氢气缓解植物应激的作用

摘要 气体递质和气体信号分子对于控制细胞功能非常重要，特别是在应对逆境应激中。过去研究主要集中在一氧化氮（一氧化氮）和硫化氢等分子上，尽管其他的分子如乙烯和一氧化碳（一氧化碳）在植物生理功能中也很重要。在这里，氢分子被加入到这个领域中。氢气曾经被证明可改善植物对一系列应激源的反应，包括暴露于重金属、盐度、极端温度和紫外线辐射。显然，氢气是一种重要植物生理效应气体，可能有助于促进植物生长和粮食安全。氢气方便以富氢水（HRW）的形式进行外源性给予，但其广泛使用仍存在一些问题。此外，氢气对细胞作用的分子基础尚不十分清楚。本文讨论了氢气在植物领域的应用的各个方面，以及可能从其他物种中氢气的效应学到的东西。

Alleviation of Plant Stress by Molecular Hydrogen | SpringerLink

Hancock J T, LeBaron T W, May J, et al. Alleviation of Plant Stress by Molecular Hydrogen[M]//Gasotransmitters Signaling in Plants under Challenging Environment. Cham: Springer International Publishing, 2023: 101-120.

一、前言

1987年，动物实验表明内皮衍生的舒张因子（EDRF）实际上是气体一氧化氮（一氧化氮）。这为研究生物系统中的反应性氮物种（RNS）打开了大门，同时也观察到了其他生理性气体递质。这种分析也激发了对其他可能参与细胞信号传导的小分子活性化合物的研究，包括非气态活性氧物质（ROS），如过氧化氢，以及活性硫化合物，如硫化氢。2019年是植物中一氧化氮研究的40周年，最近一个新的参与者加入了这个名单，即氢气，它可以改变植物细胞的活动，并可能在应对压力反应中发挥作用。由于植物是固着的，它们需要更复杂的生存策略来克服各种压力挑战，包括暴露在紫外线下、重金属、极端温度（高温和低温）、干旱、洪水和盐度等。

当植物处于环境压力下时，其策略是诱导信号转导途径，这通常会导致基因表达的改变，从而影响细胞内蛋白质的组成，使细胞能够增强或产生新的活动。这些作用使细胞能够应对当前压力，甚至未来挑战。植物中涉及的信号传递包括一系列植物激素，但也涉及许多气体递质，这些气体递质在其他生物体中也很重要。其中包括一氧化氮、硫化氢、一氧化碳和乙烯。植物的压力对植物的生长和生产力有重大影响，而气体递质在植物应对压力方面起着重要作用。通常，这些分子所介导的信号传递之间存在相互作用和/或协调。在这里，我们讨论氢气与其他气体信号分子之间的相互作用，重点讨论了氢气如何缓解植物的压力。

二、氢气的植物作用

氢气很难被植物吸收。哺乳动物可以吸入氢气混合气获得氢气，且有许多使用氢气成功的例子，包括用于治疗COVID-19。然而，氢气非常易燃，存在安全问题，而且比空气轻，所以氢气会迅速分散到上层大气中，使得给地面植物使用气体不太现实（也不是没有可能，我认为通过在土壤内经过管路输入氢气，利用氢气在土壤内的扩散性能，实现给土壤施氢的作用也应该可行。关键是如何减少工程和材料的费用。）。因此，给植物使用氢气通常涉及创建和稀释饱和的氢气溶液，即富氢水（HRW）。然而，氢气不太溶于水，会迅速从水中释放出来并丢失。这可能需要反复重新将HRW应用于植物组织，直接涂抹在叶面或注入根部灌溉水中，以产生效果。然而，如表5.1所示，已经有许多使用HRW来缓解植物压力的例子。包括对重金属、温度压力和光压力的反应，很明显植物能够感知和应对氢气或HRW的存在。有趣的是，氢气应用的一个潜在重要用途是在收获后延长作物的储存时间，特别是水果和花卉。对HRW的新应用是形成氢纳米泡水（HNW）。这被认为可以提高氢气的溶解度并延长氢气的输送。

表5.1 富氢水缓解植物应激的研究

为了使氢气在实践中有用，可能需要开发新的、更易于使用的氢气输送方法。这些方法可能来自不同的行业，例如，一种潜在的供体是氢化镁（MgH2），这是一种被提议用于太阳能领域的化合物。氢气释放的动力学比仅使用HRW更慢且更持久，但发现在柠檬酸缓冲液中使用更有效。另一种最近用于植物中释放氢气的化合物是AB@hMSN，一种负载氨硼烷的空心介孔二氧化硅纳米颗粒。然而，这里有一个警告。如果使用供体分子，它们可能会留下副产品，这可能会严重危及氢气的安全生物使用。

三、氢气的效应分子。

氢气分子非常小（相对于其他信号分子），并且相对惰性。因此，很难想象它是如何被细胞感知和作用的。例如，使用化学趋化因子的经典激素型信号传导会使用蛋白质受体，但这不太可能适用于氢气这样的分子。一些信号分子，如一氧化氮，会通过假体基团或与巯基反应而与蛋白质反应。然而，同样地，很难看出这种类型的反应如何适用于氢气，因为与一氧化氮不同，氢气是无极性的，并且不具有反应性。因此，必须存在其他机制来解释氢气给药后观察到的生物效应。

关于氢气作用的主要论点之一是它影响细胞中的抗氧化剂水平。许多这些效应是间接的，涉及抗氧化能力细胞中酶的表达或积累发生变化。然而，这只有在氢气分子被直接感知的情况下才会发生，而这通常是文献中回避的问题。

据报道，氢气确实可以直接作为抗氧化剂起作用，通过与羟自由基（⋅OH）反应，但不与其他ROS（如超氧阴离子（O2⋅−）或过氧化氢）反应。已知⋅OH参与植物应激反应，如重金属胁迫、百草枯处理以及寒害和干旱胁迫等。因此，通过自由基清除剂去除⋅OH（这里指氢气）可以解释一些观察到的效果。尽管如此，后来的一篇论文提出对这种反应动力学的密切调查并不支持这一观点，实际上，有人提出⋅OH会在氢气之前与其他生物分子反应，因此⋅OH的效果不会因氢气的加入而减弱。类似地，第二个直接目标被认为是过亚硝酸根离子（ONOO−）。这是由超氧阴离子（O2⋅−）与一氧化氮反应产生的，由于两者在应激反应中时间和空间上同时产生，因此很可能存在ONOO−。如果氢气去除ONOO−，这可以解释观察到的效果。然而，进一步仔细检查分子动力学似乎排除了ONOO−作为氢气的直接目标。

由于⋅OH和ONOO−都能被排除在外，有人最近提出可能的目标是三价铁（Fe3+）离子(Penders et al. 2014)。这与其他气体信号传递者的报告并无不一致之处。一氧化氮的一个主要作用是通过一氧化氮与酶的血红素辅基直接相互作用激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）。在这方面，研究了氢气在肌红蛋白、细胞色素P450和假单胞氧还蛋白中对铁的还原作用，但得出结论认为在这些蛋白质中没有血红素或铁硫（Fe/S）簇的还原。然而，具有-414 mV的氧化还原电位中点，氢气可以在各种酶中热力学上还原一系列血红素基团，并建议将其作为未来研究的焦点。正如所讨论的，NAPDH氧化酶同系物等酶尤其可能参与各种应激反应。不能排除sGC也可能是氢气的目标。显然，在这方面需要做更多的工作，使用含有血红素或Fe/S辅基的各种植物蛋白质，然后再排除这种机制的可能性。然而，可能需要对此保持一定的谨慎，因为它不能总是假设在动物系统中确定的信号通路 在植物中也是相同的。例如，一氧化氮对植物sCG的作用已经受到质疑。因此，氢气的作用也可能不同，尽管使用其他生物系统来推进植物科学是一种强大的工具（下述）。

据报道，氢气的一些效应是由血红素加氧酶（HO-1）介导的。该酶催化血红素分解的反应（1）涉及氧气；（2）使用NADPH作为辅因子；（3）产生胆绿素、一氧化碳和铁离子。然而，与氢气的具体反应细节尚未报道，因此也可能只是氢气效应下游信号传导的结果，这尚待确定。另一种据信介导氢气效应的酶是谷胱甘肽过氧化物酶，这是一种维持细胞内氧化还原平衡的重要酶。通过使用基因缺陷菌株和抑制剂的研究显示，在灵芝真菌中需要谷胱甘肽过氧化物酶来介导氢气的作用。这种谷胱甘肽过氧化物酶是一种含硒蛋白，使其成为一种有趣的潜在氢气靶标，但也不能排除氢气的直接作用位于酶的上游信号。

最后，有人提出，由于氢气有两种自旋状态，这可能是氢气影响其他生物分子的一种方式。然而，到目前为止，还没有这方面的实验证据。

虽然已经提出了多种机制，但目前还没有确定氢气具体如何直接与生物系统相互作用的明确机制（表5.2）。因此，在氢气效应机制方面仍然需要做更多的工作。尽管如此，由于氢气对植物的作用非常明确（表5.1），在不了解分子机制的情况下仍然可以利用这一现象，特别是似乎没有报告表明氢气应用对植物和动物有明显害处。氢气化学特征决定了似乎不会留下副产品，因此对食品安全不会产生影响。

表5.2 氢气的可能分子靶点和作用

四、氢气的细胞信号作用。

与所有物种一样，植物中细胞信号传导对于生物体茁壮成长和应对压力挑战至关重要。感知外部信号（生物或非生物）以及信号传导途径，导致反应的过程涉及一系列蛋白质和小分子。在这些途径中起关键作用的是相对活跃的小气体信号分子，如一氧化氮和硫化氢。尽管如前所述，很难想象氢气也能直接参与生化调节作用并对多肽产生影响，但是有大量证据表明氢气能与其他气体信号分子和小氧化还原化合物的相互作用或影响。以下讨论一些这方面的证据。

4.1 氢气对一氧化氮的影响 

几十年来已知，植物产生一氧化氮并对其功能产生深远影响。毫无疑问，一氧化氮在控制细胞功能方面起着核心作用，而最近发现氢气在一氧化氮途径中相互作用。

当HRW用于缓解苜蓿的铝胁迫时，据报道一氧化氮生成减少。50%饱和HRW降低了一氧化氮供体的效应，表明一氧化氮可能介导了氢气效应。相反，当研究根生长时，氢气增加了番茄幼苗中的一氧化氮产生。这被一氧化氮清除剂2-4-羧基苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧化物（cPTIO）所降低，这表明氢气并未直接清除一氧化氮。研究结论是，生长素诱导的氢气生成随后由硝酸还原酶产生的一氧化氮介导。在黄瓜中也报道了类似结果，其中HRW增加了根生长和一氧化氮积累。HRW和一氧化氮都增加了细胞周期基因的表达，包括CycA（A型周期蛋白）、CycB（B型周期蛋白）、CDKA（周期蛋白依赖性激酶A）和CDKB（周期蛋白依赖性激酶B）。这些效应被类似硝酸还原酶和一氧化氮合成酶抑制剂以及一氧化氮清除剂所减弱。一氧化氮还介导了黄瓜中由氢气诱导的根生长，其中下游蛋白质被鉴定为质膜H+-ATPase和14-3-3蛋白。后者是诸如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和p53等胞内信号传导级联的关键调节蛋白。当根形成由氢气释放供体AB@hMSN诱导时，还发现酶硝酸还原酶参与了一氧化氮的产生。

氢气具有在植物材料采后储存方面的潜力。1% HRW [2.2 μM H2]（根据作者的信息计算）和硝普钠（SNP：150 μM）改善了切花百合的瓶插寿命，当去除一氧化氮时这些效应减弱。在对表达的基因进行研究时还发现叶绿体ATP合酶CF1α亚基（AtpA）可能在介导这些效应方面很重要。此外，西红柿中的硝酸盐积累通过H2减少，这可能对水果的储存方式产生影响。

因此，显然氢气对一氧化氮代谢有影响，并由其介导，这似乎不是由于氢气直接清除一氧化氮所致，这与之前的报道一致。然而，氢气也可能通过ROS产生影响，这也可能会影响一氧化氮代谢。例如，脱落酸（ABA）诱导拟南芥中氢气的积累，从而增强了干旱耐受性。然而，这些效应也涉及ROS和一氧化氮积累，使用了酶硝酸还原酶和NADPH氧化酶。事实上，发现氢气促进一氧化氮积累依赖于ROS的产生，表明氢气参与了一个复杂且相互依存的系统。

4.2 氢气对活性氧和抗氧化酶的影响 

很明显，在考虑氢气效应时需要考虑ROS代谢，特别是因为氢气可能具有抗氧化剂和促氧化剂的作用。

尽管直接清除超氧阴离子O2⋅−和过氧化氢被排除在外，过氧化氢的清除也受到质疑，但许多报告表明氢气通过调节细胞的抗氧化能力对植物产生影响。用氢气处理韭菜后减少了氧化损伤并增加了几种抗氧化酶的活性，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、愈创木酚过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX），从而延长了韭菜的保质期。UV-B照射后大麦中的氧化应激也通过改变抗氧化剂得到缓解，尤其是类黄酮。HRW还使玉米更能耐受光胁迫，同样也是通过抗氧化酶实现的（张等人，2015年）。其中包括SOD、CAT和APX，它们减少了O2⋅−和过氧化氢的积累。

通过向植物施用氢气来应对其他压力挑战所带来的耐受性也是由抗氧化剂介导的。这包括玉米对铝的耐受性，其中HRW改变了CAT、APX、SOD和POD的细胞水平。在暴露于寒冷应激的水稻幼苗中，SOD水平发生变化，这似乎是由miRNA水平的变化介导的，特别是miR-398转录本。作者认为这对于维持细胞内的氧化还原平衡至关重要。

细胞内抗氧化活性的变化不仅可以减轻氧化应激的有形方面，如减少脂质过氧化和蛋白质氧化，而且还将成为维持细胞氧化还原平衡系统的一部分，这将是信号传导中复杂相互作用的一部分。降低ROS水平将意味着与一氧化氮的反应可能会减少，从而减少ONOO−的产生，后者是一氧化氮的下游信号分子。众所周知，ROS还会作用于谷胱甘肽，这是一种有助于维持细胞氧化还原平衡的分子。有人认为细胞的氧化还原状态被精心保持在一个“金发姑娘区”，因此任何细胞内氧化还原分子的变化都会影响这个区域。一个很好的例子是，这种氧化还原活性分子如何相互作用以在植物中产生效果，这可以从豆科植物与根瘤菌共生系统中看到，其中研究了GSH、一氧化氮和ROS。

4.3 氢气与乙烯信号传导

乙烯（C2H4；H2C=CH2）是最知名的气体信号分子之一。它参与植物的各种生理系统，如植物生长，但可能最知名的是它在果实成熟中的作用。

乙烯与其他气体信号分子的相互作用并不新鲜。例如，已经报道一氧化氮和乙烯在黄瓜的根系发育中共同作用。因此，氢气与乙烯的相互作用并不令人惊讶。通过氢气处理可以降低玫瑰花朵的采后衰老，这是通过改变乙烯信号传导来实现的。底物和生物合成酶减少了：1-氨基环丙烷-1-羧酸酯（ACC）；ACC合酶（ACS）；和ACC氧化酶（A一氧化碳）。编码生物合成酶的Rh-ACS3和Rh-A一氧化碳1转录本的基因表达也减少了。有趣的是，乙烯受体Rh-ETR1的表达增加了。这些数据清楚地表明氢气对乙烯代谢和伴随的信号传导有影响。

一项蛋白质组研究还表明，氢气和乙烯在信号传导中合作。使用黄瓜根作为模型系统，研究表明乙烯信号传导的抑制剂AgNO3和aminoethoxyvinylglycine（AVG）降低了氢气处理诱导的不定根发育。蛋白质组分析使用二维凝胶电泳结合质谱分析显示，HRW诱导了九种蛋白质的上调和十五种蛋白质的下调。作者得出结论，乙烯是氢气的下游，并且有六种蛋白质值得关注，它们介导了氢气效应。这些蛋白质是RuBisco、氧合增强蛋白（OEE1）、七磷酸硫辛酸脱氢酶（SBPase）、苏氨酸脱氢酶（TDH）、胞质抗坏血酸过氧化物酶（cAPX）和蛋白质二硫键异构酶（PDI）。

4.4 氢气与硫化氢信号传导

硫化氢被认为是有毒的，但现在也被接受为控制生理学和细胞功能关键事件的治疗性气体信号分子。然而，与其他小反应性化合物一样，硫化氢并不是单独作用，而是这些分子参与的复杂相互作用的一部分。有人提出硫化氢可能对其他一些信号通路起到抑制作用。此外，还有报道称硫化氢也是细胞内氢气信号传导的一部分。

通过在拟南芥中表达来自莱茵衣藻（CrHYD1）的氢气酶基因，导致氢气生物合成，研究表明植物需要内源性氢气来抵抗渗透胁迫。暴露于氢气刺激了硫化氢的产生，并认为为了调节气孔开放度从而导致观察到的耐受性，硫化氢是氢气的下游。在切花研究中也发现了类似结果。在对康乃馨的研究中发现，氢化镁和柠檬酸溶液增加了硫化氢的产生。红氧化还原平衡得以维持，而衰老基因的表达被抑制。牛磺酸是一种硫化氢清除剂，逆转了这些效应，并认为氢气的下游效应是由硫化氢介导的，这与气孔研究一致。

因此可以看出，氢气参与了包括一氧化氮、乙烯和硫化氢等在内的一系列气体信号分子的信号传导途径。

五、来自非植物类氢气效应的启发

在生物界中进行跨物种研究可能会带来回报，但确实需要注意一些警告。例如，对人类NAPDH氧化酶的表征极大地促进了对植物中这些酶同源物的研究的进展。事实上，来自植物和动物的氧化酶蛋白可以组合在一起，以体外重建活性。另一方面，动物一氧化氮S的发现只在植物科学中引起了争议。此外，植物中缺乏在动物中被充分描述的sGC信号通路进一步强调了可能需要谨慎使用。话虽如此，下面讨论了通过采取广泛的方法可以学到多少关于氢气在生物系统中的作用的知识。

如果氢气能够增强植物的应激反应，那么相关细胞中的氢气浓度需要增加。这可以通过两种机制实现：要么内源性氢气产生增加，要么外源性供应氢气。

衣藻可能是藻类最知名的内源性生物系统之一，用于生产氢气。这种生物非常擅长产生氢气，以至于有人建议将其用作生物燃料。衣藻氢气的产生是通过氢化酶实现的，这种机制最近已经得到了综述。如果可以通过操纵这种酶的控制或增加表达和相关的多肽积累来增加植物中基于酶的氢气产生，那么就可以有针对性地利用氢气信号来增强植物的生长和生存能力。有学者使用模型生物如衣藻，以及更高级的植物模型如拟南芥将在这类研究中发挥重要作用。

另一种方法是外源性供应氢气。如上所述，这可能来自于人为活动，例如应用HRW。然而，植物与许多生物一样，可能与原核生物和真菌处于协同或共生状态，它们本身可以产生氢气。在人类中，有研究表明肠道微生物群产生的氢气增加可能有益于健康。因此，植物根系周围原核生物氢气产生的增加可能具有有益的效果。另一方面，有研究表明氢气氧化土壤细菌也有益处。因此，操纵土壤细菌菌群可能很复杂，但改变根系附近的氢气代谢可能会有未来的好处。

对细菌的研究也有助于揭示氢气是如何起作用的。由于氢气偶具有非常低的还原中点电位（-414 mV），因此在生物系统中还原许多蛋白质辅基可能是热力学上可行的。脱硫弧菌中细胞色素c3的还原报告就说明了这一点。有趣的是，在随后进行的氧化还原反应中，有可能发生硫化氢的产生，已知硫化氢是植物中的重要气体信号分子，包括在应激条件下，这与本文的讨论有关。Peck在1959年的研究表明了两点重要内容。首先，在生物系统中氢气还原血红素团簇是可能的。其次，一旦血红素被还原，就有可能发生下游反应，从而可能产生信号分子。正如已经提出的，这需要在植物和动物中进一步探索，而不仅仅是在原核生物中。

其他物种可以在生物医学领域发挥作用的最大领域之一就是在这里。在这里，已经有研究表明氢气对各种疾病有益，包括表5.3中所列的疾病。研究发现氢气可以缓解COVID-19的症状并已用于临床试验。它还被发现对神经退行性疾病、类风湿性关节炎和糖尿病有益。因此，很明显氢气对人体健康和缓解疾病症状具有一系列益处。此外，如果已知氢气在生物医学领域的机制，是否可以将其转化并在植物科学中使用？

表5.3 氢气治疗缓解的人类疾病症状

不仅是表5.3中的数据支持了氢气在生物系统中产生深远影响的观点，而且氢气起作用的方式也是相关的。显然，动物中的一些作用和机制并不直接适用于植物。例如，降低IL-6水平或抑制细胞因子风暴的抗炎症作用不会在植物中出现。然而，氢气可能会影响植物中的类似胞间信号分子，如乙烯。其他作用可能更为相关。如前所述，氢气可能通过其对抗氧化剂的作用起作用，这一效应已经在植物中观察到过。因此，抗氧化剂的变化和对氧化应激的抑制是神经退行性疾病缓解、糖尿病治疗、情绪改变和乙型肝炎的共同特征，这也是氢气减轻植物应激的共同特征。动物和植物细胞的生化细节有所不同，但基本原理存在类似性。因此，密切研究动物学和医学领域中的氢气研究对未来植物科学可能会非常有益，反之亦然。鉴于氢气可能有益于人类健康的疾病列表，难怪人们已经开始考虑将氢气作为未来的人类疗法。可能是由于COVID-19大流行病的原因，目前研究和应用重点在于呼吸系统疾病，无论如何氢气的研究和应用在生物医学领域可能会持续受到关注。另一方面，已经有研究表明氢气的应用对农业可能非常有益。植物和动物之间可能存在共同的分子机制来响应氢气的作用，无论是通过抗氧化剂还是Fe3+还原或其他方式。植物科学可能有很多可以从原核生物和更高级的动植物研究中学到的东西，反之亦然。

六、结论和前景

现在看来，氢气对植物是一种有用的功能调节和疾病防治方法，可以缓解一系列压力挑战（表5.1），也是水果和花卉收获后储存的潜在方案，因为它可以明显延缓衰老。然而，氢气的生物化学有许多方面尚不清楚。首先，虽然已经提出了几种机制（表5.2），包括清除自由基和其他反应信号，或通过HO-1起作用，但氢气在细胞中的直接靶标尚不清楚。其次，虽然有许多关于氢气应用的报告是有益的（表5.1），但氢气的全部作用尚不清楚。

与其他生物分子相比，氢气的氧化还原电位相对较低。从热力学角度来看，氢气可以将Fe3+还原为Fe2+，这对许多酶都有影响，这表明辅基的还原，特别是许多血红素基团的还原，在理论上是有可能的，尽管没有广泛报道。此外，按照类似的逻辑，含硒酶也可能是氢气调控的目标。然而，如果没有特定的环境来降低这种还原发生的活化能，这种反应在动力学上可能是不可行的。因此，还需要对氢气控制的蛋白质进行全面研究，即使只是将其排除在外。与一氧化氮和硫化氢的研究不同，蛋白质组学方法似乎不适用于氢气。因为目前还没有关于该分子直接共价翻译后修饰的报道。另一方面，下游翻译后蛋白质修饰将会发生，了解这些效应的全套纲要将是有用的。

虽然一些植物内源性氢气的产生是可能的，并且可以加以控制，但外源性氢气的控制应该是更好的实用方法，因为外源性氢气更容易提供和调节。氢气可以作为治疗气体应用于植物，也可由植物周围的微生物群调控供应。使用气体方式不太可能有用，但通过HRW或HNW可能允许应用于叶子或根部，或两者兼而有之。显然，从物理角度来看，存在安全方面的问题，因为氢气极易燃，但从生物角度来看，氢气似乎对植物和动物都是安全的。与其他类似分子（例如硫化氢）一样，供体分子可以更好地利用氢气。在未来，一些用途已经被报道，如镁氢化物和AB@hMSN。

氢气在农业和园艺中的应用尚未得到广泛采用，但人们对这种生物安全处理方法的兴趣日益浓厚。随着人们对氢气如何起作用以及其影响的重要性的了解越来越多，氢气可能会成为未来促进植物生长和作物储存的一种可接受的方法。