该研究采用了大样本、多中心人群队列的回顾性研究方法，对肾上腺皮质癌（adrenocortical carcinoma, ACC）的疾病相关表观遗传学背景深入调查，发现肿瘤生物学过程中的可变剪接为ACC的致癌作用提供了研究的新视角。该研究利用数据挖掘和机器学习等方法在全基因组队列综合描述了预后相关的可变剪切模式谱，有助于全面了解可变剪切事件和调节子参与疾病进展和耐药的潜在机制，进而指导ACC患者预后模型和靶向可变剪切药物的开发和应用。

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https://link.springer.com/article/10.1007/s43657-021-00026-x

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研究背景

肾上腺皮质癌 (adrenocortical carcinoma, ACC) 是一种罕见的内分泌恶性肿瘤，每年每百万新发病例约为0.7-2例，占美国所有癌症死亡率的0.2%。ACC的早期诊断相对困难，因此大多数患者在初诊时已发生肿瘤转移，导致手术干预的机会很少，患者预后通常较差。手术通常是治疗ACC患者最有效的策略，对于无法手术干预的患者，通常使用米托坦，米托坦是FDA唯一批准用于治疗晚期ACC患者的主要药物。但是，这些治疗的生存获益仍然十分有限。

可变剪接 (alternative splicing, AS) 是一个转录后过程，其中前mRNA的不同外显子区域剪接在一起并去除内含子区域，从而由同一基因产生不同的mRNA转录本。越来越多的高通量测序技术和生物信息学研究发现，大约35-60%的全人类基因组发生AS变异，大约50%的人类基因具有多个转录本。AS事件有七种类型：可变受体位点（alternate acceptor site, AA）、可变供体位点（alternate donor site, AD）、可变启动子（alternate promotor, AP）、可变终止子（alternate terminator, AT）、外显子跳跃（exon skip, ES）、外显子互斥（mutually exclusive exons, ME）和内含子保留（retained intron, RI)。有趣的是，剪接因子 (splicing factor, SF) 的mRNA在不同的癌症中经常发生突变和异常表达，进而改变基因表达格局并促进肿瘤发生。因此，研究直接调节mRNA剪接相关通路并导致多种致癌剪接变化的特定SF至关重要，这些SF可能成为癌症治疗的候选靶点。

研究结果

本研究分四个阶段进行，系统分析的流程图如图1所示。

图1. 研究流程示意图

ACC中预后相关可变剪切模式的概述

图2A显示了七种不同类型的AS模式的示意图。在ACC队列中，质控后的76个ACC样本中发现14,074个基因中的23,984个AS事件，包括：2,013 AA events in 1,560 genes, 1,719 AD events in 1,313 genes, 4,257 AP events in 2,427 genes, 4,909 AT events in 2,819 genes, 9,201 ES events in 4,624 genes, 74 ME events in 72 genes, and 1,811 RI events in 1,259 genes（图2B）。以上结果表明ACC中可变剪切以ES为主要类型模式，约占所有AS事件的58%。如Upset交叉图所示，在单变量生存分析后，我们从23,984 个AS模式中总共收集了3,614个预后相关可变剪切事件和2,261个基因（图2C-E）。AA、AD、AP、AT、ES、ME、RI和所有类型的AS事件中前20个重要的预后相关可变剪切事件描述在气泡图中（图2F-L）。

图2.肾上腺皮质癌的预后相关可变剪切事件的识别和鉴定

预后相关可变剪切事件的生存分析和ROC构建

为了衡量每个AS相关风险评分对预后的影响，本研究对AA、AD、AP、AT、ES、ME、RI 和所有类型的AS事件组进行Kaplan-Meier分析。结果表明，八个组的AS事件发生与ACC患者的预后显著相关（P<0.001，图3）。ROC分析提示各个事件预测疾病发生风险的敏感度和特异度较高，各组的AUC值如下：AA的AUC = 0.927，AD = 0.992，AP = 0.859，AT = 0.797，ES = 0.921，ME = 0.817，RI = 0.944，All = 0.907。

图3. 肾上腺皮质癌中预后相关可变剪切事件生存分析和ROC构建

此外，本研究使用森林图构建了八组预后相关AS模式的单变量和多变量Cox分析模型（图4）。单变量 Cox 分析显示，八组的年龄 (ref. Low)、N 分期 (ref. N0)、M分期(ref. M0)和风险评分(ref. Low)是76名ACC患者的独立预后参数（p < 0.05）。多变量Cox分析表明，较差的总生存期（Overall survival, OS）与八组的风险评分（ref. Low）、AA、AD、AP、AT、ES、ME、RI 和所有 AS 组的 T 阶段（ref. T1-T2）显著相关 (p<0.05)。N 分期（ref. N0）与 AA、AT、ES、RI 和所有AS组的预后显著相关（p<0.05）。

图4. 肾上腺皮质癌中预后相关可变剪切事件的预后独立性检验

剪接因子（Splicing factor, SF）的交互网络构建和功能注释

经过筛选和鉴定，本研究共计发现参与ACC疾病进展相关的8个剪接因子，包括BAG2、CXorf56、DDX21、HSPB1、MBNL3、MSI1、RBMXL2、SEC31B，并被定义为，与ACC中AS模式调节密切相关的重要剪接因子。预后相关的AS模式和八个SF之间的相互作用网络显示在图5A中。蛋白-蛋白互作（Protein-protein interaction, PPI）中的重要节点、激活、磷酸化或与八个SF的抑制关系显示在Circos图中（图5B）。为了检测选定的SF是否可以调节预测的靶基因，本研究合成了DDX21特异性shRNA并在两种人源ACC细胞系中完成转染。结果表明，与正常对照组相比，sh-DDX21组中DDX21和靶基因（CNOT4、KDM51、NFATc3、PCBP2、Tcf3、SPRY1）在SW-13和NCI-H295R细胞中的表达水平显著降低（图5C）。GO、KEGG和Reactome等富集分析表明，SFs除了显著参与mRNA加工和RNA剪接等功能，还参与了组织内VEGF信号、MAPK信号、内质网蛋白质加工等特异性功能（图5D-F）。

图5. 肾上腺皮质癌中关键剪接因子的鉴定，交互网络构建和功能注释

DExD-box解旋酶21（DDX21）在ACC患者中的预后价值的鉴定

图6A展示了基于PSI值的八个SF和不同类型PASE的无监督聚类相关性分布。DDX21和BAG2显示出与可变剪切事件最强的相关性。接下来，本研究发现升高的DDX21表达与较差的总生存率（p<0.0001，HR=4.6，图6B）和疾病特异性生存率（p<0.0001，HR=4.3，图6C）显著相关。此外，DDX21的mRNA表达水平与高级别临床分期呈显著正相关（Spearman rho=0.283，p=0.0127），且DDX21表达峰值出现在 IV 期（图6D）。免疫组织化学结果表明，与正常肾上腺组织样本相比，ACC组织中DDX21表达显著上调（图6E）。GSEA 分析表明DDX21显著参与肿瘤细胞有丝分裂纺锤体形成（NES=0.183，NOM p=0.018，图6G ）。同时，根据差异DDX21表达组，我们绘制了top100具有正相关和负相关的基因（图6H）。此外，根据不同临床分期，AS事件频率的放大与DDX21表达水平之间的关联如图6I所示。

图6. 肾上腺皮质癌中DDX21的临床价值鉴定

来自复旦肿瘤中心（FUSCC）真实世界队列的ACC患者预后验证

为进一步提高本研究的临床价值，本研究纳入了39例ACC患者，对与标本匹配的生存和临床数据进行了随访和更新。研究结果表明，DDX21表达与ACC患者的侵袭性进展和不良预后显著相关（总生存期：p=0.005，HR=4.171；无疾病进展生存期：p=0.020，HR=2.781；图7A-B）。在确诊肿瘤组织内部发生病理性坏死的ACC样本中，DDX21高表达依然与ACC患者的侵袭性进展和不良预后显著相关（OS：p=0.011，HR=8.556；PFS：p=0.020，HR=4.748；图7C-D）。从公共数据到真实世界，多个队列研究结果表明，本研究鉴定的剪接因子，如DDX21，可以在ACC的疾病发生、进展中发挥重要作用，并可以作为潜在的临床预测和预后的生物标志物。

图 7. 来自 FUSCC 队列的 ACC 患者中 DDX21 的预后价值验证

研究结论

从数据挖掘到真实世界鉴定，本研究的严格实施标准确保了与肾上腺皮质癌发生发展极相关的多种预后相关可变剪切模式的全面筛选和识别。借助前期多组学和多重机器学习算法，本研究筛选出八个关键剪切因子，包括 BAG2、CXorf56、DDX21、HSPB1、MBNL3、MSI1、RBMXL2 和 SEC31B，作为肾上腺皮质癌mRNA剪接途径的基本调控元件。我们发现预后相关可变剪切模式不仅在检测可变剪切在肿瘤发生中的潜在机制方面发挥重要作用，还可充当新兴临床特征和治疗策略的靶点。此外，本研究基于大规模全基因组队列的可变剪切事件的系统概况，力求全面阐明肾上腺皮质癌的可变剪切格局和潜在致病机制，并为DDX21预测肾上腺皮质癌患者预后的潜力提供了宝贵的见解，进而指导肾上腺皮质癌患者靶向可变剪切药物的开发和应用。

复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科叶定伟教授、张海梁教授和瞿元元研究员为该论文的通讯作者。该研究得到了国家重点研发计划（No. 2019YFC1316000）、复旦大学上海医学院福庆学者科研项目（No. FQXZ202112B）、上海市自然科学基金（No. 20ZR14131000）和上海市卫生健康委协同创新集群项目（No. 2020CXJQ03）的资助。

Abstract

Alternative splicing (AS) in the tumor biological process has provided a novel perspective on carcinogenesis. However, the clinical significance of individual AS patterns of adrenocortical carcinoma (ACC) has been underestimated, and in-depth investigations are lacking. We selected 76 ACC samples from the Cancer Genome Atlas (TCGA) SpliceSeq and SpliceAid2 databases, and 39 ACC samples from Fudan University Shanghai Cancer Center (FUSCC). Prognosis-related AS events (PASEs) and survival analysis were evaluated based on prediction models constructed by machine-learning algorithm. In total, 23,984 AS events and 3,614 PASEs were detected in the patients with ACC. The predicted risk score of each patient suggested that eight PASEs groups were significantly correlated with the clinical outcomes of these patients (p < 0.001). Prognostic models produced AUC values of 0.907 in all PASEs’ groups. Eight splicing factors (SFs), including BAG2, CXorf56, DExD-Box Helicase 21 (DDX21), HSPB1, MBNL3, MSI1, RBMXL2, and SEC31B, were identified in regulatory networks of ACC. DDX21 was identified and validated as a novel clinical promoter and therapeutic target in 115 patients with ACC from TCGA and FUSCC cohorts. In conclusion, the strict standards used in this study ensured the systematic discovery of profiles of AS events using genome-wide cohorts. Our findings contribute to a comprehensive understanding of the landscape and underlying mechanism of AS, providing valuable insights into the potential usages of DDX21 for predicting prognosis for patients with ACC.

第一作者

艾合太木江·安外尔，男，2020年毕业于复旦大学上海医学院临床医学(5年制)专业，获得推荐免试资格，于同年9月在复旦大学附属肿瘤医院开始攻读泌尿外科硕士研究生，师从泌尿系统肿瘤学科专家张海梁教授，从事肾癌、膀胱癌、前列腺癌等泌尿系统肿瘤的基础及临床研究。以第一作者或共同第一作者发表SCI论著7篇，同时有7篇作为第一或者共同第一作者SCI论著在外审过程中。部分研究成果被欧洲泌尿外科年会（EAU2020）邀请口头汇报发言，被2020年中国临床肿瘤学大会（CSCO）和中国肿瘤学大会（CC0）收录为壁报交流和论文汇编。发明专利1项，同时申报了“一种用于前列腺癌预后的多基因检测试剂盒”的发明。此外申请人致力于泌尿系统肿瘤临床诊治工作，长期跟随导师张海梁教授参与门诊，累计诊治泌尿系统良恶性疾病3000余例，泌尿系统手术百余台。同时，申请人并参与国家重点研发计划重大专项、国家自然科学基金及上海市自然科学基金项目等多项研究课题。

第一作者

刘王睿，男，上海交通大学附属新华医院，硕士。主要研究方向包括系统肿瘤微环境的基础及临床研究。以第一作者或共同第一作者发表SCI论著17篇，部分研究成果被中国临床肿瘤学大会（CSCO）邀请口头汇报发言，发明专利2项，参与国家自然科学基金及上海市自然科学基金项目等多项研究课题。

复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科肾组亚专科团队

复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科创建于2002年，在创始人兼学科带头人叶定伟教授的带领下，目前已成为国内规模最大、影响力最强、辐射面最广的泌尿男生殖系肿瘤诊治和研究中心，是教育部平台肿瘤学重点建设发展学科，中国抗癌协会泌尿男生殖系统肿瘤专业委员会主任委员单位，中国临床肿瘤学会前列腺癌专家委员会主任委员单位，上海市泌尿肿瘤研究所和复旦大学前列腺肿瘤研究所挂靠和所长单位，国家卫健委全国县域医疗服务能力提升项目前列腺癌工作牵头单位，中国肿瘤医院泌尿肿瘤协作组(UCOG)牵头单位。团队愿景是以规范手术为基础，以MDT为特色，临床和科研共强，国际化水平高，国际领先的泌尿肿瘤诊治、预防、康复和研究中心，得到国际同行的广泛关注和认可。经过15年的长足建设，由叶定伟教授领衔的肾脏肿瘤亚团队已经成为本中心享誉国际的亚专科之一，团队包括正教授3名（叶定伟教授、张海梁教授、施国海教授），副教授1名（曹达龙副教授），下辖4个治疗组。

近三年来，本中心每年肾癌手术病例数939例，位列申康市级医院第二，门诊量11000余例，实现肾癌诊疗数量与质量双重“飞跃”。在复旦肿瘤治疗经验下，肾癌患者平均5年生存率77.1%，3年生存率达82.3%，位居国内领先水平。其中，早期肾癌术后的5年生存率达到93%、疗效与欧美国际顶尖的癌症中心旗鼓相当。对于晚期肾癌，团队充分整合泌尿外科、肿瘤内科、放疗科、核医学科、病理科和影像科中泌尿肿瘤顶尖专家，利用线上线下MDT平台，采取以规范手术为主，综合放疗、介入治疗、生物靶向和免疫治疗、新药以及新技术临床实验等多种手段，使晚期肾癌的5年生存率已达28%，高于国际水平的10-20%。此外，复旦肿瘤泌尿肿瘤团队参与制定《泌尿男生殖系统肿瘤多学科团队综合诊治组织与实施规范中国专家共识》、《中国晚期肾癌靶向治疗不良反应管理专家共识》，出版国内专著《肾癌家庭防治手册》，并且作为NCCN亚太共识编委会编委，参与NCCN肾癌亚太共识的制定。

国内近10年获批国家专利局实用新型专利、发明专利等数十项。近10年团队在Nature communications、Cancer Research、Clinical Cancer Research、J Immunother Cancer、Clinical and Translational Medicine、 Cancer Letters等权威期刊共发表肾癌领域SCI论文共计105篇，累计影响因子总计572.8分，国内核心期刊论文50余篇；获批国家专利局实用新型专利、发明专利等数十项；牵头泌尿肿瘤多中心临床研究总共98项，牵头泌尿肿瘤多中心临床研究总共98项，多项临床试验入组人数全球第一；成功通过美国FDA稽查，成为国内泌尿外科唯一。

Phenomics期刊简介

Phenomics是一本新创的同行评审国际期刊，聚焦表型组学前沿研究，搭建全球表型组学领域专家交流的国际平台，推动该领域相关的理论创新和学科发展。

本期刊拥有强大的国际编委团队，复旦大学金力院士担任主编，美国系统生物学研究所Leroy Hood院士、澳大利亚莫道克大学Jeremy Nicholson院士、德国莱布尼兹环境医学研究所Jean Krutmann院士、复旦大学唐惠儒教授共同担任副主编，复旦大学丁琛教授担任执行主编，另有来自全球多国的三十多位著名科学家共同组成编委团队，以及四十多位青年科学家组成青年编委团队。

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