PhenomicsJ的个人博客分享 http://blog.sciencenet.cn/u/PhenomicsJ

博文

Phenomics| 田志新组/陈芸组在乳腺癌糖蛋白耐药标志物结构特异性发现中取得重要进展

已有 577 次阅读 2023-5-14 23:12 |系统分类:论文交流

近年来,乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤之一,以其高发病率以及高死亡率危及女性的生命健康。目前常见的治疗方法是化疗和手术,然而由于耐药性的产生往往会导致较低的生存率。

糖基化是蛋白质中最常见的翻译后修饰,异常的蛋白质糖基化与癌症的发展密切相关。因此,充分了解耐药产生的机理以及发现相关乳腺癌糖蛋白标志物对于乳腺癌的治疗至关重要。

针对以上问题,《表型组学》(Phenomics)在线发表了同济大学化学科学与工程学院的田志新课题组与南京医科大学药学院的陈芸课题组题为N-glycoproteomics study of putative N-glycoprotein biomarkers of drug resistance in MCF-7/ADR cells的研究论文。该文基于位点和结构特异同位素标记定量N-糖基化蛋白质组学方法,对阿霉素耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR相对于乳腺癌细胞MCF-7体系进行研究,使用自主研发的完整N-糖肽数据搜索引擎GPSeeker进行定性鉴定,采用定量模块GPSeekerQuan进行定量分析,一共鉴定到322个完整N-糖肽,其中包含20个差异表达的完整N-糖肽。在此之中,该文对与耐药机制相关的完整N-糖蛋白也进行了讨论。

论文DOI链接

link.springer.com/artic

研究方法

该文通过两性离子亲水性相互作用液相色谱法(ZIC-HILIC)富集以及稳定同位素二乙基(SIDE)标记来自阿霉素耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR和乳腺癌细胞MCF-7的完整N-糖肽,将其等量混合,通过液质联用(C18-RPLC-nanoESI-MS/MS)进行分析,得到的数据使用自主研发的完整N-糖肽数据搜索引擎GPSeeker进行定性鉴定与定量分析,共鉴定出322个完整N-糖肽。

研究结果

在鉴定到的322个完整N-糖肽中包含248个N-糖基化位点,249个特异性肽段和234个完整N-糖蛋白(图1,a),90个单糖组成以及58个推测的N-糖链结构。在此之中,高甘露糖型、杂合型和复杂型的N-糖基化占比分别为53.9%、27.9%和18.2%。针对微观不均一现象(在肽段的相同糖基化位点上修饰有不同的N-连接糖),在165个结构特异的完整N-糖肽中,两个完整N-糖肽具有相同的肽段序列但由两个不同的N-连接糖所修饰;针对宏观不均一现象(一个蛋白上有多个糖基化位点),在234个完整N-糖蛋白中,鉴定到11个完整N-糖蛋白有两个及以上的N-糖基化位点。

本文研究者利用GPSeeker定量模块GPSeekerQuan对322个完整N-糖肽在相应一级谱中的同位素轮廓峰的峰强度进行搜索。根据每个完整N-糖肽观察到所有六个丰度最高同位素峰的标准,定量到了100个完整N-糖肽,其中39个在三次技术重复中鉴定到两次及以上。本研究进一步根据变化倍数≥1.5倍和p值<0.05的标准,得到20个差异表达的完整N-糖肽(DEGP)(图 1,b),其中,15个呈现下调趋势,5个呈现上调趋势。

图1 来自MCF-7和MCF-7/ADR细胞的稳定同位素二乙基标记的完整N-糖肽的 1:1 混合物 (a)定性鉴定得到的完整N-糖肽结果(FDR≤1%)以及 (b)定量分析得到的差异表达完整N-糖肽结果(在三个技术重复中鉴定到两次及以上,变化倍数≥1.5倍,p<0.05);(c)来自MCF-7/ADR相对于MCF-7细胞的N-糖基化类型的占比图。

图2展示了来自于MCF-7和MCF-7/ADR细胞的下调(0.45±0.06)的完整N-糖肽YHNQTLR_N2H5F0S0(P11717,MPRI_HUMAN,N400);

图3展示了来自于MCF-7和MCF-7/ADR 细胞的上调(2.00±0.28)的完整N-糖肽QVVENMTR_N2H3F0S0 (P10253,LYAG_HUMAN,N390)。

图2 (a,b,c)3 次技术重复中的匹配前体离子相应的理论同位素轮廓和实验同位素轮廓的指纹图谱;(d)N-连接糖部分图形解离图;(e)多肽骨架图形解离图;(f)带匹配碎片离子注释的二级质谱图。

图3 (a,b,c)3 次技术重复中的匹配前体离子相应的理论同位素轮廓和实验同位素轮廓的指纹图谱;(d)N-连接糖部分图形解离图;(e)多肽骨架图形解离图;(f)带匹配碎片离子注释的二级质谱图。

图4中,在位于完整N-糖蛋白N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶(P15586, GNS_HUMAN)的糖基化位点N362上,本研究同时观察到了上调的完整N-糖肽GPGIKPNQTSK_N2H7F0S0(2.50±0.24)与下调的完整N-糖肽GPGIKPNQTSK_N2H6F0S0(0.46)。在乳腺癌细胞系Hs578T中也鉴定到了该蛋白,并通过蛋白质印迹和LC-MS/MS技术证实了其存在于血浆中(Ahn et al. 2010)。

图4 来自于完整N-糖蛋白N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶(P15586,GNS_HUMAN)的糖基化位点N362上,上调的完整N-糖肽GPGIKPNQTSK_N2H7F0S0(2.50±0.24)与下调的完整N-糖肽GPGIKPNQTSK_N2H6F0S0(0.46)。

在本文体系(MCF-7/ADR细胞相对于MCF-7细胞)中,位于丝氨酸蛋白酶抑制剂H1的N-糖基化位点N120上的系列高甘露糖型SLSNSTAR_N2Hx (x=5-9)的下调水平随着糖型尺寸增大而逐渐变小;从N2H5到N2H9,变化倍数分别为0.27±0.03,0.49±0.08,0.76±0.08,0.92±0.08和1.09±0.29(图5)。田志新教授课题组其他相关研究也鉴定到了完整N-糖肽SLSNSTAR_N2H5F0S0(P50454,SERPH_HUMAN,N120)(Wang et al. 2019; Wang et al. 2020)。


图5来自于丝氨酸蛋白酶抑制剂H1的N-糖基化位点N120上的完整N-糖肽SLSNSTAR_N2Hx(x=5-9)的下调倍数图示;(a)从N2H5F0S0至N2H9F0S0,变化倍数为0.27±0.03,0.49±0.08,0.76±0.08,0.92±0.08和1.09±0.29;(b)相对应的匹配前体离子的理论同位素轮廓和实验同位素轮廓的指纹图谱。

本研究中,在溶酶体相关膜糖蛋白1(P11279,LAMP1_HUMAN)的N-糖基化位点N103上,完整N-糖肽GHTLTLNFTR_N2H6F0S0和GHTLTLNFTR_N2H7F0S0的变化倍数分别为1.79±0.38和0.89。而在N-糖基化位点N322上,AANGSLR_N2H8F0S0和AANGSLR_N2H9F0S0的变化呈现下调趋势,变化倍数分别为0.55和0.65±0.08(图6)。在乳腺癌细胞MCF-7细胞相对于乳腺上皮细胞MCF-10A细胞体系中,GHTLTLNFTR_N2H6F0S0,GHTLTLNFTR_N2H7F0S0和AANGSLR_N2H9F0S0的表达均呈现下调趋势(0.23±0.03,0.20±0.02和0.29±0.02)(Xue et al. 2020),而在乳腺癌症干细胞MCF-7 CSCs相对于MCF-7细胞体系中,完整N-糖肽GHTLTLNFTR_N2H6F0S0,GHTLTLNFTR_N2H7F0S0,AANGSLR_N2H8F0S0和AANGSLR_N2H9F0S0的表达均呈现上调趋势(7.41±1.43,3.28±0.35,1.10±0.42和3.05±0.30)(Wang et al. 2019)。

图6 来自于乳腺癌细胞MCF-7细胞相对于乳腺上皮细胞MCF-10A细胞体系(橙色)(Xue et al. 2020),耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR细胞相对于乳腺癌细胞MCF-7(绿色,本文体系)和乳腺癌癌症干细胞MCF-7 CSCs相对于MCF-7细胞体系(紫色)(Wang et al. 2019)的完整N-糖肽GHTLTLNFTR_N2H6F0S0,GHTLTLNFTR_N2H7F0S0,AANGSLR_N2H8F0S0和AANGSLR_N2H9F0S0的变化倍数柱状图。

通过对定量得到的100个完整N-糖肽进行STRING分析(string-db.org/),研究发现整合素蛋白相关蛋白(ITGAE,ITGA3,ITGAV和ILK)以及层粘连蛋白亚基α1(LAMA1)相互关联(图7)。

图 7 来自于MCF-7/ADR 和MCF-7 细胞中的N-糖蛋白的蛋白质互作网络图。

化疗耐药可由多种因素引起,本文中报道了参与相关耐药过程的完整N-糖蛋白。例如,药物外排转运蛋白和药物吸收转运蛋白(如 ABCC9、ABCA9和SLC22A4)、DNA 损伤修复相关蛋白(GPAT)。除此之外,癌症干细胞(CSC)的转移特性和相关蛋白(ITGAE,ITGA3,ITGAV和 ILK)对于细胞和细胞微环境间信号传导的调控都对癌症的发展起着重要作用,进而导致耐药性的发生。

本研究基于液质联用技术搭配完整N-糖肽数据搜索引擎GPSeeker,对于来自MCF-7/ADR和MCF-7细胞的1:1混合完整N-糖肽数据进行定性鉴定和定量分析。在定性结果中,一共鉴定到322个完整N-糖肽,其中包含248个N-糖基化位点,249个特异性肽段和234个完整N-糖蛋白;定量鉴定到20个差异表达的完整N-糖肽,其中,15个表达下调,5个表达上调。一些完整N-糖蛋白与耐药机理相关并参与耐药过程,此类糖蛋白可作为潜在的耐药相关N-糖蛋白标志物,后期可用于进一步临床研究。

Abstract

Currently, drug resistance of anti-cancer therapy has become the main cause of low survival rate and poor prognosis. Full understanding of drug resistance mechanisms is an urgent request for further development of anti-cancer therapy and improvement of prognosis. Here we present our N-glycoproteomics study of putative N-glycoprotein biomarkers of drug resistance in doxorubicin resistance breast cancer cell line michigan cancer foundation-7 (MCF-7/ADR) relative to parental michigan cancer foundation-7 (MCF-7) cells. Intact N-glycopeptides (IDs) from MCF-7/ADR and MCF-7 cells were enriched with zwitterionic hydrophilic interaction liquid chromatography (ZIC-HILIC), labeled with stable isotopic diethylation (SIDE), and analyzed with C18-RPLC-MS/MS (HCD with stepped normalized collision energies); these IDs were identified with database search engine GPSeeker, and the differentially expressed intact N-glycopeptides (DEGPs) were quantified with GPSeekerQuan. With target-decoy searches and control of spectrum-level FDR ≤ 1%, 322 intact N-glycopeptides were identified; these intact N-glycopeptides come from the combination of 249 unique peptide backbones (corresponding to 234 intact N-glycoproteins) and 90 monosaccharide compositions (corresponding to 248 putative N-glycosites). The sequence structures of 165 IDs were confirmed with structure-diagnostic fragment ions. With the criteria of observation at least twice among the three technical replicates, ≥ 1.5-fold change and pvalue < 0.05, 20 DEGPs were quantified, where five of them were up-regulated and 15 of them were down-regulated; the corresponding intact N-glycoproteins as putative markers of drug resistance were discussed.

参考文献

Ahn Y, Kang U-B, Kim J and Lee C (2010) Mining of serum glycoproteins by an indirect approach using cell line secretome. Molecules and Cells 29(2): 123-130.doi.org/10.1007/s10059-

Wang Y, Xu F, Chen Y and Tian Z (2020) A quantitative N-glycoproteomics study of cell-surface N-glycoprotein markers of MCF-7/ADR cancer stem cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry 412(11): 2423-2432. doi.org/10.1007/s00216-

Wang Y, Xu F, Xiao K, Chen Y and Tian Z (2019) Site- and structure-specific characterization of N-glycoprotein markers of MCF-7 cancer stem cells using isotopic-labelling quantitative N-glycoproteomics. Chemical Communications 55(55): 7934-7937. doi.org/10.1039/c9cc041

Xue B, Xiao K, Wang Y and Tian Z (2020) Site- and structure-specific quantitative N-glycoproteomics study of differential N-glycosylation in MCF-7 cancer cells. Journal of Proteomics 212. doi.org/10.1016/j.jprot

陈芸教授

陈芸,南京医科大学药学院教授,博士生导师,药学院副院长。2000年毕业于南京大学化学系,获得本科学位。2002年于南京大学获得分析化学硕士学位。2006年获得美国University of Minnesota生物分析化学博士学位。2006年-2008年于美国Charles River Laboratories担任项目负责人。2008年起受聘于南京医科大学。2016年在美国宾夕法尼亚大学做访问教授。主要研究方向为致力于发展以定向(靶向)蛋白质组学为基础的生物大分子检测分析方法,为建立标准化临床检测分析体系、筛选和验证疾病生物标志物以及进一步建立标准化疾病诊断-治疗-预后评估体系提供方法依据。科研方面,始终聚焦前沿,坚持创新,在相关领域(等)发表高水平论文多篇;截至目前,共发表SCI论文51篇,累计影响因子大于200;发表著作3篇。主持多项国家级、省部级、校级基金,包括1项国家自然科学优秀青年基金;申请国家专利多项,其中有两项专利获批,并有1项成功转化;另外有多项研究成果在多家企业和医院进行推广应用,并取得了良好的经济效益和社会效益。

田志新教授

2003年于中国科学院化学研究所获得化学博士学位。2004-2011年先后在美国明尼苏达大学和太平洋西北国家实验室从事合作研究。2011年被聘为中国科学院大连化学物理研究所研究员,高分辨质谱技术研究组组长。2013年被聘为同济大学化学化学科学与工程学院教授。目前主要研究领域是基于生物质谱的蛋白质组学与糖蛋白质组学。发明了生物质谱原位解析算法“同位素质荷比及轮廓指纹比对,iMEF”,并基于iMEF算法发展了完整蛋白质数据库搜索引擎ProteinGoggle、磷酸化修饰定位工具P-bracket、N-连接糖数据库搜索引擎GlySeeker、完整N-糖肽数据库搜索引擎GPSeeker;在这些高准确度生物信息学工具的支持下,基于质谱及联用技术开展疾病相关糖蛋白标志物的结构特异性发现和验证等研究工作。

杨海伦

2018年于上海理工大学获得化学学士学位,2018年-至今于同济大学化学科学与工程学院田志新教授课题组攻读博士学位。主要研究方向为基于位点和结构特异定量N-糖蛋白质组学的癌症以及癌症干细胞潜在糖蛋白标志物的发现和验证。

Phenomics期刊简介

Phenomics是一本新创的同行评审国际期刊,聚焦表型组学前沿研究,搭建全球表型组学领域专家交流的国际平台,推动该领域相关的理论创新和学科发展。

本期刊拥有强大的国际编委团队,复旦大学金力院士担任主编,美国系统生物学研究所Leroy Hood院士、澳大利亚莫道克大学Jeremy Nicholson院士、德国莱布尼兹环境医学研究所Jean Krutmann院士、复旦大学唐惠儒教授共同担任副主编,复旦大学丁琛教授担任执行主编,另有来自全球多国的三十多位著名科学家共同组成编委团队,以及四十多位青年科学家组成青年编委团队。

我们诚挚地邀请广大科研人员投稿! 

Phenomics官网:springer.com/journal/43

投稿链接:editorialmanager.com/pn

编辑部邮箱:phenomics@ihup.org.cn、phenomics@fudan.edu.cn

欢迎关注Phenomics官方公众号

文章来源:人类表型组计划公众号




https://blog.sciencenet.cn/blog-3558836-1387982.html

上一篇:Phenomics| 于玉国教授团队揭示人脑在聆听舒缓音乐时和做心算时呈现出截然不同的动态网络特征
下一篇:Phenomics| 超越孟德尔式遗传:遗传缓冲和表型多变性
收藏 IP: 220.248.61.*| 热度|

0

该博文允许注册用户评论 请点击登录 评论 (0 个评论)

数据加载中...

Archiver|手机版|科学网 ( 京ICP备07017567号-12 )

GMT+8, 2023-10-4 19:03

Powered by ScienceNet.cn

Copyright © 2007- 中国科学报社

返回顶部