧化氢储备溶液。将肾脏上皮细胞以每孔100,000个细胞的密度接种于24孔板中，使其贴壁、铺展并稳定代谢48小时，直至达到约90%的汇合度。然后，将细胞与不同浓度的过氧化氢（0至2mM）以及体积分数为20%的富氢水或作为对照的初始当地自来水一起孵育24小时。最后，在加入XTT（2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺；瑞士阿尔施维尔Xenometrix公司）后，通过氧化还原颜色反应，使用酶标仪（BioTek ELx 808，配备Gen 5版本3.00软件）在特定时间点（最长120分钟）测量吸光度差值（∆OD=450–690nm），以测定存活细胞的活性。进行了三个独立的测试系列（n=3）。

统计分析：使用无参数的双尾Wilcoxon-Mann-Whitney秩和检验进行统计分析。

结果与讨论：在四个独立实验中，与反应混合物中的初始自来水相比，使用新鲜制备的富氢水对肾脏上皮细胞的细胞代谢具有统计学意义上的显著促进作用（p≤0.01）（图1）。在体积分数为20%（体积比，平均值±标准差）时，促进作用最为显著，达到21.4±7.4%。即使更高浓度的富氢水，也显示出显著增加，体积分数为30%时增加15.6±6.3%，体积分数为40%时增加16.7±5.4%（平均值±标准差）。

对细胞培养物进行显微镜检查以观察再生过程，结果显示，与初始自来水相比，暴露于新鲜制备的富氢水明显促进了细胞对无细胞空间的占据（图2）。与基础细胞培养基（未展示）相比，测试的两种体积分数的富氢水（20%和40%体积比）分别使再生过程提高了8.4±6.5%（20%体积比）和14.3±3.3%（40%体积比）。这意味着，即使因添加富氢水而稀释了培养基中的营养成分，其效果仍优于培养基本身。此外，在所有实验中，初始自来水均导致细胞再生减少，因此，直接对比显示，富氢水的效果总是比初始自来水好31.5±4.7%（20%体积比）和28.9±4.5%（40%体积比）。在所有实验中，与初始当地自来水相比，富氢水对细胞再生的改善具有统计学显著性（p≤0.01）。在研究外源诱导的氧化应激对细胞活力的影响时，我们发现，与未添加活性氧培养的细胞相比，细胞活力随着过氧化氢浓度的增加而降低。然而，与初始自来水相比，使用富氢水时的细胞活力总是更好（图3）。在过氧化氢浓度为0.25至2mM时，富氢水组与初始自来水组相比，细胞活力提高了12%至17%，在过氧化氢浓度为5mM时，甚至提高了34.0±5.2%（平均值±标准差）。在过氧化氢浓度为2mM和5mM时，差异具有统计学显著性（p≤0.01）。从形态学上也能明显看出富氢水的这种保护作用（图4）。

正如本研究中培养的肾脏上皮细胞实验所示，与初始当地自来水相比，德国mister water GmbH公司新鲜制备的富氢水证明了其有益效果。与未经处理的初始自来水直接对比，富氢水能够显著改善培养的肾脏上皮细胞的代谢和再生，以及在细胞层面灭活内源性自由基。这与其他科学家的研究结果一致，这些研究表明氢气或富氢水在肾脏疾病的医学应用和健康益处方面具有重要意义[1,5,6,17- 20]。因此，定期饮用由mister water GmbH公司设备制备的新鲜富氢水，能够改善肾脏细胞的细胞代谢，在细胞受损时促进再生过程，并在氧化应激情况下为细胞提供更多保护。所以，富氢水可能对人类健康和生活态度也具有有益影响。

图1：在反应混合物中，不同体积分数下，与初始当地自来水相比，富氢水对肾脏上皮细胞基础细胞代谢的相对促进作用的图示。数据表示四个独立实验的平均值±标准差。(*) 表示在p ≤ 0.01水平上具有统计学显著性（双尾Wilcoxon-Mann-Whitney秩和检验）。

图2：富氢水对培养的肾脏上皮细胞在12小时内细胞再生的有益作用的显微图像。(A) 在培养基中使用体积分数为40%的富氢水，无细胞空间相对减少，因而细胞再生情况更好。(B) 在培养基中使用体积分数为40%的初始当地自来水，由于细胞再生减少，无细胞空间相对增加。使用配备10倍平消色差物镜的奥林巴斯IX-50倒置显微镜和400万像素分辨率的奥林巴斯E-10数码相机，在明场照明下对固定和染色后的样本进行观察。

图3：与未添加外源性活性氧的纯培养基相比，富氢水（蓝色柱形）和初始当地自来水（灰色柱形）的细胞保护效果结果图示。将培养基的细胞活力设定为100%。在所有过氧化氢浓度下，富氢水始终具有更好的保护作用。数据表示三个独立实验的平均值±标准差。

图4：富氢水对氧化应激后24小时内肾细胞活力的有益作用的显微图像展示。(A) 无氧化应激的对照培养组。(B) 在培养基中加入体积分数为20%的初始当地自来水，并用2 mM过氧化氢处理后，细胞变圆、脱离并漂浮，细胞活力下降。(C) 在培养基中加入体积分数为20%的富氢水，并用2 mM过氧化氢处理后，变圆和脱离的细胞数量较少，仍有细胞贴壁，且细胞活力更好。使用配备10倍平消色差物镜的奥林巴斯IX-50倒置显微镜和400万像素分辨率的奥林巴斯E-10数码相机，在相差照明下进行观察。